基于葉綠體基因組SNP的天臺鵝耳櫪譜系結構與分化分析

陳模舜， 楊仲毅

( 臺州學院 生命科學學院， 浙江省植物進化生態(tài)學與保護重點實驗室， 浙江 臺州 318000 )

天臺鵝耳櫪(Carpinustientaiensis)屬于樺木科(Betulaceae)鵝耳櫪屬(Carpinus)，為中國特有和瀕危的第三紀孑遺植物，是國家二級重點保護野生植物(章紹堯等，1993)。我國是鵝耳櫪屬植物的分布中心，約有33種8變種(傅立國，2003)，其中東南沿海是鵝耳櫪屬植物一個重要的分布區(qū)，天臺鵝耳櫪(C.tientaiensis)和普陀鵝耳櫪(C.putoensis)等為浙江地區(qū)特有(陳之端，1994)。中國植物志曾記載天臺鵝耳櫪產(chǎn)于浙江東部(中國科學院中國植物志編輯委員會，1979)，浙江植物志統(tǒng)計天臺鵝耳櫪僅存5株(章紹堯等，1993)，但近年來在磐安縣和景寧縣等地有所發(fā)現(xiàn)，僅間斷分布于浙江省境內(nèi)的天臺縣、磐安縣、青田縣和景寧畬族自治縣，野外成年植株不足50株，幼年個體缺少，低于野外種群穩(wěn)定存活界限，已處于極危狀態(tài)。生境片斷化使得野生居群變小及居群間的隔離程度增加，這將會導致遺傳變異喪失和近交衰退，最終增加物種滅絕的風險(Aguilar et al.，2008； Wei & Jiang，2012)。根據(jù)IUCN物種紅色名錄，天臺鵝耳櫪屬于極危(critically endangered，CR)等級。天臺鵝耳櫪染色體為14倍體(2n=14x=112)，是樺木科倍性最高的多倍體植物(陳模舜等，2020)。天臺鵝耳櫪在研究樺木科分類、古植物區(qū)系、瀕危機制等研究中具有很高的科研價值(章紹堯和丁炳揚，1993；王昌騰和葉春林, 2007)。

目前，僅對天臺鵝耳櫪組織解剖結構、光合特性對生長光強的響應、群落特征等方面進行了研究(陳模舜和柯世省，2013；陳模舜等，2020)。但天臺鵝耳櫪種群的進化機制與種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育尚未明確，必須收集群體樣本進行基因組學的分析，在基因組水平上加深對這一瀕危物種居群動態(tài)的了解。葉綠體基因組(chloroplast genome，cpDNA)由于其高基因含量和保守的基因組結構，可用于研究開花植物的母系遺傳，特別是多倍體植物(Birky, 1995；Soltis & Soltis, 2000)。cpDNA通常包含單親遺傳的 DNA，由于其自我復制機制和相對獨立的進化，來自葉綠體的遺傳信息經(jīng)常被用來探索近緣種間和種內(nèi)的親緣關系(于濤等，2019)。目前，葉綠體全基因組高通量測序技術為系統(tǒng)進化分析提供了大量的信息位點，比較基因組結構、基因的變異和重復序列排列，有利于構建居群遺傳結構、居群歷史動態(tài)和譜系間分化(孫逸，2012；王佳慧，2015)。本研究通過對天臺鵝耳櫪葉綠體基因組高通量測序，通過對單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)研究，分析多態(tài)位點和核苷酸變異，評估居群的遺傳多樣性水平，推斷天臺鵝耳櫪的譜系結構和分化，為天臺鵝耳櫪種質資源的保護與恢復制定策略。

1 材料與方法

1.1 天臺鵝耳櫪樣地調查及測試材料

天臺鵝耳櫪自然居群最高海拔相近，均在890 m以上，同屬亞熱帶山地濕潤氣候，土壤pH值為酸性，森林植被覆蓋率較高，植被類型為亞熱帶常綠闊葉林(陳模舜等，2020)。天臺鵝耳櫪分布范圍狹窄，僅浙江省的天臺縣華頂山，磐安縣的大盤山、高姥山和青明尖，青田縣仰天湖和景寧畬族自治縣上山頭存在野生群落。其中天臺縣華頂山共存19株，青田縣仰天湖僅存1株，景寧縣大際鄉(xiāng)上山頭胸徑20 cm以上18株，磐安縣境內(nèi)的大盤山共存3株，高姥山和青明尖各為1株。磐安縣每個居群之間相隔20 km之內(nèi)，天臺縣居群與景寧縣居群直線距離約250 km(表1)。

