凈多樣化速率和進(jìn)化時(shí)間對虎耳草目科間物種多樣性差異的影響

顧嘉豪， 張粒毫， 張皓昱， 仵天晴， 黃林青， 程瑞靜，2， 徐 瑩，2， 王慶剛， 徐曉婷，2*

( 1. 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610065； 2. 四川大學(xué) 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065； 3. 四川大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院， 成都 610065； 4. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 北京 100083 )

生物類群之間的物種總數(shù)的差異是自然界中普遍存在的現(xiàn)象，但是這一現(xiàn)象的形成機(jī)制仍然是未解之謎(Ricklefs & Renner，1994; Barraclough & Savolainen, 2010; Rabosky, 2010; Wiens, 2011; Robosky & Adams, 2012; Mereau & Bell, 2013; Machac, 2020; Li & Wiens, 2019)。從生物類群的宏觀進(jìn)化角度來看，進(jìn)化時(shí)間假說(time-for speciation hypothesis)和多樣化速率假說(diversification rate hypothesis)是解釋類群間物種多樣性差異的兩個(gè)最為核心的假說(Scholl & Wiens, 2016; Li & Wiens, 2019)。進(jìn)化時(shí)間假說認(rèn)為，進(jìn)化時(shí)間越長，物種能積累的物種多樣性越高，因此進(jìn)化的時(shí)間差異是導(dǎo)致類群間物種多樣性差異的主要原因。換句話說，一個(gè)起源古老的類群，比新近起源的類群擁有更長的進(jìn)化時(shí)間，因此可以積累更多的物種。多樣化速率假說認(rèn)為，在生物演化歷史中，不同類群種化速率和滅絕速率的動(dòng)態(tài)變化導(dǎo)致的凈多樣化速率差異是引起物種多樣性變化的主要原因(Scholl & Wiens, 2016)。也就是說，物種形成速率高而滅絕速率低的類群具有更高的凈多樣化速率，因此具有更多的物種。

目前，進(jìn)化時(shí)間假說和多樣化速率假說在物種多樣性形成中的相對作用還存在很多爭議(Marin et al.,2018)。進(jìn)化時(shí)間假說成立的前提是演化過程中凈多樣化速率在不同類群之間無差異或差異極小。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，凈多樣化速率在不同類群之間有差異。特別是經(jīng)歷過大型滅絕事件的類群，物種數(shù)目會(huì)驟然下降，從而導(dǎo)致物種多樣性的突然喪失，物種數(shù)目減少。例如，Rabosky 等(2012)對多細(xì)胞真核生物1 397個(gè)主要分支的研究發(fā)現(xiàn)，分支的分化時(shí)間，即干齡(stem age)，與分支所包含的物種數(shù)之間沒有顯著關(guān)系，因而否定了進(jìn)化時(shí)間假說。Pyron和Wiens (2013)發(fā)現(xiàn)，許多古老兩棲動(dòng)物分支具有較低的物種多樣性，但是一些年輕的分支具有較多的物種。但是該研究并沒有直接驗(yàn)證物種多樣性與多樣化速率之間的關(guān)系。而McPeek和Brown (2007)對不同動(dòng)物類群物種多樣性的研究卻發(fā)現(xiàn)分支年齡是物種多樣性的決定因素。Marin和Hedges (2016)對不同類群的冠齡(crown age)與物種豐富度關(guān)系的研究也表明兩棲動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物的物種豐富度與其最近共同祖先的年齡(age)顯著正相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證進(jìn)化時(shí)間和多樣化速率假說，Scholl和Wiens (2016)使用生命之樹(tree of life)對不同生物類群不同分類學(xué)等級的物種多樣性的差異進(jìn)行了研究。研究中發(fā)現(xiàn)，在不同的分類等級，例如，門、目和科等，物種多樣性主要是由多樣化速率決定，而與進(jìn)化時(shí)間無顯著相關(guān)關(guān)系，甚至出現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。古老的類群物種多樣化速率低，而年輕類群的多樣化速率高可能是導(dǎo)致該現(xiàn)象的主要原因。并且，進(jìn)化時(shí)間與物種多樣化速率的關(guān)系在不同分類等級和不同的生物類群中的差異可能導(dǎo)致不顯著的物種多樣化速率與物種多樣性的關(guān)系。綜上，進(jìn)化時(shí)間假說和多樣化速率假說在物種多樣性形成中的作用仍然存在爭議。

