基于分子證據(jù)確認(rèn)秦嶺藤屬與駝峰藤屬(夾竹桃科)的系統(tǒng)位置

廖 苗， 曾思金， 唐光大,3*

( 1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院， 廣州 510642； 2. 中國科學(xué)院華南植物園 植物資源保護與可持續(xù)利用重點實驗室 廣東省數(shù)字植物園重點實驗室， 廣州 510650； 3. 韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院， 廣東 韶關(guān) 512005 )

夾竹桃科(Apocynaceae)在Angiosperm Phylogeny Group IV系統(tǒng)(APG IV)中與鉤吻科(Gelsemiaceae)、龍膽科(Gentianaceae)、馬錢科(Loganiaceae)和茜草科(Rubiaceae)共同屬于龍膽目(Gentianales)(Chase et al., 2016)，包含傳統(tǒng)界定的狹義夾竹桃科(Apocynaceaes.s.)和蘿藦科(Asclepiadaceae)兩大類群，約5 350種，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)(Endress et al., 2018)。夾竹桃科目前已建立了相對穩(wěn)定的分子演化系統(tǒng)(Fishbein et al., 2018)，一些修訂的屬作了歸并或位置調(diào)整，目前總屬數(shù)由422個(Endress & Bruyns， 2000)縮減到378個(Endress et al., 2018)。

白前屬(VincetoxicumWolf)隸屬于夾竹桃科馬利筋族(Asclepiadeae)娃兒藤亞族(Tylophorinae)，范圍變化較大(Endress et al., 2018)。傳統(tǒng)的白前屬通常莖直立，少數(shù)上部纏繞，須根簇生，花冠輻狀，有5個肉質(zhì)的副花冠裂片，乳汁透明(邱聲祥等，1989；Liede, 1996)。白前屬與鵝絨藤屬(CynanchumL.)具有相似的副花冠、合蕊柱、花粉器等特征，部分學(xué)者認(rèn)為白前屬應(yīng)歸并在鵝絨藤屬中(蔣英和李秉滔，1977；Forster, 1991；Li et al., 1995)，但有學(xué)者認(rèn)為白前屬應(yīng)作為獨立的屬(Markgraf, 1972；Ali & Khatoon, 1982)。邱聲祥等(1989)結(jié)合化學(xué)成分、形態(tài)、染色體數(shù)目和分布區(qū)等證據(jù)，提出白前屬應(yīng)從鵝絨藤屬中獨立出來，Liede(1996)基于形態(tài)與化學(xué)證據(jù)也支持該觀點，并認(rèn)為其與娃兒藤屬(TylophoraR. Br.)的關(guān)系最近。

然而，分子系統(tǒng)學(xué)研究顯示白前屬與鵝絨藤屬親緣關(guān)系較遠(Liede, 2001；Rapini et al., 2007)，支持白前屬與娃兒藤屬關(guān)系更近，但它們都是非單系的，而秦嶺藤屬(BiondiaSchltr.)、BlyttiaArn.、DiplostigmaK. Schum.、GoyderaLiede、PleurostelmaBaill.和RhyncharrhenaF. Muell.6個屬都嵌套在Vincetoxicum-Tylophora分支中(Liede-Schumann et al., 2012，2016)。娃兒藤屬和上述6個屬，以及形態(tài)上相近的一些屬均被歸并在白前屬中，增加了大量的新組合或新名稱(Kidyoo & Kidyoo, 2018；Liede-Schumann & Meve, 2018；Hsu et al., 2021；Shah et al., 2021)。原主要分布在中國的3個屬，即駝峰藤屬(MerrillanthusChun & Tsiang)、白水藤屬(PentastelmaTsiang & Li)和箭藥藤屬(BelostemmaWall. ex Wight)也歸并在白前屬中。新定義的白前屬有150多種，通常有透明乳汁；花小，花冠輻狀，少數(shù)鐘狀、壇狀、長圓錐狀；副花冠由肉質(zhì)分離的雄蕊上的裂片組成，或由合生的雄蕊和片狀的雄蕊間的部分組成環(huán)狀；花粉塊柄直立、水平或斜上，分布于熱帶、亞熱帶非洲、亞洲、歐亞大陸等區(qū)域(Endress et al., 2018)。

