基于全基因組測(cè)序的甲型副傷寒沙門菌暴發(fā)疫情分離株分子特征研究

李 毅,謝愛蓉,謝中必

甲型副傷寒是由甲型副傷寒沙門菌引起的急性腸道傳染病,可通過生活用水、食物、蒼蠅、蟑螂接觸等傳播引起局部暴發(fā)或流行,是我國(guó)《傳染病防治法》中規(guī)定報(bào)告的乙類傳染病之一。該病是全球、特別是發(fā)展中國(guó)家共同面臨的公共衛(wèi)生問題,而中國(guó)副傷寒的發(fā)病率和死亡率已明顯下降,近50年來,特別是從20世紀(jì)90年代至今,發(fā)病率基本控制在0.32/10萬～1.75/10萬,但每年仍有局部流行或小規(guī)模暴發(fā)[1-4]。該病分布在中國(guó)各地,常年散發(fā),以夏秋季多發(fā),發(fā)病以學(xué)齡及學(xué)齡前兒童,青壯年較多,而學(xué)校、農(nóng)村、低洼水網(wǎng)地區(qū)是副傷寒的重要流行區(qū),我國(guó)南方是主要的流行地區(qū)[3-5]。臨床上以持續(xù)高熱,脈搏變緩、食欲減退、腹部不適,部分患者皮膚出現(xiàn)淡紅色小斑丘疹(玫瑰疹)、肝脾腫大和白細(xì)胞減少等為特征,嚴(yán)重者出現(xiàn)腸出血、腸穿孔、心肌炎等并發(fā)癥[3,5-6]。2020年12月中旬以來,溫州某醫(yī)院連續(xù)報(bào)告甲型副傷寒確診病例,病人均為溫州某大學(xué)在校學(xué)生,因此,溫州疾控部門立即組織流調(diào)人員到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)開展流行病學(xué)調(diào)查與處置,診斷本次暴發(fā)疫情系由甲型副傷寒沙門氏菌污染食材引起的食源性疾病暴發(fā)事件,隨即開展了菌株鑒定、血清型凝集、PFGE分子分型、藥物敏感實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌全基因組測(cè)序,其分析結(jié)果將為暴發(fā)病原的確定提供進(jìn)一步的證據(jù),也有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和分析病原菌的分子特征。

1 材料與方法

1.1 菌株 2020年12月中旬至2021年1月上旬,溫州某醫(yī)院共報(bào)告病例18例,均為學(xué)生,臨床表現(xiàn)以發(fā)熱(體溫≥38.0℃)為主,占100%,頭痛占83.33%、腹瀉占66.67%,另外有2例出現(xiàn)脾腫大,所有病例的嗜酸性粒細(xì)胞均下降,最后從病人血液標(biāo)本中分離出11株甲型副傷寒沙門菌。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)VITEK 2 Compact和濁度儀為生物梅里埃公司產(chǎn)品;全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)MALDI Biotyper Smart為布魯克(北京)科技有限公司產(chǎn)品;脈沖場(chǎng)凝膠電泳系 統(tǒng)CHEF MAPPER、Molecular Imager○RGel DocTMXR＋System with Image LabTMSoftware凝膠成像系統(tǒng)為伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品。沙門菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉公司;沙門菌血清誘導(dǎo)瓊脂與沙門菌血清均為丹麥SSI產(chǎn)品;GN鑒定卡購(gòu)自生物梅里埃公司;蛋白酶K(20 mg/m L)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;Seakem Gold Agarose購(gòu)自瑞士Lonza公司;XbaI內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。Nephelometer比濁儀、加樣器、96孔藥敏板、CAMHBT肉湯均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方 法