表 1 天臺鵝耳櫪分布地的基本概況Table 1 Basic conditions of distribution regions of Carpinus tientaiensis

天臺鵝耳櫪材料采集自6個自然居群26個植株(包含所有居群的母株)(表1)。其中景寧縣上山頭樣地50 m × 15 m，每隔5～6 m采集1株，共9株，平均胸徑25.2 cm；孤樹1株，分枝最大胸徑11.1 cm。磐安縣大盤山、高姥山、青明尖共采集5株，平均胸徑20.41 cm。青田縣仰天湖采集1株，胸徑28.66 cm。天臺縣華頂山西茅棚采集7株，平均胸徑43.08 cm，公路附近3株平均胸徑20.07 cm。野外采集新鮮葉子后將其冷凍在干冰中，清潔葉片，并保存在-80 ℃的冰箱中以備后續(xù)實驗研究。

1.2 cpDNA測序、組裝與注釋

cpDNA提取使用TIANGEN的DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)，然后在Illumina NovaSeq 6000平臺，以150 bp的對端讀數(shù)高通量測序，每個樣本至少6 Gb的原始序列數(shù)據(jù)。在過濾原始數(shù)據(jù)并消除數(shù)據(jù)質量的影響(Phred分數(shù)Cutoff-30)之后，我們獲得了高質量的數(shù)據(jù)。對獲得26個天臺鵝耳櫪葉綠體全基因組序列，利用已發(fā)表的cpDNA序列(登錄號：KY174338)作為參考序列(Yang et al., 2017)，采用DOGMA軟件注釋完整的cpDNA(Wyman et al., 2004)，使用在線程序OGDRAW(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)制作cpDNA圖譜，同時對每條序列的cpDNA基本信息進行統(tǒng)計，包括基因組大小、基因特征和GC含量。

1.3 重復序列、IR區(qū)域與邊界的擴張收縮和密碼子偏好性分析

重復序列中散在重復使用Reputer軟件分析，用cpLTR表示；簡單重復序列(sequence of simple repeat，SSR)鑒定使用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)工具(參數(shù)：1-10 2-5 3-4 4-3 5-3 6-3)分析。比較不同序列大單拷貝區(qū)(large single copy，LSC)、小單拷貝區(qū)(small single copy，SSC)和反向重復區(qū)(inrerted repeats，IR)長度及邊界，使用在線工具IRscope(https://irscope.shinyapps.io/irapp/)完成IR區(qū)域與邊界的擴張收縮分析。通過R軟件分析密碼子偏好并作圖。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為了檢查物種不同區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育，根據(jù)完整的cpDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用RAxML 8.0軟件進行極大似然樹(maximum likelihood tree，ML tree)構建，結合MrBayes 3.3軟件進行貝葉斯推斷法構建 Bayes tree?；赾pDNA開發(fā)單倍型，運用PopART軟件構建單倍型網(wǎng)絡(Kimura, 1980；Leigh & Bryant, 2015)。使用DnaSP v6(http://www.ub.edu/dnasp/)軟件分析核苷酸多樣性參數(shù)，通過AMOVA分子方差分析，評估譜系間的分子變異程度和遺傳分化固定指數(shù)Fst，分析得到譜系間的分化程度。

2 結果與分析

2.1 天臺鵝耳櫪葉綠體的基本特征

Illumina NovaSeq 6000測序平臺，以150 bp的對端讀數(shù)，每個樣本平均產(chǎn)生3 000萬對配對讀取， 從26個天臺鵝耳櫪生成的數(shù)據(jù)中確定每個完整的cpDNA。天臺鵝耳櫪完整cpDNA由四部分組成，與鵝耳櫪屬(Carpinus)其他植物相似(楊霄月，2019；趙儒楠等，2021)。長度為159 281～159 841 bp，平均為159 616.2 bp，每個cpDNA由1個大單拷貝區(qū)(LSC)(88 360～88 711 bp，平均為88 522.35 bp)和1個小單拷貝區(qū)(SSC)(18 420～18 794 bp，平均為18 634.92 bp)組成，并由1對反向重復序列(IR)隔開(每個IR 26 067～26 451 bp，平均為26 229.46 bp)(表2，圖1)。