秦嶺藤屬約13種，是中國特有屬，分布于我國東部和西南部；駝峰藤屬僅有駝峰藤(MerrillanthushainanensisChun et Tsiang)1種，分布于我國的廣東、海南以及柬埔寨(蔣英和李秉滔，1977；Li et al., 1995)。在Liede-Schumann等(2012, 2016)的系統(tǒng)發(fā)育分析中，秦嶺藤屬包含2個種，即黑水藤(BiondiainsignisTsiang)和青龍?zhí)?[B.henryi(Warb. ex Schltr. et Diels) Tsiang et P. T. Li]的樣品，缺少屬的模式秦嶺藤(B.chinensisSchltr.)的樣品，同時缺乏駝峰藤屬的樣品。部分學(xué)者報道了秦嶺藤與駝峰藤的葉綠體基因組數(shù)據(jù)，并進行了簡易的系統(tǒng)發(fā)育分析，其中秦嶺藤顯示與Vincetoxicumrossicum(Kleopow) Barbar.是姐妹類群，但系統(tǒng)樹中僅包含白前屬1個種的數(shù)據(jù)(Rao et al., 2018)；駝峰藤則顯示與黑水藤是姐妹類群，但系統(tǒng)發(fā)育樹中的取樣太少(Xiong et al., 2019)，這2個種是否屬于白前屬，或?qū)儆诎浊皩倌膫€分支等問題依舊不清楚。

本研究收集了秦嶺藤與駝峰藤的數(shù)據(jù)，其中新增駝峰藤的分子測序，秦嶺藤的數(shù)據(jù)參考使用Rao等(2018)的測序結(jié)果，并結(jié)合白前屬其他物種的分子數(shù)據(jù)(Liede-Schumann et al., 2016)，開展了系統(tǒng)發(fā)育分析，擬進一步明確這2個屬的系統(tǒng)位置和歸屬。

1 材料與方法

1.1 類群取樣和分子序列數(shù)據(jù)來源

秦嶺藤(憑證標(biāo)本：ZJB-2017-152-1，保存于陜西師范大學(xué))數(shù)據(jù)來自Rao等(2018)中的淺層測序基因數(shù)據(jù)。對駝峰藤(憑證標(biāo)本：LHB-AP17，保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué))進行葉片取樣，經(jīng)硅膠干燥后，將樣品放入干冰中冷藏，快遞至北京諾禾致源生物有限公司武漢分公司進行基因組總DNA的提取、小片段文庫的建庫與測序。具體操作如下：首先，DNA經(jīng)檢測合格后，先隨機打斷為350 bp左右的文庫，再進行PE150雙端測序，得到原始數(shù)據(jù)(raw data)，經(jīng)質(zhì)控后得到最終的有效數(shù)據(jù)(clean data)10 Gb。然后，將秦嶺藤的已有淺層測序數(shù)據(jù)與本次測序的駝峰藤的數(shù)據(jù)用GetOrganelle 1.7(Jin et al., 2020)進行組裝，設(shè)置參數(shù)為默認(rèn)；使用Bandage 0.8(Wick et al., 2015)和Geneious Prime 2019(https://www.geneious.com/)對組裝得到的fastg文件進行可視化和序列提取，得到最終的秦嶺藤的核糖體基因組序列，以及駝峰藤的葉綠體基因組與核糖體基因組序列。最后，分別以無油樟[AmborellatrichopodaBaill.(AJ506156)]和羅布麻[ApocynumvenetumL. (MT313688)]的葉綠體基因組作參考，先利用Plastid Genome Annotator(PGA)(Qu et al., 2019)對駝峰藤的葉綠體基因組進行注釋，再根據(jù)log文檔在Geneious Prime 2019中作進一步的手動校正，得到葉綠體基因組的注釋信息；以AsclepiascoulteriA.Gray(JN665084)的核糖體基因組nrDNA連續(xù)片段(18S+ITS1+5.8S+ITS2+26S)和Vincetoxicumbiglandulosum(Endl.) Kuntze(LN880610)的核糖體基因序列片段(ETS)為參考，在Geneious Prime 2019中對秦嶺藤與駝峰藤的核糖體基因組進行注釋，并利用Excract選項提取出所需的核糖體基因序列片段與葉綠體基因序列片段，并將數(shù)據(jù)上傳至GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