虎耳草目(Saxifragales)包含了15個(gè)科的共約3 000個(gè)種，包括了喬木、灌木、多年生或一年生草本植物、多肉植物和水生植物等多種生活型，廣泛分布于全球不同的生態(tài)系統(tǒng)中(Soltis et al., 2013)?；⒍菽績?nèi)部科的分化時(shí)間從早白堊紀(jì)晚期至第三紀(jì)早期，且科內(nèi)物種數(shù)目存在巨大差異，最大的景天科(Crassulaceae)包含了大約1 600個(gè)種，而鎖陽科(Cynomoriaceae)和四心木科(Tetracarpaeaceae)、隱瓣藤科(Aphanopetalaceae)卻只有不到10個(gè)物種。同時(shí)，虎耳草目的分子系統(tǒng)學(xué)研究基礎(chǔ)扎實(shí)，基于301個(gè)核基因建立的系統(tǒng)發(fā)育骨架，確定了各科之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分化時(shí)間(Folk et al., 2019)。Folk 等 (2019)還結(jié)合小片段構(gòu)建了種級水平的系統(tǒng)發(fā)育樹，物種覆蓋率達(dá)當(dāng)時(shí)公認(rèn)物種的70%以上，為準(zhǔn)確估計(jì)物種的多樣化速率奠定了基礎(chǔ)。因此，虎耳草目是研究科間物種豐富度差異、驗(yàn)證進(jìn)化時(shí)間和多樣化速率假說的理想類群。本研究采用系統(tǒng)發(fā)育廣義最小二乘模型(phylogenetic generalized least squares，PGLS)分析了虎耳草目科的物種多樣性與科的冠齡、干齡和多樣化速率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了物種多樣性與多樣化速率有顯著的正相關(guān)關(guān)系，與進(jìn)化時(shí)間沒有顯著關(guān)系，且進(jìn)化時(shí)間與多樣化速率的綜合效應(yīng)對這種物種豐富度差異有更強(qiáng)的解釋性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了多樣化速率在虎耳草目物種多樣性形成中的重要作用，支持了物種多樣性格局的多樣化速率假說，同時(shí)也支持了進(jìn)化時(shí)間和多樣化速率的綜合效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 虎耳草目系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究采用的系統(tǒng)發(fā)育樹主要基于Folk等(2019)發(fā)表的虎耳草目的系統(tǒng)發(fā)育樹和徐瑩等(2021)構(gòu)建的虎耳草屬的系統(tǒng)發(fā)育樹。Folk等(2019)首先基于來自627個(gè)物種的301 個(gè)核基因序列，構(gòu)建了虎耳草目主要分支的系統(tǒng)發(fā)育樹并通過化石和分子鐘定年確定了主要分支的分化時(shí)間。之后，基于GenBank中下載虎耳草目的核基因ITS片段和葉綠體基因組的matK等24個(gè)基因片段，建立了包含15個(gè)科1 455個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹。徐瑩等(2021)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹包含了353個(gè)虎耳草屬的物種，涵蓋了Folk等(2019)構(gòu)建的虎耳草目系統(tǒng)發(fā)育樹中的所有虎耳草屬物種，虎耳草屬的分化時(shí)間也與Folk等(2019)一致。因此，本研究將兩棵系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行整合，在R語言中將徐瑩等(2021)構(gòu)建的虎耳草屬系統(tǒng)發(fā)育樹替換了Folk等(2019)虎耳草目系統(tǒng)發(fā)育樹中虎耳草屬分支(Gordon, 1986；Bininda-Emonds, 2004)，最終整合得到了一棵包含1 539個(gè)種的虎耳草目系統(tǒng)發(fā)育樹，涵蓋虎耳草目下全部15個(gè)科，并且各科均具有較高覆蓋率(表1) 。