表 2 天臺鵝耳櫪cpDNA特征Table 2 Characteristics of cpDNA of Carpinus tientaiensis

經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后，Q20質量評分(96.46%～97.21%)平均96.98%，Q30質量評分(90.81%～92.46%)平均91.94%。基于葉綠體的統(tǒng)計，總體GC含量平均為36.41%，LSC、SSC、IR對應值分別為34.20%、30.09%、42.37%，IR區(qū)域的GC含量高于LSC、SSC區(qū)域。cpDNA的131個基因中，包含86個蛋白編碼基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因。其中：LSC區(qū)域包含60個蛋白質編碼和22個tRNA基因； SSC區(qū)域包含12個蛋白質編碼和1個tRNA基因；IR區(qū)域有7個蛋白質編碼，7個tRNA和所有4個rRNA基因重復(表2，圖1)。

不同功能群的基因用顏色編碼。外圓的基因是順時針轉錄的，而內(nèi)圓的基因則是逆時針轉錄的。內(nèi)圓的虛線區(qū)域表示cpDNA的GC含量。Genes belonging to different functional groups are color-coded. Genes show the outer circle are transcribed clockwise and those inner circle are transcribed counterclockwise. Dashed area in the inner circle indicates the GC content of the cpDNA. 圖 1 天臺鵝耳櫪cpDNA圖譜Fig. 1 Gene map of Carpinus tientaiensis cpDNA

2.2 cpDNA的重復序列分析

滑動鏈的不匹配和重復序列的不適當重組可能導致序列變異和DNA重排(Wicke et al., 2011)。重復序列是重要的遺傳標記，和物種的起源進化息息相關。重復序列一般可分為散在重復和簡單重復。

散在重復使用Reputer軟件分析，這里我們用cpLTR長末端重復序列表示。在天臺鵝耳櫪cpDNA中檢測到正向重復平均32個、回文重復25個、反轉重復22個(圖2)，這些重復中的大多數(shù)表現(xiàn)出10到38 bp之間的長度。簡單重復序列(SSR)廣泛分布于cpDNA中，包含長度為1～6 bp重復序列的短串聯(lián)重復，cpDNA中的這種短串聯(lián)重復是從單親遺傳過來的，SSR在基因組重組和重排中發(fā)揮重要作用，在群體遺傳和進化研究中，常被用作有效的分子標記(Zhou et al., 2018)?；赟SR位于葉綠體區(qū)段類型的數(shù)量統(tǒng)計，天臺鵝耳櫪蛋白編碼基因平均為48個基因、tRNA為3個基因、非編碼區(qū)為41個基因。其中，蛋白編碼基因中6個基因(matK、atpA、rpoB、atpB、cemA、rpl2)具有1個串聯(lián)重復，1個rpoC2基因具有4個串聯(lián)重復，1個ycf1基因具有2個串聯(lián)重復。其中LSC 和SSC區(qū)域共有25個rps12基因串聯(lián)重復，IR有10個rps12串聯(lián)重復基因。

在cpDNA中有87個不同的SSR類型重復了10次以上，其中單核苷酸的數(shù)量最多，平均有50個，占總數(shù)的57.47%；其次是四核苷酸，為14個，二核苷酸為12個，三核苷酸、復合核苷酸各為4個，五核苷酸發(fā)現(xiàn)的比較少，為3個，而六核苷酸沒有發(fā)現(xiàn)(圖3)。在cpDNA中發(fā)現(xiàn)的SSR通常由A/T重復組成，很少包含G/C串聯(lián)重復序列，其中單核苷酸由A/T堿基組成，占92%，這些SSR豐富了cpDNA的AT。cpSSR堿基重復序列中10條占31.20%、11條占16.95%、12條占34.44%、13條占5.65%、14條以上占11.76%(圖4)。cpSSR分區(qū)IRA、IRB各占6.58%，LSC占68.59%，SSC占17.96%，其中LSC重復序列最多(圖5)。在天臺鵝耳櫪cpDNA中，觀察到SSR具有豐富的堿基重復和重復條數(shù)，可以作為居群進化研究有用的遺傳信息。