1.3.1 生化鑒定和血清學(xué)分型 首先將菌株接種于沙門菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行初步鑒定,挑取淡紫色菌落接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板,接著進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定接種GNI鑒定卡和微生物質(zhì)譜鑒定,然后用沙門菌分型血清作玻片凝集實(shí)驗(yàn),并設(shè)生理鹽水作為對(duì)照[3,6]。血清學(xué)分型先用O多價(jià)血清玻片凝集,凝集者,再選用單價(jià)血清凝集,O抗原確定后,依次用相應(yīng)的H因子血清凝集第一相和第二相抗原,鑒定結(jié)果依據(jù)White-Kauffmann-LeMinor抗原表(第9版)[7]血清分型標(biāo)準(zhǔn),確定血清型別。

1.3.2 甲型副傷寒沙門菌PFGE分析 操作程序可參考傷寒、副傷寒沙門菌的PFGE操作程序或美國(guó)CDC沙門菌的PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作程序[1]操作,將新鮮菌株懸濁于盛有1 m L細(xì)胞懸濁液(CSB),調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至4.0～4.5 McF,將細(xì)菌包埋于1%Sea Kem Gold瓊脂糖內(nèi),用含有25μL蛋白酶K的細(xì)胞裂解液(CLB)進(jìn)行裂解,然后將每個(gè)菌株2 mm寬的膠塊用XbaⅠ酶37℃酶切3 h,菌株H9812作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電泳參數(shù):電壓梯度6 V/cm,電泳夾角120°,脈沖時(shí)間2.16～63.8 s,電泳時(shí)間18.3 h,電泳結(jié)束后,用GelRed染色并用純水脫色,然后用凝膠成像儀拍攝圖像,并轉(zhuǎn)換成TIFF圖像格式。最后運(yùn)用Bionumerics 7.6軟件生物信息學(xué)軟件對(duì)分離株的指紋圖譜進(jìn)行聚類分析。

1.3.3 全基因組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 全基因組測(cè)序委托杭州微數(shù)生物科技有限公司。

1.3.3.1 基因組提取、文庫(kù)構(gòu)建及全基因組測(cè)序 將菌株從菌種保存管劃線接種至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)平板復(fù)蘇活化,36℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),用無菌接種環(huán)刮取新鮮菌落,隨后按照天隆細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的全基因組DNA,外送進(jìn)行測(cè)序和文庫(kù)構(gòu)建,簡(jiǎn)要流程如下:電泳檢測(cè)DNA純度和完整性后,利用酶切方法將細(xì)菌基因組DNA碎片化為200～300 b堿基短片段,使用文庫(kù)制備試劑盒制備文庫(kù),使用Qubit 4.0熒光計(jì)和NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量和插入片段大小檢測(cè),使用qPCR進(jìn)行文庫(kù)濃度定量后在Illumina(因美納)HiSeqXTen平臺(tái)開展全基因組測(cè)序。

1.3.3.2 下機(jī)數(shù)據(jù)處理 測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù),進(jìn)行質(zhì)控(去接頭、過濾質(zhì)量較低的數(shù)據(jù)),得到clean data,然后通過國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)高性能生物計(jì)算數(shù)據(jù)處理終端中基因分析軟件將原始序列進(jìn)行de novo組裝,序列組裝拼接以后,通過在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得毒力基因、耐藥基因、MLST、r MLST、cg MLST的數(shù)據(jù)分析結(jié)果。1)MLST、r MLST和cg MLST特征分析 將全基因組序列結(jié)果上傳網(wǎng)站數(shù) 據(jù)(http://pubmlst.org/organisms/salmonellaspp)進(jìn)行線上數(shù)據(jù)分析,獲取每株菌7個(gè)管家基因(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA)的 等位基因序列號(hào),與沙門菌MLST標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得該菌株的序列型別(ST),而同時(shí)獲取cg MLST的2750個(gè)核心基因的等位基因序列號(hào)以及r MLST核糖體序列號(hào),然后利用BioNumerics 7.6軟件對(duì)其進(jìn)行MLST和cg MLST聚類分析。2)毒力基因和耐藥基因分析 利用軟件拼接后的序列,通過細(xì)菌基因組分析平臺(tái)fIDBAC(http://fbac.dmicrobe.cn/)提交序列數(shù)據(jù)獲得毒力基因和耐藥基因,同時(shí)分別參考病原菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)VFDB(http://www.mgc.ac.cn)和抗性耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)CARD(https://card.mcmaster.ca/)。

