HPLC法測定西藏不同產(chǎn)地虎耳草中虎耳草素含量

李子璇,韓 豪,吳 婕,聶麗娟,白彩娟

(1.西藏大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,西藏 拉薩850000；2.陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 漢中723001)

虎耳草(Saxifraga stolonifera Curt.)為虎耳草科虎耳草屬植物虎耳草的全草,全世界約有400多種、中國有203種,主要分布于河北、陜西、甘肅等地區(qū),西藏地區(qū)有101種,具有清熱、解毒、消炎[1]、抑菌、抗病毒[2]、體外抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗雌雄性激素、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞調(diào)亡[5]、護(hù)肝[6]等作用,主要用于治療風(fēng)疹、濕疹、中耳炎、丹毒、咳嗽吐血、痔疾等疾病。研究表明,虎耳草素具有抗炎鎮(zhèn)痛功效[2],西藏地區(qū)虎耳草資源豐富,本研究以采自西藏不同地區(qū)虎耳草為試驗(yàn)材料,以虎耳草素活性單體為對(duì)照,采用HPLC法對(duì)虎耳草中虎耳草素進(jìn)行定量分析,旨在建立簡便可控的虎耳草素檢測方法,為西藏虎耳草資源收集、保護(hù)及開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010A HT型高效液相色譜儀(日本島津公司),配AglentSB-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；KT-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；FA2004B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；XP6型電子天平(瑞士 MET-TLER TOLEDO公司)；YS-08型小型高速粉碎機(jī)(北京正德機(jī)械設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑

甲醇(色譜純,韓國德山藥品工業(yè))；磷酸(成都金山化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純,韓國德山藥品工業(yè))；蒸餾水。槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：20161028,北京生物科學(xué)與技術(shù)有限公司),綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：20162019,中國食品藥品檢定研究院),虎耳草素對(duì)照品(批號(hào)：20170102,北京生物科學(xué)與技術(shù)有限公司)。

1.3 材料

實(shí)驗(yàn)用虎耳草分別采自西藏不同地區(qū),共收集7批樣品,經(jīng)西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院鑒定為虎耳草屬的全草。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為AglentSB-C18(250mm×4.6mm,5μm)分析柱,虎耳草素以乙腈(A)∶0.1%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相,檢測波長為275nm,流速1mL·min-1,柱溫30℃,進(jìn)樣量10μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取對(duì)照品虎耳草素4.26 mg,置于25 m L棕色容量瓶中,加甲醇適量進(jìn)行超聲溶解,稀釋至刻度,搖勻,用針孔濾膜(0.45μm)濾過,得對(duì)照品溶液,待測。

2.3 供試品溶液制備

取虎耳草樣品自然晾干,粉碎,過60目篩,精密稱取虎耳草粉末1.0 g,置50 m L容量瓶中,加70%甲醇至刻度,50℃水浴超聲提取,超聲功率為250W ,40k Hz,70%甲醇補(bǔ)足損失重量,搖勻,用針孔濾膜(0.45μm)濾過,得對(duì)照品溶液,待測。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液,按照以上色譜條件測定虎耳草素的含量,以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X,色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸。計(jì)算得回歸方程為：Y虎耳草素=18.828X-18.295,R2=0.9995,線性范圍為0.831～106.42μg·m L-1。樣品和對(duì)照品色譜分別見圖1、圖2。

圖1 虎耳草素樣品色譜

圖2 虎耳草素標(biāo)準(zhǔn)品色譜

2.5 精密度試驗(yàn)

取虎耳草樣品(山南篦齒虎耳草)按“2.3”項(xiàng)制備供試樣品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,重復(fù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10μL,測得虎耳草素的峰面積,計(jì)算其RSD值為2.1%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品(同上)6份,按照“2.3”項(xiàng)分別制備6份樣品液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,每次進(jìn)樣10μL,測得虎耳草素峰面積,計(jì)算其RSD值為3.1%(n=6),符合中國藥典關(guān)于重復(fù)性的要求,表明該方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品(同上)6份,按照“2.3”項(xiàng)分別制備6份樣品液,室溫條件下,在0、2、4、6、8、12、分別進(jìn)樣10μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積,并計(jì)算其RSD值為2.7%(n=6),結(jié)果表明樣品中虎耳草素在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量虎耳草6份。分別加70%甲醇30 m L,虎耳草素對(duì)照品溶液1 m L,按“2.3”項(xiàng)方法制備、“2.1”項(xiàng)色譜條件測定,進(jìn)樣10 m L,計(jì)算各對(duì)照品的平均加標(biāo)回收率和RSD值。結(jié)果見表1。

表1 虎耳草素回收率

2.9 樣品含量測定

精密稱取7批虎耳草樣品2.0 g,按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定虎耳草素的含量,計(jì)算其結(jié)果。見表2。

表3 虎耳草中虎耳草素的含量

3 討論

本研究采用超聲輔助提取,HPLC法測定西藏產(chǎn)虎耳草中虎耳草素的含量,測定結(jié)果線性關(guān)系良好,精密度、重復(fù)性、回收率均符合中國藥典有關(guān)要求,樣品穩(wěn)定性好,表明此方法簡便、快速、準(zhǔn)確,可用于虎耳草素含量的測定。在對(duì)虎耳草素進(jìn)行提取時(shí),分別用不同濃度的甲醇進(jìn)行提取,結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%的甲醇提取效果最好。

對(duì)7批不同產(chǎn)地虎耳草中虎耳草素進(jìn)行測定,含量范圍在0.008～0.125 mg/g,其中含量最高的是在拉薩奪底溝采集的異葉虎耳草,含量最低的是南木林縣采集的藏中虎耳草,我們從測定結(jié)果也可以看出,不同種間的虎耳草素含量存在很大差異；同一種虎耳草采集海拔不同,采集時(shí)間不同,虎耳草素含量差別很大,采集時(shí)間早、海拔低的虎耳草素含量較高。熊丹丹等[7]對(duì)虎耳草中虎耳草素進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)不同省份(不含西藏)虎耳草中虎耳草素的含量差異很大,范圍在1.42～5.98 mg/g,但是與西藏各地區(qū)的虎耳草相比含量較高,這可能與提取方法、采集時(shí)間、海拔高度等都有一定的關(guān)系。

多種藏藥的原藥材都含有虎耳草,比如,二十五味余甘子丸、二十五味松石丸、二十五味綠絨蒿丸等。目前,市場上虎耳草原藥材來源不明,種類不明,勢必會(huì)造成藥效的不同,本研究對(duì)不同種、不同海拔、不同時(shí)間虎耳草屬的7批樣品進(jìn)行了檢測,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析,為藏藥原藥材的優(yōu)選提供了理論依據(jù)。