基因編輯在血管外科中的應用進展

馬孝琛，許 鼎，張 恒，劉 鵬，馬鵬程，馮 睿，景在平，馮家烜

1 海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院血管外科，上海 200433

2 青島大學附屬醫(yī)院血管外科，山東 青島 266100

3 上海市第一人民醫(yī)院介入中心、血管外科，上海 201600

近年來，基因編輯技術是生物和醫(yī)療等諸多領域的研究熱點，也是21世紀的生命科學的前沿。得益于基因組測序技術的成熟和發(fā)展，人們對龐大而復雜的基因序列有了越來越準確、直觀的認識，這為基因編輯提供了必要的數(shù)據(jù)基礎。近年來，基因編輯方法的發(fā)展和完善使對基因組的調控和研究成為可能，并且為人類實現(xiàn)基因治療提供了新的途徑[1]。雖然到目前為止，多數(shù)疾病的基因治療仍然處于細胞和動物實驗層面，尚未進入臨床試驗階段，但是其實驗結果所展現(xiàn)出的臨床應用前景較為樂觀。本綜述主要對基因編輯進行總結并對其在血管外科中的應用提出初步設想和展望。

1 DNA 編輯

DNA 編輯是目前研究最多、涉及領域最廣的基因編輯類型，根據(jù)其可編程核酸酶的DNA 識別模式大致分為兩類：通過DNA-蛋白質相互作用實現(xiàn)特定的DNA 位點結合（如鋅指核酸酶、轉錄激活因子樣效應核酸酶和巨核酸酶）、通過RNA引導分子直接與特定靶向DNA序列堿基對結合（如Cas9）[2]。而Cas9由于其穩(wěn)定性和便捷性而受到人們關注，所以基于成簇規(guī)則間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced palindromic repeats，CRISPR）及其相關蛋白（Cas）系統(tǒng)的堿基編輯逐漸成為DNA 編輯的主要方法。CRISPR系統(tǒng)源自細菌獲得性免疫機制，40%的細菌和90%的古核生物擁有內(nèi)源性CRISPR機制，它使用小RNA通過堿基配對進行識別，并切割外源DNA元件，以序列特異性方式賦予對這些元件的遺傳抗性[3]。其中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)在宿主基因組內(nèi)的CRISPR之間整合入侵的DNA 序列，利用其整合DNA 的特性再經(jīng)過加工即可作為DNA 編輯的工具[4]。

堿基編輯以在目標靶位引發(fā)雙鏈DNA斷裂作為基因校正的第一步[2]，但這種方式仍然存在著許多的問題，如在斷裂的標靶雙鏈DNA上誘導大量的隨機插入和缺失[2,5]，效率較低，只能進行4種堿基轉換（C轉換為T、G轉換為A、A轉換為G、T轉換為C）而不能進行8種堿基轉換（C轉換為A、C轉換為G、G轉換為C、G轉換為T、A轉換為C、A轉換為T、T轉換為A、T轉換為A）等。在此基礎上，Anzalone等[6]發(fā)現(xiàn)了一種可以在不斷裂雙鏈DNA的基礎上進行DNA編輯的新方法——Prime編輯。該方法可以進行全部12種堿基的變換，并顯示出比同源定向修復（homologydirected repair，HDR）相似或較高的效率及較少的副產(chǎn)物，與其他堿基編輯相比具有互補的優(yōu)點，且在已知的Cas9脫靶位點，Prime編輯的脫靶編輯現(xiàn)象低于Cas9核酸酶。Prime編輯擴展了基因組編輯的范圍和能力，理論上可以糾正89%與人類疾病相關的已知遺傳變異[6-7]。應用上述方法，DNA編輯在血紅蛋白疾?。é?地中海貧血，鐮狀細胞病）、遺傳性眼?。↙eber 先天性黑蒙）、肌肉遺傳?。ǘ攀霞I養(yǎng)不良癥）、遺傳性肝?。ㄟz傳性酪氨酸血癥Ⅰ型，α-1抗胰蛋白酶缺乏癥）、先天性遺傳性肺?。倚岳w維化，遺傳性表面活性蛋白綜合征）和遺傳性耳聾等方面也有了良好的進展，一些基因編輯藥物已經(jīng)進入臨床試驗階段[8]。相關文獻表明，將CRISPR-Cas9編輯后的自體CD34+造血干細胞和祖細胞移植到骨髓清除后的輸血依賴性β-地中海貧血患者和鐮狀細胞病患者體內(nèi)，一段時間后均產(chǎn)生了較好的療效，這為單基因突變的血液疾病的基因治療提供了有力的證據(jù)[9]。即便如此，由于DNA 編輯是在基因層面上對DNA 序列進行根本性的改變，對于人體來說其安全性方面仍然存在著許多未知的隱患，而且在臨床試驗中還會有復雜的倫理問題，所以DNA 編輯在疾病的治療和臨床應用方面仍然面臨著較大的局限性。與DNA 編輯相比，RNA編輯的發(fā)現(xiàn)和研究則較好地解決了這一問題。