表 1 虎耳草目15個(gè)科有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Relevant data statistics of 15 families of order Saxifragales

1.2 科的物種多樣性

科的物種多樣性數(shù)目按照生物物種名錄數(shù)據(jù)庫(COL，https://www.catalogueoflife.org/，訪問時(shí)間：2021年5月)中每個(gè)科接受的物種名稱進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，變種和亞種等種下等級不統(tǒng)計(jì)，雜種不統(tǒng)計(jì)。由于物種多樣性數(shù)目不符合正態(tài)分布，參考Rabosky 等(2012)的分析方法對科的物種多樣性進(jìn)行了以10為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換以改善擬合效果。

1.3 科的干齡和冠齡計(jì)算

冠齡與干齡是針對系統(tǒng)發(fā)育樹中分支年齡的兩個(gè)不同的概念(圖1)。前者代表該類群現(xiàn)存物種最近共同祖先的年齡，而后者代表該類群最近共同祖先與其姊妹類群的最近共同祖先的年齡。有學(xué)者研究認(rèn)為在取樣較好的情況下，冠齡用來做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析更為合理，因?yàn)楣邶g可以消除由于進(jìn)化停滯或者滅絕事件導(dǎo)致的長枝的影響(Stadler et al., 2014; Sanchez-Reyes et al., 2017)。為了更加全面充分地評估進(jìn)化時(shí)間與物種豐富度的關(guān)系，本研究同時(shí)分析了各個(gè)科干齡以及冠齡與其物種多樣性的關(guān)系。

圖 1 干齡和冠齡的示意圖(單位:百萬年)Fig. 1 Schematic diagram of stem age and crown age (Unit: Myr)

為了提取不同科的冠齡和干齡，本研究利用R語言ape程輯包(Paradis & Schliep, 2019；R Core Team, 2021)中g(shù)etMRCA()函數(shù)從系統(tǒng)發(fā)育樹上找到每個(gè)科內(nèi)的物種對應(yīng)的共同祖先的節(jié)點(diǎn)，該節(jié)點(diǎn)的年齡即為該科的冠齡，該節(jié)點(diǎn)的父節(jié)點(diǎn)即為該科的干齡?；⒍菽扛鱾€(gè)節(jié)點(diǎn)的年齡使用R 程序中的ape程輯包中的branching.times ( )函數(shù)提取。各個(gè)科的冠齡節(jié)點(diǎn)的編號使用ape程輯包中的getMRCA()函數(shù)提取。根據(jù)每個(gè)科的冠齡節(jié)點(diǎn)和干齡節(jié)點(diǎn)編號(nodelable)，分別獲取到15個(gè)科的冠齡和干齡。

1.4 科的多樣化速率

本研究利用宏觀進(jìn)化貝葉斯分析法(Bayesian analysis of macroevolutionary mixtures， BAMM)，使用R語言中的程輯包BAMMtools獲取科的多樣化速率(Rabosky et al., 2014)。馬爾可夫鏈蒙特卡洛(Markov chain Monte Carlo，MCMC)運(yùn)行長度為1 000萬代，每1 000代取樣一次。運(yùn)行結(jié)束后，在R語言中使用程輯包c(diǎn)oda檢查鏈的收斂性和有效樣本(effective sampling sizes， ESS)的大小。ESS檢查結(jié)果大于200，說明MCMC過程有足夠的獨(dú)立樣本，估計(jì)的結(jié)果比較穩(wěn)定。

虎耳草目15個(gè)科的物種多樣化速率使用BAMMtools程輯包的getCladeRates( )函數(shù)提取。該方法提取了科內(nèi)所有分支的枝長加權(quán)平均的種化速率(speciation rate)和滅絕速率(extinction rate)。凈多樣化速率等于種化速率與滅絕速率的差值。由于滅絕速率的估計(jì)存在較大的不確定性，本研究中同時(shí)分析了種化速率和凈多樣化速率與物種多樣性的關(guān)系。