1.3.4 藥物敏感性試驗(yàn) 從新鮮培養(yǎng)的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平皿中挑取3～5個(gè)菌落,在去離子水中乳化,并使用比濁儀調(diào)節(jié)到0.5麥?zhǔn)蠞岫?。取配制好的菌懸?0μL加入到11 m L CAMHBT肉湯中,得到試驗(yàn)用菌懸液。用加樣儀分別在96孔藥敏板中每孔加入50μL菌懸液,用粘性封膜密封所有孔,放置36℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后讀取試驗(yàn)結(jié)果。記錄每1種抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的MIC值。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀,結(jié)果為敏感、中介、耐藥。大腸埃希菌(ATCC25922)由本實(shí)驗(yàn)室保存,其最小抑菌濃度(MIC)值均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查 2020年12月16日下午17時(shí),溫州某醫(yī)院連續(xù)報(bào)告2例副傷寒病例,均為溫州某大學(xué)在校學(xué)生,疑似有聚集性,溫州疾控部門流調(diào)人員當(dāng)天晚上18時(shí)55分到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)開展流行病學(xué)調(diào)查與處置。根據(jù)流調(diào)個(gè)案表、病例病案及綜合討論,確定病例定義,共搜索到病例18例,其中疑似病例6例,實(shí)驗(yàn)室確診病例12例,均為學(xué)生。臨床癥狀和體征:12例確診病例中,臨床表現(xiàn)以發(fā)熱(體溫≥38.0℃)為主,占100%,頭痛占83.33%、腹瀉占66.67%,另外有2例出現(xiàn)脾腫大,所有病例的嗜酸性粒細(xì)胞均下降。流行病學(xué)特征:首例病例從發(fā)病到確診間隔28 d,12例確診病例中,男生3例,女生9例,男女發(fā)病比例為1∶3,均為住校大學(xué)生,年齡在19至23歲,分布在不同的年級(jí)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)情況:11例確診病例經(jīng)溫州某醫(yī)院血培養(yǎng)檢測(cè),1例確診病例經(jīng)杭州某醫(yī)院血培養(yǎng)檢測(cè),結(jié)果均為甲型副傷寒沙門氏菌陽性,而6例疑似病例經(jīng)血培養(yǎng)檢測(cè),結(jié)果均為陰性。根據(jù)流調(diào)情況,所有病例存在可疑外賣7家餐飲店的70份食物及配料、22份環(huán)境涂抹標(biāo)本、33份從業(yè)人員血清和肛拭子、3份管網(wǎng)生活末梢水采樣檢測(cè),結(jié)果均為未檢出甲型副傷寒沙門菌。溫州市疾控中心對(duì)溫州某醫(yī)院送檢的11例確診病例菌株進(jìn)行復(fù)核鑒定分析。

2.2 菌株生化鑒定和血清學(xué)分型實(shí)驗(yàn) 11株菌株經(jīng)GNI系統(tǒng)生化鑒定和微生物質(zhì)譜鑒定結(jié)果全部為沙門菌。經(jīng)血清玻片凝集實(shí)驗(yàn),11株沙門菌血清型均為甲型副傷寒沙門菌,血清抗原式為1,2,12:a:-。

2.3 甲型副傷寒沙門菌PFGE分子分型與聚類結(jié)果 11株甲型副傷寒沙門菌經(jīng)XbaⅠ酶切后帶型完全一致,帶型相似度100%,具有顯著的帶型聚集性特征,從分子流行病學(xué)角度可診斷為同一傳染源導(dǎo)致,具體見圖1。

圖1 11株甲型副傷寒沙門菌PFGE聚類分析及其分型特征Fig.1 PFGE cluster analysis and typing characteristics of 11 strains of Salmonella paratyphi A