2 RNA 編輯

RNA編輯是在RNA水平上對目標RNA進行堿基的精準改變和修飾，其原理與DNA 編輯相似，但其最大的優(yōu)點在于對基因表達的調控是暫時性的，這就大大增加了其在臨床應用方面的安全性和可控性[10]。

自發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸（microRNA，miRNA）和小干擾核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）以來，定點靶向RNA的研究就進入了更加深入的探索階段，許多利用內(nèi)源性miRNA和siRNA機制來抑制基因表達的治療方式出現(xiàn)了[11-12]，但是RNA編輯仍然是一項前沿的新技術。目前研究表明，基于治療目的，在定點RNA編輯方面，有兩種類型的堿基轉換是較為有效且能夠直接改變密碼子并編碼RNA，即C轉換為U、A轉換為I[13]。A到I轉換需要作用于RNA的腺苷脫氨酶（adenosine deaminases acting on RNA，ADAR），在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)3種與編碼堿基轉換有關的酶，即ADAR1、ADAR2和ADAR3。其中ADAR1含量最多、分布最廣；ADAR2主要在神經(jīng)、血管和消化系統(tǒng)中表達；ADAR3是大腦特有的，但由于ADAR3不具有酶活性，所以認為ADAR3與其他ADAR酶競爭從而可以發(fā)揮調節(jié)RNA編輯的作用[14-15]。研究表明，ADAR1是重復位點的主要編輯器，ADAR2是非重復編碼位點的主要編輯器，而無催化活性的ADAR3主要充當編輯抑制劑[16]。C轉換為U也是由ADAR體外轉換的編碼[17]，由于編輯的酶與哺乳動物同源，這使得這兩種方式在編碼的過程中幾乎不會引發(fā)免疫反應。

近年來，隨著對CRISPR 相關系統(tǒng)的深入研究，發(fā)現(xiàn)了Ⅵ型CRISPR 核酸酶Cas13，它使得CRISP-Cas 系統(tǒng)的使用從DNA 靶向擴展到RNA 靶向[18-22]。CRISPR系統(tǒng)的靶向特異性由RNA 嵌合體和靶DNA 之間的堿基配對，以及Cas9蛋白與靶DNA 3'端常見的短DNA 基序[原型間隔區(qū)相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）]之間的結合決定，PAM 是CRISPR 機制識別的關鍵基序[3]。由于Cas13是RNA 的靶向，不需要PAM，這就使得其能夠融合的靶向空間幾乎沒有限制[10]，也使得CRISPR 系統(tǒng)的RNA 編輯靶向治療具有更加廣泛的應用前景。

目前RNA編輯已經(jīng)在動物實驗中取得了初步的良好結果。Zhou 等[23]的研究通過RNA靶向的CRISP系統(tǒng)CasRx將小鼠的星形膠質細胞轉化為有功能的神經(jīng)元細胞，這為神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ　⑴两鹕C合征等）的治療提供了新的方向。

3 基因編輯在循環(huán)系統(tǒng)疾病治療中的進展

由于因編輯技術的完善和進步，通過基因編輯技術治療遺傳性疾病的研究也在逐漸深入并取得了一定的成效。Zhao 等[24]動物實驗表明，在小鼠體內(nèi)腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）CRISPR-Cas 介導的Ldlr基因校正可以部分提高低密度脂蛋白受體的表達，有效改善Ldlr突變體的動脈粥樣硬化表型，為家族性高膽固醇血癥患者的治療提供了一種潛在的治療方法，而高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化等血管疾病的主要危險因素之一。

在循環(huán)系統(tǒng)相關遺傳疾病的方向上，基因編輯正在成為一顆冉冉升起的新星。研究表明，通過應用Cas對胚胎細胞進行DNA編輯，已經(jīng)在肥厚型心肌?。╤ypertrophic cardiomyopathy，HCM）[25]和馬方綜合征（Marfan syndrome，MFS）[26]等遺傳病的基因治療中取得了一定進展。