Mono-, Di-, Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa-表示1～6核苷酸SSR，Complex表示復合核苷酸SSR。Mono-, Di-, Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa- indicate 1 to 6 nucleotide SSR, and Complex indicates complex nucleotide SSR.圖 3 天臺鵝耳櫪cpSSR的類型數(shù)量Fig. 3 Number of cpSSR types detected in Carpinus tientaiensis

圖 4 天臺鵝耳櫪cpSSR堿基序列條數(shù)分布Fig. 4 Frequencies distribution of cpSSR base sequences identified in Carpinus tientaiensis

圖 5 天臺鵝耳櫪SSR在LSC、IR和SSC區(qū)域的頻率Fig. 5 Frequencies of identified SSR in LSC, IR and SSC regions of Carpinus tientaiensis

2.3 密碼子偏好性分析

密碼子在遺傳信息的傳遞中起著重要作用，是核酸和蛋白質之間的聯(lián)系。通過對所有蛋白質編碼的cpDNA和氨基酸序列進行統(tǒng)計分析，天臺鵝耳櫪cpDNA序列的65.65%是蛋白編碼基因，結果顯示蛋白質密碼子的相似性，其中AUG、UUA、AGA、GCU、UCU的頻率較高，而CUG、GUG、AGC、CUC、CUG的頻率較低(圖6)。在這些密碼子中，蛋白質編碼基因中最常見的氨基酸是異亮氨酸(Ile)，其在cpDNA中出現(xiàn)1 146次。相對同義密碼子使用(relative synonymous codon usage，RSCU)值分析表明，色氨酸(Trp)蛋白質編碼基因RSCU=1，表示該密碼子沒有偏好性。其中：47.62%密碼子的RSCU>1，大多數(shù)(28/30，93.33%)以A或T(U)結尾；50.79%密碼子的RSCU<1，大多數(shù)(30/32，93.75%)以C或G結尾(圖6)。

圖 6 天臺鵝耳櫪相對密碼子使用(RSCU)值聚類熱圖Fig. 6 Heat map of the relative synonymous codon usage (RSCU) value of Carpinus tientaiensis

Ala. 丙氨酸; Arg. 精氨酸; Asn. 天冬酰胺; Asp. 天冬氨酸; Cys. 半胱氨酸; Gln. 谷氨酰胺; Glu. 谷氨酸; Gly. 甘氨酸; His. 組氨酸; Ile. 異亮氨酸; Leu. 亮氨酸; Lys. 賴氨酸; Met. 甲硫氨酸; Phe. 苯丙氨酸; Pro. 脯氨酸; Ser. 絲氨酸; Thr. 蘇氨酸; Trp. 色氨酸; Tyr. 酪氨酸; Val. 纈氨酸。Ala. Alanine; Arg. Argnine; Asn. Asparagine; Asp. Aspartate; Cys. Cysteine; Gln. Glutamine; Glu. Glutamate; Gly. Glycine; His. Histidine; Ile. Isoleucine; Leu. Leucine; Lys. Lysine; Met. Methionine; Phe. Phenylalanine; Pro. Proline; Ser. Serine; Thr. Threonine; Trp. Tryptophan; Tyr. Tyrosine; Val. Valine.圖 7 天臺鵝耳櫪蛋白質編碼基因中20個氨基酸密碼子含量Fig. 7 Codon contents of 20 amino acids in all protein-coding genes of Carpinus tientaiensis

在天臺鵝耳櫪物種的蛋白質編碼cpDNA中，20個氨基酸由63個密碼子編碼，其中除天冬氨酸(Asp)外，大多數(shù)氨基酸都具有密碼子偏好性。總共確定了40個密碼子偏好，其中涉及19個氨基酸。在優(yōu)選的密碼子中，63.49%表現(xiàn)出較高的偏好(圖7)。該結果進一步揭示了天臺鵝耳櫪cpDNA的相對保守性，因為高密碼子偏好也是高等植物中的常見現(xiàn)象(喻鳳和韓明，2021)。

2.4 cpDNA變異檢測

單核苷酸多態(tài)性(SNP)和基因組結構變異在進化過程中至關重要(Britten et al., 2003)。cpDNA結構性變異有插入/缺失、轉換、顛換和基因組結構重排。在26個天臺鵝耳櫪cpDNA中鑒定了314條SNPs，JST居群SNPs平均為132條、QYH為126條、PDS為18條、PGS為18條、PQJ為8條、THS為12條。以居群植株與THS _1 cpDNA比對，結果表明JST居群堿基顛換數(shù)(transversion，Tv)平均為95個、QYH為90個、PDS為16個、PGS為15個、PQJ為6個、THS為12個(表3)。研究的所有成對序列比較表明，顛換次數(shù)多于轉換次數(shù)，這在其他分類群中也被發(fā)現(xiàn)(Stoltzfus & Norris, 2016)。