2.4 甲 型 副 傷 寒 沙 門 菌MLST、r MLST和cg MLST分型結(jié)果 對(duì)11株菌株進(jìn)行MLST分型鑒定,全部為ST129;cg MLST分型鑒定,全部為cgST-2191;r MLST分型鑒定,全部為3678。從沙門菌數(shù)據(jù)庫(kù)下載20株ST129、r MLST 3678完全一樣的和3株ST85的英國(guó)(UK)病人分離的甲型副傷寒沙門菌細(xì)菌全基因組測(cè)序數(shù)據(jù),通過分析菌株核心基因,與數(shù)據(jù)庫(kù)里英國(guó)暴發(fā)流行的甲型副傷寒沙門菌菌株構(gòu)建最小生成樹,發(fā)現(xiàn)11株菌株聚成一簇,提示有共同暴露。雖然同為ST129、r MLST 3678,這些菌株與英國(guó)暴發(fā)的甲型副傷寒沙門菌菌株親緣關(guān)系還是有差別,同時(shí)也說明應(yīng)用基因組數(shù)據(jù)的遺傳特征分析比傳統(tǒng)的MLST方法更為精細(xì)和精準(zhǔn)。具體見圖1和圖2。

圖2 甲型副傷寒沙門菌cg MLST聚類分析結(jié)果Fig.2 cgMLST cluster analysis of Salmonella paratyphi A

2.5 毒力基因分析 通過毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)本次疫情菌株基因組信息進(jìn)行比對(duì),取Identity≥90,11株甲型副傷寒沙門菌預(yù)測(cè)獲得的基因注釋結(jié)果均攜帶21類250種已知毒力基因。其中與染色體上沙門菌毒力島1(SPI-1)和2(SPI-2)編碼的沙門菌侵襲力相關(guān)和在胞內(nèi)存活發(fā)揮毒力的2個(gè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢSecretion/translocation system,T3SS)有關(guān)的基因最多有76種;其次是與黏附有關(guān)的決定基因有74種,又以I型菌毛有關(guān)的基因較多;此外,與沙門菌鞭毛及相關(guān)基因有54種,細(xì)胞質(zhì)蛋白有關(guān)的基因18種。其他還有與調(diào)節(jié)、腸菌素鐵蛋白利用、傷寒毒素、外膜蛋白、鎂離子吸附因子、鐵吸收等有關(guān)的基因在毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲得注釋。詳見圖3。

圖3 甲型副傷寒沙門菌毒力基因分析結(jié)果Fig.3 Virulence gene analysis of Salmonella paratyphi A

2.6 耐藥基因分析 通過耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)本次疫情菌株基因組信息進(jìn)行比對(duì),取Identity≥90,發(fā)現(xiàn)本次疫情菌株基因組均攜帶29種耐藥基因,具體見表1。

表1 11株甲型副傷寒沙門菌耐藥基因攜帶情況Tab.1 Drug resistance gene carriage of 11 strains of Salmonella paratyphi A

2.7 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 測(cè)試結(jié)果顯示菌株的耐藥表型一致。本次11株菌株均表現(xiàn)出對(duì)萘啶酸100%耐藥,對(duì)鏈霉素100%中介,對(duì)氯霉素類(氯霉素)、磺胺類(磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明)、大環(huán)內(nèi)脂類(阿奇霉素)、喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧沙星、吉米沙星)、青霉素類(氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦)、頭孢菌素類(第一代:頭孢唑啉;第三代:頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶/克拉維酸;第四代:頭孢吡肟)、頭霉素類(頭孢西丁)、單環(huán)B內(nèi)酰胺類(氨曲南、阿莫西林/克拉維酸)、氨基糖苷類抗生素(慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素)、碳青霉素稀類(亞胺培南、美羅培南)、多肽類(多粘菌素E、多粘菌素B)、氨基糖苷類抗生素(慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星)等28種抗生素均未發(fā)現(xiàn)耐藥情況。