HCM是一種以左心室肥厚和心肌纖維紊亂為特征的心肌疾病，患病率為1 ∶500，臨床上常伴有心力衰竭表現(xiàn)[27]。已有研究表明，超過350個位點的肌球蛋白結合蛋白C3（myosin-binding protein C3，MYBPC3）基因突變與HCM有關，占所有HCM突變的40%～50%，使MYBPC3成為HCM中最常見的突變基因[28-29]。Ma等[25]使用CRISPRCas9在人類生殖細胞中成功修正了MYBPC3突變，純合野生型基因型比例修復比例達到66.7%，且在MⅡ期卵母細胞中注入CRISPR-Cas9比在受精卵中注入具有更有效的靶向作用，表明CRISPR-Cas9可用于消除人類胚胎中的致病突變，并且在胚胎發(fā)生過程中通過對Cas9注射時間的修改可顯著提高HDR效率。

MFS 是一種與多器官系統(tǒng)異常相關的遺傳性結締組織病，其引發(fā)的胸主動脈瘤和主動脈夾層是主要的致死病因，其最常由編碼的纖維蛋白-1（fibrillin-1，F(xiàn)BN1）基因的常染色體顯性突變引起[30]。Zeng 等[26]研究使用Cas9糾正了胚胎期MFS 致病突變基因FBN1T7498C，通過測序驗證了在雜合人類胚胎中成功實現(xiàn)了遺傳校正。這一實驗結果證明了通過堿基編輯在人類早期胚胎中糾正致病突變的安全性，并為MFS 提供了可能的治療方法。但對于發(fā)育成熟的MFS 患者的血管壁細胞（血管平滑肌細胞、成纖維細胞等）的基因編輯修復效應至今還沒有相關報道。

除了遺傳性疾病之外，由于高脂飲食和缺少運動的生活方式等原因所引起的肥胖，作為心血管疾病的重要危險因素之一，在基因編輯方面也有了一定的進展。Wang等[31]利用CRISPR編輯技術成功將人類白色脂肪組織轉化為高表達解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）基因的人類褐色脂肪樣細胞，并在被移植人類褐色脂肪樣細胞的小鼠中觀察到體內(nèi)的白色脂肪比例明顯更低、體重也更輕且均接近直接移植褐色脂肪細胞的小鼠。該實驗證明了使用CRISPR基因編輯技術改造人類白色脂肪細胞，使其顯示褐色脂肪樣細胞表型的實用性，為使用基因療法對抗肥胖癥等代謝性疾病提供了新的機會，也為心血管疾病的預防提供了新思路。

4 小結與展望

盡管基因編輯已取得較大進展，但是其存在的問題還是不容忽視。DNA 編輯中堿基編輯方法會引起DNA 雙鏈的斷裂從而引起大量堿基的錯配、插入、缺失等改變；Prime 編輯不會斷裂雙鏈，但卻有較高的脫靶效應，無法解決DNA 編輯后的安全問題，且引入CRISPR-Cas9會使機體發(fā)生免疫反應。對于許多先天性的遺傳病來說，只有在胚胎期進行DNA 編輯才有希望從根本上治療下一代的遺傳病，而這將面臨嚴峻的醫(yī)學倫理問題，且對于親代已經(jīng)存在的因遺傳病導致的組織器官的器質性病變作用較小，所以在將來的臨床應用場景和適用患者的選擇方面有較大困難。相比之下，RNA編輯盡管尚處于探索初期階段，也存在著一定脫靶效應和免疫反應等問題，但卻因其不改變基因結構，僅通過改變DNA 轉錄后產(chǎn)物RNA來對基因的表達進行調控，從而大大增加了基因治療的可調控性和安全性，而且已有動物實驗證明其在遺傳疾病治療方面的可行性，所以RNA編輯在基因治療中有著更廣闊的臨床應用前景。

盡管現(xiàn)在還沒有明確的研究將RNA編輯用于血管疾病的基因治療，但已有的發(fā)現(xiàn)表明，轉化生長因子-β信號級聯(lián)和編碼平滑肌收縮器的組成部分的基因突變與主動脈遺傳疾病密切相關[32]，這些位點的確定也為血管疾病的RNA編輯治療提供了新的有潛力的研究方向。