表 3 天臺鵝耳櫪葉綠體比較基因組統(tǒng)計表Table 3 Chloroplast comparative genome statistical table of Carpinus tientaiensis

2.5 IR區(qū)域與邊界的擴張收縮

被子植物的cpDNA是高度保守的，IR 區(qū)域和單拷貝(single copy，SC)邊界區(qū)域的擴展和收縮是造成高等植物cpDNA長度變化的主要機制(Saina et al., 2018)。比較26個完整的天臺鵝耳櫪cpDNA的IR/SC邊界區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在連接位置上有明顯差異。其中，rpl2基因的長度都是1 513 bp，其端點較保守，離JLA、JLB基因間隔區(qū)都是71 bp。trnN-GUU的長度是72 bp，離JSB、JSA基因間隔區(qū)變化為1 516～1 864 bp，不超過以下基因間隔區(qū)的終點。rps19基因在JSB/IRb邊界處由JSB向IRb延伸3 bp。ycf1基因跨越JSA/IRa區(qū)，4 211～4 553 bp位于SSC區(qū)域內(nèi)，向IRb延伸1 192～1 540 bp(圖8)。這4個cpDNA中IR/SC邊界處的變異導致了整個cpDNA序列長度的差異，并在其他植物中也已發(fā)現(xiàn)(Yin et al., 2018)。

基因用彩色框表示?；蛱卣魃戏降臄?shù)字表示基因末端與邊界位點之間的距離。Genes are denoted by colored boxes. The numbers above the gene features indicate the distance between the ends of genes and the border sites.圖 8 天臺鵝耳櫪cpDNA的IR-SC區(qū)的邊界比較Fig. 8 Comparison of IR-SC border positions across cpDNA of Carpinus tientaiensis

2.6 基于完整的cpDNA序列的群體分析

2.6.1 單倍型網(wǎng)絡構建 通過天臺鵝耳櫪cpDNA分析，運用一段遺傳連鎖的核酸序列的變異來區(qū)分，構建單倍型網(wǎng)絡(haplotype network)。在系統(tǒng)發(fā)育分析時，核苷酸堿基一個插入或缺失作為一次進化事件進行編碼分析。天臺鵝耳櫪單倍型中的大多數(shù)具有居群單倍型，幾乎沒有觀察到居群之間的單倍型共享。在地理上接近的天臺縣(THS)(H1～H3)、景寧縣(JST)(H4～H6)、磐安縣大盤山(PDS)(H7～H9)，各居群內(nèi)具有相同單倍型；而磐安縣青明尖(PQJ)H10、磐安縣高姥山(PGS)H11和青田縣(PQJ)H12是在單個標本中發(fā)現(xiàn)的私有單倍型。根據(jù)統(tǒng)計單倍型網(wǎng)絡圖(圖9)，揭示了兩組單倍型，在此研究中稱為浙東組THS居群和浙西組JST居群，由95個突變步驟隔開。根據(jù)多態(tài)位點分析JST居群和THS居群可變位點和插入，在rps16-trnQ序列有3個核苷酸取代，分別為T→C(位置275)、A→G(位置299)和T→G(位置1254)區(qū)分了浙東組THS居群(T、A和T)和浙西組JST居群(C、G和G)。從網(wǎng)絡圖推測可能的種群歷史，除來自THS居群和JST居群單倍型之間堿基突變?yōu)?5個較遠外，居群組單倍型之間演化關系呈現(xiàn)星狀中心輻射。THS居群的單倍型演化出PDS亞群、PQJ亞群和PGS亞群，居群組單倍型之間差異僅2～6個堿基突變，THS居群與PDS亞群單倍型之間的替代鏈接提示可能存在同源性；JST居群的單倍型演化出QYH亞型，2個單倍型之間少量差異(1～2個堿基突變)，顯示出天臺鵝耳櫪居群在歷史上遇到瓶頸后曾發(fā)生局部擴張。