此外，根據(jù)各個(gè)科是否為溫帶適應(yīng)類群，利用ape程輯包中的drop.tip()函數(shù)將虎耳草目系統(tǒng)發(fā)育樹拆分為兩部分，即溫帶適應(yīng)類群和常綠喬木類群[常綠喬木類群為圍盤樹科(Peridiscaceae)、虎皮楠科(Daphniphyllaceae)、鼠刺科(Iteaceae)和蕈樹科(Altingiaceae)；虎耳草目下其余11個(gè)科為溫帶適應(yīng)類群]，利用BAMMtools程輯包中的plot.bammdata()函數(shù)繪制出凈多樣化速率隨時(shí)間的變化圖像。

1.5 物種多樣性與多樣化速率和進(jìn)化時(shí)間的關(guān)系

本研究使用一元線性回歸模型(linear regression model，LM)和系統(tǒng)發(fā)育廣義最小二乘模型(PGLS)對物種豐富度與多樣化速率和進(jìn)化時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行了分析。為驗(yàn)證多樣化速率假說，本文同時(shí)建立了種化速率和凈多樣化速率與物種多樣性的一元線性回歸模型和PGLS模型。同時(shí)，也分別建立了冠齡和干齡與物種多樣性的一元線性回歸關(guān)系和PGLS模型來驗(yàn)證進(jìn)化時(shí)間假說。由于多樣化速率和進(jìn)化時(shí)間可能同時(shí)對物種多樣性造成影響，因此，本研究也考慮了多樣化速率和進(jìn)化時(shí)間的交互效應(yīng)對物種多樣性的影響。交互效應(yīng)中，進(jìn)化時(shí)間由冠齡來代表。LM使用R語言中的基礎(chǔ)函數(shù)lm ( )完成。PGLS使用R程輯包中的 nlme的gls()函數(shù)完成。PGLS分析中使用了一個(gè)虎耳草目的科級系統(tǒng)發(fā)育樹。該系統(tǒng)發(fā)育樹是使用R語言的ape程輯包中的drop.tip()函數(shù)將物種數(shù)目超過1個(gè)的科中的物種進(jìn)行去除，保證每個(gè)科只有1個(gè)代表物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎耳草目科的干齡和冠齡與物種豐富度的關(guān)系

虎耳草目15個(gè)科的干齡和冠齡變化范圍差異很大。最年輕的連香樹科(Cercidiphyllaceae)冠齡僅為3百萬年(Myr)，而最古老的圍盤樹科的冠齡則超過了8千萬年(表1)。這充分體現(xiàn)了虎耳草目內(nèi)部不同科在進(jìn)化時(shí)間尺度上的差異性(表1)。

LM分析的結(jié)果表明冠齡對物種豐富度的解釋率可達(dá)到0.261，但是干齡對物種豐富度的解釋率只有0.164(圖2)。PGLS分析的結(jié)果與LM一致，冠齡與物種豐富度的斜率為0.015，略低于干齡與物種豐富度的斜率(β=0.019)。但無論是冠齡還是干齡對物種豐富度的影響都不顯著(P>0.05)。該結(jié)果說明虎耳草目內(nèi)15個(gè)科的物種豐富度與科的冠齡和干齡沒有顯著相關(guān)性，進(jìn)化時(shí)間并不是影響科之間的物種多樣性差異的主要因素。

圖中右下角為LM模型的解釋率(R2)和顯著性檢驗(yàn)的P值。The lower right corner are the LM model’s explanatory rate (R2) and P value of significance test.圖 2 虎兒草目15個(gè)科的冠齡與物種豐富度(A)及干齡與物種豐富度(B)的系統(tǒng)發(fā)育廣義最小二乘模型(PGLS)與線性回歸模型(LM)擬合Fig. 2 Phylogenetic generalized least squares (PGLS) and linear regression model (LM) for crown age and species richness (A) and stem age and species richness (B) of 15 families of order Saxifragales