基于已發(fā)表的娃兒藤亞族分子系統(tǒng)學(xué)研究數(shù)據(jù)(Liede-Schumann et al., 2016)，補充駝峰藤和秦嶺藤的DNA數(shù)據(jù)，選取鵝絨藤亞族(Cynanchinae)中的3個種為外類群，分別利用5個葉綠體基因序列片段(psbA-trnH、trnG、trnL、trnL-F、trnT-L)(137個種)、2個核糖體基因序列片段(ETS、ITS)(136個種)，以及二者的合并數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(139個種)。序列詳細(xì)信息見表1，樣品憑證標(biāo)本詳細(xì)信息見文獻Liede-Schumann等(2016)。部分樣品序列數(shù)據(jù)不全，相關(guān)序列矩陣中以缺失數(shù)據(jù)形式補齊。

1.2 序列比對和拼接

采用MAFFT軟件(Katoh & Standley, 2013)單獨對每個片段進行序列比對，多片段數(shù)據(jù)在Geneious Prime 2019中進行序列拼接，得到聯(lián)合矩陣數(shù)據(jù)。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

首先，利用IQ-TREE(Nguyen et al., 2015)基于最大似然法(maximum likelihood method, ML)對序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，IQ-TREE中ModelFinder按照BIC準(zhǔn)則(Bayesian Information Criterion, BIC)自動測試，并選擇出最佳替代模型，其中核糖體基因序列片段合并數(shù)據(jù)使用模型為TVM+F+R3、葉綠體基因序列片段合并數(shù)據(jù)使用模型為K3Pu+F+R3、核糖體與葉綠體基因序列片段合并數(shù)據(jù)使用模型為TVM+F+R3；然后，進行1 000次的SH-aLRT檢驗(Guindon et al., 2010)和超快自展值檢驗(ultrafast bootstrap approach, UFboot)(Minh et al., 2013)，每個分支含有SH-aLRT和UFboot 2個支持率，如果SH-aLRT≥80%且UFboot≥95%，則視為得到較好支持，其分支結(jié)果可信；最后，將所得系統(tǒng)樹在Figtree 1.4.2(Rambaut, 2012)中查看。

表 1 取樣物種和序列GenBank編號Table 1 List of taxa sampled and GenBank accession numbers of sequences

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

基于核糖體基因序列片段(ETS、ITS)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，娃兒藤亞族中白前屬是非單系的，PentatropisR. Br. ex Wight & Arn.嵌套在白前屬中，并與Vincetoxicumapiculatum+V.sylvaticum+V.tenuipedunculatum成姐妹分支，支持率分別為SH-aLRT=82.8%、UFboot=82%(82.8/82)(圖1)；基于葉綠體基因序列片段以及合并數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)樹都顯示娃兒藤亞族分為2個大分支，PentatropisR. Br. ex Wight & Arn.與白前屬呈姐妹關(guān)系，支持率分別為99.8/100、99.9/100(圖2，圖3)。

分支節(jié)點數(shù)據(jù)代表SH-aLRT和UFboot 2個支持率，SH-aLRT≥80%且UFboot≥95%，視為結(jié)果可信，分支的劃分參照Liede-Schumann 等(2016)。下同。Each branch assigned with SH-aLRT and UFboot supports, if SH-aLRT≥80% and UFboot≥95%, the result is considered to be credible, clade designations follow those of Liede-Schumann et al. (2016). The same below.圖 1 基于2個核糖體基因序列片段 (ETS、ITS) 構(gòu)建的娃兒藤亞族的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogeny tree of Tylophorinae constructed by two ribosomal gene sequence fragments (ETS, ITS)

圖 2 基于5個葉綠體基因序列片段(psbA-trnH、trnG、trnL、trnL-F、trnT-L)構(gòu)建的娃兒藤亞族的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogeny tree of Tylophorinae constructed by five plastid gene sequence fragments (psbA-trnH, trnG, trnL, trnL-F, trnT-L)