網(wǎng)絡圖中每個圓圈代表一個單倍型，每個圓圈的大小與觀察到的頻率成比例，圓圈顏色代表不同的居群，分支上的短線表示單倍型間的堿基替換數(shù)。Each circle in the network represents a haplotype, the size of the circle represents the frequency of haplotypes, and different colors in the circle represent different populations, and short lines on branches represent base substitutions between haplotypes.圖 9 基于cpDNA的天臺鵝耳櫪單倍型網(wǎng)絡Fig. 9 Network of haplotypes of Carpinus tientaiensis based on cpDNA

2.6.2 系統(tǒng)進化樹構建 cpDNA包含豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息，已被廣泛用于近緣種間和種內(nèi)水平的系統(tǒng)發(fā)育重建。使用cpDNA數(shù)據(jù)，解決了與各種系統(tǒng)發(fā)育困難群體相關的長期爭議。為了評估天臺鵝耳櫪系統(tǒng)發(fā)生關系，使用26個天臺鵝耳櫪植株全葉綠體序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過極大似然樹(RAxML)和貝葉斯推斷法(MrBayes)生成系統(tǒng)樹，系統(tǒng)發(fā)育分析每個節(jié)點數(shù)字為極大似然法(ML)支持值(Bootstrap support，BS)(%)和貝葉斯(BA)后驗概率(posterior probability，PP)(%)(Stamatakis, 2014；Xie et al., 2018)。

在完整cpDNA序列中，通過系統(tǒng)分析，6個自然居群分為THS居群和JST居群(100BS/100PP)。THS居群包含第一分支THS_10和THS_2～3(65BS/83PP)；第二分支PQJ_1(61BS/60PP)，PDS_1(59BS/73PP)，PGS_1和PDS_2～3(70BS/100PP)，THS_1和THS_4～9(70BS/100PP)。JST居群包含第一分支JST_7和JST_9～10(89BS/100PP)；第二分支JST_1～6、JST_8和QYH_1(85BS/100PP)(圖10)。LSC、SSC數(shù)據(jù)集的拓撲結構與物種cpDNA系統(tǒng)樹具有一致性，在種內(nèi)進化枝中僅發(fā)生了細微的拓撲差異，支持形成單系的群體。

A. cpDNA ML系統(tǒng)發(fā)育樹; B. cpDNA Bayes系統(tǒng)發(fā)育樹。分支數(shù)表示 ML Bootstrap支持值/Bayes后驗概率。A. cpDNA ML system development tree; B. cpDNA Bayes system development tree. Number of the branches indicate ML Bootstrap support value/Bayesian posterior probability.圖 10 基于完整cpDNA序列的最大似然和貝葉斯推理方法重建6個分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 10 Phylogenetic tree reconstruction of six taxa using maximum likelihood and Bayesian inference methods based on the complete cpDNA sequences

2.6.3 譜系結構分析 利用DnaSP計算遺傳多樣性參數(shù)，通過AMOVA分子方差分析，評估譜系間的分化變異程度，遺傳分化固定指數(shù)Fst分析得到譜系間的分化程度。核苷酸取代和插入/缺失變異揭示了6個天臺鵝耳櫪分布區(qū)中的12個cpDNA單倍型(Nh)，這些單倍型中的25%是在單個植株中發(fā)現(xiàn)的，幾乎沒有觀察到居群之間的共享單倍型。譜系間的分化可以通過對單倍型多樣性指數(shù)(Hd)與核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)進行分析，其數(shù)值越大，說明其遺傳多樣性越高(周文漪，2014；Nikulin et al., 2020)。其中，PGS亞群、PQJ亞群和YHS亞群由單一植株組成，僅有私有單倍型。JST居群Pi為0.000 01，THS居群Pi為0.000 02，PDS居群Pi為0.000 03，所有居群核苷酸多樣性的變異均較低(Pi<0.005)。從單倍型多樣性指數(shù)看，JST居群Hd為0.6，THS居群Hd為0.511， JST居群和THS居群單倍型多樣性相對較低，其中PDS亞群Hd為1，由于PDS居群僅有3株個體，單倍型多樣性偏高(表4)。

表 4 譜系多樣性參數(shù)統(tǒng)計表Table 4 Statistical table of genealogical diversity parameters