2.2 虎耳草目科的物種多樣化速率與物種豐富度的關(guān)系

虎耳草目凈多樣化速率較高的科以溫帶和高山類群為主，集中在虎耳草目中以草本植物為主的草本分支中，例如茶藨子科(Grossulariaceae)、小二仙草科(Haloragaceae)和景天科等科的種化速率和凈多樣化速率都比較高(表1，圖3)，并且以1 500萬年以來增長較為明顯(圖3，圖4)。物種主要為常綠喬木的科的種化速率和凈多樣化速率相對較低 (表1，圖3， 圖4)。

綠色標(biāo)注的科是常綠喬木類群。The families shown in green are evergreen trees.圖 3 虎耳草目凈多樣化速率-時(shí)間圖Fig. 3 Net diversification rate-time map of order Saxifragales

圖 4 虎耳草目中常綠喬木和溫帶適應(yīng)類群隨時(shí)間的凈多樣化速率變化曲線Fig. 4 Net diversification rate curves over time for evergreen trees and temperate adaptive taxonomic groups of order Saxifragales

LM和PGLS分析發(fā)現(xiàn)，虎耳草目科的種化速率和凈多樣化速率都與物種豐富度正相關(guān)(圖5)。但種化速率與物種豐富度的關(guān)系在LM中顯著(R2=0.280，β=7.319，P<0.05)，而在PGLS模型中接近顯著(β=6.425，P<0.05)，而這兩種方法發(fā)現(xiàn)凈多樣化速率與物種豐富度均有顯著正相關(guān)性(PGLS:β=9.790，P=0.031；LM:R2=0.380，β=11.791，P<0.05)。

陰影代表LM模型的95%的置信區(qū)間。圖中右下角為LM模型的解釋率(R2)和顯著性檢驗(yàn)的P值。下同。The shadow represents 95% confidence interval of the LM model. In the lower right corner are the LM model’s explanatory rate (R2) and P value of significance test. The same below.圖 5 虎兒草目15個(gè)科的種化速率(A)和凈多樣化速率(B)與物種豐富度的系統(tǒng)發(fā)育廣義最小二乘模型(PGLS)與線性回歸模型(LM)擬合Fig. 5 Phylogenetic generalized least squares model (PGLS) and linear regression model (LM) fitted speciation rates (A) and net diversification rate (B) with the species richness of 15 families of order Saxifragales

2.3 進(jìn)化時(shí)間與凈多樣化速率的綜合效應(yīng)與科物種豐富度的關(guān)系

進(jìn)化時(shí)間與凈多樣化速率對物種豐富度的共同作用在LM和PGLS模型中都顯著(LM:R2=0.603，β=0.297，P<0.05；PGLS:β=0.287，P<0.05) (圖6)。LM模型中，進(jìn)化時(shí)間和凈多樣化速率的共同作用解釋了物種多樣性變化的60.3%，PGLS模型的斜率也比單獨(dú)使用進(jìn)化時(shí)間和凈多樣化速率高。該結(jié)果支持了進(jìn)化時(shí)間與凈多樣化速率的綜合效應(yīng)對于虎耳草目科間物種豐富度差異的影響，且比凈多樣化速率這一單一變量對其的影響解釋率更高。

圖 6 虎兒草目15個(gè)科進(jìn)化時(shí)間和凈多樣化速率的綜合效應(yīng)與物種豐富度的系統(tǒng)發(fā)育廣義最小二乘模型(PGLS)與線性回歸模型(LM)擬合Fig. 6 Phylogenetic generalized least squares model (PGLS) and linear regression model (LM) fitted the interaction effects of evolutionary time and net diversification rate with the species richness of 15 families of order Saxifragales