圖 3 基于5個葉綠體基因序列片段(psbA-trnH、trnG、trnL、trnL-F、trnT-L)和2個核糖體基因序列片段(ETS、ITS)構(gòu)建的娃兒藤亞族的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogeny tree of Tylophorinae constructed by five plastid gene sequence fragments (psbA-trnH, trnG, trnL, trnL-F, trnT-L) and two ribosomal gene sequence fragments (ETS, ITS)

3組分子矩陣數(shù)據(jù)所建系統(tǒng)樹都高度支持駝峰藤屬與V.cissoides(Tylophoracissoides)和V.philippicum(T.parviflora)聚為一支，圖1、圖2、圖3中支持率分別為100/100、97.9/100、100/100；秦嶺藤屬中的3個種均嵌套在白前屬分支中，但在系統(tǒng)樹中非單系，其中在基于核糖體基因序列片段(ETS、ITS)所建的系統(tǒng)樹與合并數(shù)據(jù)所建的系統(tǒng)樹中，秦嶺藤與青龍?zhí)賄.henryi(Biondiahenryi)互為姐妹類群，支持率分別為97.7/100、97.8/100(圖1，圖3)，并與V.kawaroense(T.japonica)聚為一支，支持率分別為97.1/100、97.8/100，在基于葉綠體基因序列片段構(gòu)建的系統(tǒng)樹中，秦嶺藤與青龍?zhí)倬蹫橐恢?，但支持率較低(31.3/67)(圖2)，而黑水藤在3組系統(tǒng)樹中均顯示在亞熱帶分支(Subtropical Clade)中(圖1、圖2、圖3中支持率分別為100/100、93.8/100、100/100)，并與V.villosum(T.villosa)聚為一支(圖1、圖2、圖3中支持率分別為74.3/100、0/96、72.6/100)。

3 討論與結(jié)論

3.1 秦嶺藤屬的系統(tǒng)發(fā)育與屬級分類地位

在秦嶺藤屬建立時，Schlechter(1905)指出其花粉塊下垂，與牛奶菜屬(MarsdeniaR. Br.)的直立花粉塊存在明顯差異；花冠壇狀或近鐘狀，與娃兒藤屬的花冠5深裂、輻狀或廣輻狀有別，并認(rèn)為秦嶺藤屬應(yīng)放在馬利筋亞族(Asclepiadinae)中。Gilbert等(1995)認(rèn)為秦嶺藤屬的特點是葉狹窄，葉正面具有微小的蒼白點，花小，花冠縮小，通常呈環(huán)狀，花冠管多數(shù)較發(fā)達，并觀察到娃兒藤屬的一些種也有相似的蒼白點，說明秦嶺藤屬與娃兒藤屬形態(tài)性狀存在交叉現(xiàn)象。娃兒藤屬已被歸并至白前屬中(Liede-Schumann et al., 2012；Liede-Schumann & Meve, 2018；Endress et al., 2018)，本研究的分子系統(tǒng)結(jié)果支持秦嶺藤屬歸并入白前屬的分類處理。

本研究分子系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，秦嶺藤屬的3個種都在白前屬內(nèi)，其中秦嶺藤與青龍?zhí)倬蹫橐恢В谒倥cV.villosum(T.villosa)聚為一支，并在亞熱帶分支中，但它們在形態(tài)上差異較大，黑水藤的枝、葉柄均被單列短柔毛，葉線狀披針形，除葉面中脈被微毛外，無毛，花冠近鐘狀，無毛，而V.villosum的枝、葉柄均密被柔毛，葉卵形或卵狀長圓形，兩面具毛，花冠輻狀，具長柔毛；地理分布方面，前者分布于我國貴州、湖南、四川、西藏和云南(Li et al., 1995)，后者分布于爪哇島(Backer & Bakhuizen, 1965)。有關(guān)黑水藤與近緣種在形態(tài)和地理分布上差異較大，但親緣關(guān)系較近的情況尚需進一步采集更多樣品開展深入探究。