天臺鵝耳櫪6個居群的分子變異分析(AMOVA)結果表明，居群間的遺傳分化固定指數(shù)Fst為0.970 9，譜系間分化較大，表明在整個遺傳變異中居群間遺傳變異占97.09%，居群內(nèi)遺傳變異占2.91%，居群間的遺傳變異大于居群內(nèi)(表5)。這種分布格局的主要原因是生境的片段化，地理隔離阻礙了居群間的基因交流(孫逸，2012；鄭鑫，2015；Nikulin et al., 2020)。

表 5 譜系分子方差檢驗統(tǒng)計表Table 5 Statistical table of genealogical molecular variance test

3 討論與結論

完整的cpDNA序列可提供豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息來源，天臺鵝耳櫪cpDNA的長度平均為159 616.2 bp，GC含量相似，為36.41%，說明該物種cpDNA的高度保守性質。重復分析顯示在天臺鵝耳櫪cpDNA中發(fā)現(xiàn)LTR重復序列包括正向重復平均32個、回文重復25個、反轉重復22個，SSR重復序列不同類型87個。這些重復中的大多數(shù)位于蛋白編碼區(qū)、非編碼區(qū)和tRNA中。在藻類和被子植物基因組中LTR重復序列很常見，是促進cpDNA重排的主要因素之一，并且許多重排終點都與此類重復序列相關(Pombert et al., 2005；Zhang et al., 2020)。在所有個體中，SSR通常由A/T重復組成，其中單核苷酸由A/T堿基組成，占92%，大多數(shù)蛋白質編碼基因都具有高度的密碼子偏好性，在優(yōu)選的密碼子中，63.49%表現(xiàn)出較高的偏好，葉綠體密碼子的第三個A/T偏好較高。相關研究表明基因組AT含量與重復序列的動力學以及葉綠體蛋白編碼基因的密碼子偏向性有關(Yu et al., 2019；Wu et al., 2020)。

cpDNA SNP的數(shù)量及堿基顛換為物種之間的系統(tǒng)發(fā)育解析提供了有益的標記(鄭鑫，2015；Nikulin et al., 2020)。根據(jù)溯祖理論，通過單倍型網(wǎng)絡圖，結合地理信息我們可以推斷種群的起源、擴散歷史(Huang et al., 2014)。通過對SNP多態(tài)位點和核苷酸變異分析，單核苷酸取代顯示天臺鵝耳櫪分為天臺縣居群(THS)和景寧縣居群(JST)，亞群間距離相近的優(yōu)先聚為一支。除來自THS居群和JST居群單倍型關系較遠外，居群組大部分單倍型之間僅有2～6個堿基突變，某幾個同一或者相近地理居群的單倍型具有聚類現(xiàn)象，這可能由于該物種對亞熱帶濕潤氣候或暖溫帶氣候的環(huán)境要求較高造成(陳之端，1994)。天臺鵝耳櫪具有居群組單倍型，沒有居群之間的單倍型共享，這種單系進化枝可能是由于地理隔離導致短時期內(nèi)居群之間基因交流較少造成的(Nikulin et al., 2020)。所有居群核苷酸多樣性的變異均較低(Pi<0.005)，JST居群和THS居群單倍型多樣性較低(Hd為0.5～0.6)， 表明最近發(fā)生過居群瓶頸效應(孫逸，2012；周文漪，2014)。由于晚第三紀及第四紀的氣候動蕩及冰期更替，天臺鵝耳櫪退縮到狹小區(qū)域的避難所，度過冰期；或群體局部擴張到濕潤地區(qū)的森林中(陳之端，1994；Qi et al., 2012)。

通過對天臺鵝耳櫪譜系結構與分化的研究，對遺傳多樣性比較高的居群制定資源保存和引種馴化策略。在6個自然居群中都檢測到了獨特的單倍型，尤其THS居群、JST居群和PDS亞群具有較高的單倍型多樣性， 棲息地面積較大，內(nèi)部環(huán)境較穩(wěn)定，需要加強棲息地保護，以維持天臺鵝耳櫪高的遺傳多樣性。天臺鵝耳櫪居群規(guī)模較小、隔離程度較高，居群間呈現(xiàn)較大的遺傳分化，致使種源不斷減少，是急需保護的瀕危植物。對繁殖衰退的居群應開展遺傳拯救，引入以花粉為主導基因流實驗，移入新個體或基因型而減緩遺傳侵蝕進而提高天臺鵝耳櫪種群生存力。