3 討論與結(jié)論

在本研究中，PGLS 分析發(fā)現(xiàn)虎耳草目下15個(gè)科的物種多樣性與凈多樣化速率呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，但是與科的冠齡正相關(guān)關(guān)系不顯著。LM中，凈多樣化速率對物種豐富度的解釋率達(dá)0.380。由于 Scholl和Wiens (2016)發(fā)現(xiàn)凈多樣化速率與年齡的交互作用可能是導(dǎo)致物種多樣性差異的原因，因此本研究也檢驗(yàn)了物種凈多樣化速率與冠齡的交互作用，并發(fā)現(xiàn)交互作用對物種豐富度的解釋率達(dá)到0.603。因此，本研究認(rèn)為凈多樣化速率的差異是主導(dǎo)物種多樣性差異的主要因素，進(jìn)化時(shí)間與多樣化速率的共同作用在虎耳草目物種多樣性差異中起到了次要作用。

本研究的結(jié)果不支持進(jìn)化時(shí)間假說，這與Rabosky等(2012)和Scholl和Wiens (2016)得到的結(jié)論一致，即不同類群間物種豐富度的差異并非是由進(jìn)化時(shí)間的差異引起。盡管Pyron和Wiens (2013)研究發(fā)現(xiàn)熱帶兩棲類物種類群之間的物種多樣性差異與冠齡有顯著的正相關(guān)關(guān)系，但是在該研究中也同時(shí)發(fā)現(xiàn)物種多樣性與凈多樣化速率有顯著的正相關(guān)關(guān)系，該研究還發(fā)現(xiàn)物種多樣化速率與凈第一性生產(chǎn)力和面積存在正相關(guān)關(guān)系。熱帶地區(qū)的科的物種的生態(tài)位演化快， 種化速率高，滅絕速率低，古老類群能夠保存，是該熱帶類群物種多樣性高的重要原因。在虎耳草目中，草本和灌木等能夠適應(yīng)溫帶環(huán)境的科有著更高的物種形成速率和凈多樣化速率(Smith & Donoghue，2008)，數(shù)據(jù)分析也顯示這可能是虎耳草目中物種豐富度與凈多樣化速率正相關(guān)關(guān)系形成的主要原因。Folk等(2019)對虎耳草目生態(tài)位祖先重建的結(jié)果表明景天科、虎耳草科和茶藨子科等溫帶適應(yīng)的科的共同祖先，在8千萬年前就已經(jīng)能夠適應(yīng)較為干旱和寒冷的環(huán)境。在漸新世全球氣候變冷時(shí)，這些類群的物種多樣化速率就已經(jīng)高于虎耳草目木本分支的蕈樹科等。中新世后，隨著全球氣候的進(jìn)一步變冷，這些溫帶類群的物種多樣化速率快速上升。相比喜濕熱環(huán)境的蕈樹科、虎皮楠科等類群，虎耳草目中的草本和灌木類群對寒冷環(huán)境的良好適應(yīng)可能為該類群在全球變冷背景下的快速多樣化(Jian et al.,2008)提供了契機(jī)。例如，小二仙草科在始新世—漸新世的全球氣候變冷和干旱化背景下，分布范圍不斷擴(kuò)張，多樣化速率經(jīng)歷了大幅度提升(Moody & Garcia, 2021)。

地質(zhì)歷史事件不僅會(huì)重新塑造原有的地形地貌還會(huì)改變區(qū)域氣候條件，從而對其間的生物演化過程產(chǎn)生影響(唐志堯和方精云，2004; Antonelli et al., 2018)。山脈的隆升直接導(dǎo)致的種群隔離分化以及間接通過生境的復(fù)雜化等導(dǎo)致的種群的生殖隔離和豐富的生態(tài)位促進(jìn)了高山植物的快速演化，這也與虎耳草目多個(gè)科的快速物種多樣化有著密切的聯(lián)系 (Zhang et al., 2014a; 劉杰等, 2017; Moody & Garcia, 2021)。山地草本類群對寒冷生境的快速適應(yīng)和分化，也是中國青藏高原、北美西海岸山脈和歐洲南部阿爾卑斯山脈成為虎耳草目中高山類群物種多樣性中心的重要原因之一(Zhang et al., 2008; Zhang et al., 2014b; Ebersbach et al., 2017; Xing & Ree, 2017; Stubbs et al., 2020)。隨著青藏高原的隆升，許多植物類群出現(xiàn)了快速多樣化，其中包括虎耳草目中適應(yīng)寒冷的類群，虎耳草屬(SaxifragaL.)、紅景天屬(RhodiolaL.)等類群的多樣化速率快速升高(Zhang et al., 2014a; Ebersbach et al., 2017; Folk et al., 2019)。因此，虎耳草目的高山類群物種多樣性快速增加，物種多樣性與凈多樣化速率呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