3.2 駝峰藤屬的系統(tǒng)位置與屬級分類地位

駝峰藤屬在發(fā)表時被認(rèn)為與徐長卿屬(PycnostelmaBunge ex Decne.)最相近(Chun & Tsiang, 1941)，后者現(xiàn)已被歸并至白前屬中(Liede-Schumann & Meve, 2018)，兩者的副花冠都貼生于雄蕊，它們在生活型、副花冠裂片的形狀、花冠裂片生長樣式和果實形狀大小等方面存在明顯區(qū)別，其中駝峰藤屬為木質(zhì)藤本，副花冠裂片背部隆起，基部增厚，花冠裂片連生，未開花時裂片頂端向內(nèi)連生，蓇葖果單生，紡錘形，大型；而徐長卿屬為直立草本，副花冠向先端加厚，花冠深裂，果實披針形，較小(Chun & Tsiang, 1941)；駝峰藤屬的花冠裂片與醉魂藤屬(HeterostemmaWight & Arn.)和球蘭屬(HoyaR. Br.)類似，其膜質(zhì)心形葉片與夜來香屬(TelosmaCoville)相似，駝峰藤屬的花粉塊下垂，另3個屬的花粉塊直立，可以明顯區(qū)分(Chun & Tsiang，1941)。蔣英和李秉滔(1977)發(fā)現(xiàn)駝峰藤屬與印度產(chǎn)的原IphisiaWight & Arn=VincetoxicumWolf較相近，不同之處在于駝峰藤屬的花冠裂片端部未開放時互相粘合，花粉塊柄斜行上升，且花粉塊完全倒垂，而Iphisia的花粉塊柄先橫平，次上升，后斜下。駝峰藤屬的花部結(jié)構(gòu)與宜昌娃兒藤 [T.augustiniana(Hemsl.) Craib=V.augustinianum(Hemsl.) Meve & Liede]十分相似，但駝峰藤屬的花更大。此外，由于駝峰藤屬的蓇葖果大(長9～12 cm，直徑3.5～4 cm)，有較厚的纖維狀中果皮，而娃兒藤屬通常果皮薄，具有紙質(zhì)的蓇葖果壁，因此駝峰藤屬被保留為獨立的屬(Gilbert et al., 1995)。本研究未收集到宜昌娃兒藤的數(shù)據(jù)，但研究結(jié)果顯示駝峰藤屬與其他2個娃兒藤屬V.cissoides(T.cissoides)和V.philippicum(T.parviflora)聚為一支，這2個種果實均較大(前者長10～12 cm，直徑3～5 cm；后者長13～15 cm，直徑3～4 cm)，葉大小與葉形與駝峰藤屬很相似；地理分布上，V.cissoides廣泛分布于印度尼西亞東部和新幾內(nèi)亞(Forster, 1994)，V.philippicum僅分布于菲律賓(Meve et al., 2002)，而駝峰藤屬分布于我國的廣東、海南以及柬埔寨(Li et al., 1995)。因此，僅憑果實大小、花粉塊柄的生長方式、葉子的形狀與大小作為娃兒藤亞族內(nèi)屬的鑒別特征可能并不夠充分，但這些特征可作為白前屬內(nèi)種間的鑒別特征。依據(jù)花粉塊下垂的特征，駝峰藤屬在最初建立時被置于馬利筋族馬利筋亞族中(Chun & Tsiang, 1941)，自Endress和Bruyns(2000)合并夾竹桃科與蘿藦科后，該屬也被置于馬利筋族中，但先后被置于鵝絨藤亞族(Endress et al., 2007)和娃兒藤亞族中(Endress et al., 2014；Endress et al., 2018)。本研究支持當(dāng)前駝峰藤屬歸并至白前屬，并放置在娃兒藤亞族中。

3.3 白前屬的系統(tǒng)發(fā)育

雖然基于核糖體基因序列和葉綠體基因序列合并數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示白前屬為單系，但其含有的信息位點依舊較少，白前屬屬內(nèi)的種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系支持率較低?；诟咄繙y序的系統(tǒng)發(fā)育分析將更清晰地重建白前屬的系統(tǒng)發(fā)育分支關(guān)系。由于白前屬的分類變動較大，因此非常有必要基于基因組學(xué)研究結(jié)果與形態(tài)特征分析進行全面的分類學(xué)修訂。

致謝承蒙廣東中山樹木園廖浩斌老師在樣品采集上提供幫助，陜西師范大學(xué)鄒嘉賓老師提供分子數(shù)據(jù)，以及武漢植物園張彩飛老師協(xié)助數(shù)據(jù)獲取，特此致謝。