對類薔薇目(Rosids)的研究發(fā)現(xiàn)，包括虎耳草目在內(nèi)的其他目的多樣化速率也隨著全球變冷而上升，并且多樣化速率隨著緯度升高而升高(Sun et al., 2020)。Igea和Tanentzap(2020)針對被子植物的研究也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，即植物類群在溫帶和寒帶的多樣化速率常常高于熱帶。這些研究的結(jié)果表明溫帶類群在全球變冷的過程中物種多樣性在不斷地積累。盡管空間上看，由于高緯度受冰期影響嚴(yán)重，物種多樣性較低，但是從類群上看，溫帶類群的物種多樣性的增加速率高于熱帶類群。因此，除了虎耳草目外，在被子植物的科中也可能存在類似的現(xiàn)象，即科間的物種多樣性差異與凈多樣化速率可能存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。

有研究者提出物種多樣性差異很可能由多因素共同導(dǎo)致，因此分支年齡和多樣化速率都可能在其中發(fā)揮著作用(Valente et al., 2011; Bloom et al., 2014; Yan et al., 2018)。近年來，也有學(xué)者提出該問題的討論應(yīng)當(dāng)換一種思考模式，由驗(yàn)證哪種假說更正確轉(zhuǎn)向研究這些影響因素之間的互作關(guān)系，并建立相關(guān)模型來更加數(shù)據(jù)化與統(tǒng)計(jì)學(xué)化地看待物種豐富度差異的形成機(jī)制(Pontarp et al., 2019)。盡管本研究中發(fā)現(xiàn)了凈多樣化速率與年齡的交互作用對物種多樣性差異有很高的解釋率，但是目前該結(jié)論是否適用于其他類群，還有待驗(yàn)證?？傊?，迄今為止該問題仍然留有許多值得討論的空間，利用更為復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)模型方法以及更為全面的動(dòng)植物數(shù)據(jù)集去探討該問題可能是未來科研工作者們的研究方向。

核基因的同義突變率比葉綠體基因高5倍，比線粒體基因高20倍，且核基因擁有多個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)、雙親遺傳等特征(Small et al., 2004)，因此，采用核基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與以往小片段建樹相比，能夠更加全面和客觀地反映分支的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究中使用的系統(tǒng)發(fā)育樹是Folk等(2019)基于301個(gè)核基因構(gòu)建的虎耳草目主要分支的系統(tǒng)發(fā)育樹及分支時(shí)間的基礎(chǔ)上，結(jié)合葉綠體基因組小片段和ITS序列所構(gòu)建。本研究結(jié)果中各個(gè)科的關(guān)系與APG IV (APG et al., 2016) 一致。然而，由于物種采樣困難以及大量的核基因測序時(shí)間和經(jīng)費(fèi)比較多，因此核基因組或者大量核基因建樹的物種覆蓋率都比較低。而取樣率低對物種多樣化過程分析的準(zhǔn)確性有著非常大的影響(Chang et al., 2020)，因此基因組結(jié)合小片段建樹是提高物種覆蓋率的解決方案之一。然而，由于小片段的信息位點(diǎn)不足，可能無法十分準(zhǔn)確地估計(jì)近緣物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，也可能對系統(tǒng)發(fā)育樹的枝長估計(jì)產(chǎn)生影響，從而影響到多樣化速率的估計(jì)。隨著葉綠體基因組測序價(jià)格的下降和分析方法的成熟，增加葉綠體基因組的物種覆蓋率可能是解決近緣物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的較為經(jīng)濟(jì)快捷的方法。