3 討論

隨著浙江省各地衛(wèi)生環(huán)境的改善及一系列綜合防控措施的落實(shí),全省傷寒副傷寒暴發(fā)疫情整體呈下降趨勢(shì),具有明顯季節(jié)性特征,以夏秋季為發(fā)病高峰[3,8],溫州市發(fā)病高峰主要發(fā)生在冬春季[9],其發(fā)病人群一樣主要以青壯年和學(xué)生為主,農(nóng)村和學(xué)校是重點(diǎn)地區(qū)和場(chǎng)所,但仍有散發(fā)病例持續(xù)存在趨勢(shì)[3,8]。本次甲型副傷寒沙門菌暴發(fā)疫情發(fā)生在冬季,發(fā)病人群為學(xué)生,發(fā)生的場(chǎng)所為學(xué)校,符合副傷寒沙門菌的流行病學(xué)特征,與顧敏華等[10]和唐保暉等[11]報(bào)道的一致發(fā)生在冬季和學(xué)校。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)是國(guó)際上公認(rèn)的的細(xì)菌分子流行病研究的標(biāo)準(zhǔn)方法,已經(jīng)成為細(xì)菌性傳染病實(shí)驗(yàn)室調(diào)查、溯源分析的“規(guī)定動(dòng)作”,其優(yōu)勢(shì)是重復(fù)性好分辨力高結(jié)果穩(wěn)定易于標(biāo)準(zhǔn)化[3]。本次暴發(fā)疫情通過脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)技術(shù)快速地進(jìn)行了11株菌株的溯源調(diào)查分析,查找出了各病例間的流行病學(xué)關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)了聚集性病例,在疫情控制方面發(fā)揮了重要作用。但PFGE技術(shù)目前在分辨度和識(shí)別力方面仍具有一定的技術(shù)局限性,不能提供病原菌的遺傳進(jìn)化信息。

隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,使得從全基因組水平進(jìn)行疾病監(jiān)測(cè)和暴發(fā)疫情處置成為可能,也可為進(jìn)一步了解本地菌株的病原學(xué)特征,與國(guó)內(nèi)外菌株的進(jìn)化關(guān)系及科學(xué)防控和臨床治療提供參考。而且,還可以通過基因組序列對(duì)暴發(fā)的傳播來源與途徑做出精確的推斷,從而在暴發(fā)和流行的早期進(jìn)行控制。因此,通過全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析,本次暴發(fā)疫情11株菌株MLST型、cg MLST型、r MLST型全部一致,說明來源于同一傳染源,而選擇ST型和r MLST型相同的英國(guó)(UK)病人分離的甲型副傷寒沙門菌進(jìn)行全基因細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)分析存在遺傳差異,主要是MLST基于7個(gè)管家基因分析、r MLST型基于核糖體而cg MLST是基于上千個(gè)基因位點(diǎn),將MLST擴(kuò)展到全基因水平顯示了更好的分型能力。相較于僅應(yīng)用了一小部分基因組信息的多基因位點(diǎn)順序分型(MLST)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)等傳統(tǒng)分型方法,基于全基因組的方法能夠在暴發(fā)溯源研究中更詳細(xì)地解析傳播動(dòng)態(tài),從而更為精細(xì)地分析出致病菌的進(jìn)化和群體結(jié)構(gòu)。全基因組測(cè)序方法顯示了極高的分型力、分辨力和可重復(fù)性,已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于病原微生物研究,便于構(gòu)建公共數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)化應(yīng)用。

另外,病原菌的一些重要的基因特征,比如耐藥基因、毒力基因等也可以通過全基因組測(cè)序獲得。本研究的11株甲型副傷寒沙門菌分離株基因組通過毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,獲得了21類250個(gè)毒力基因,其中以Ⅲ型分泌系統(tǒng)、黏附、鞭毛等相關(guān)基因最為常見。據(jù)研究,沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病性主要表現(xiàn)在2個(gè)方面:一是侵入非吞噬細(xì)胞的能力及其在胞內(nèi)存活的能力,二是在吞噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖的能力,而這些致病能力均與沙門菌毒力島(SPI)有關(guān),目前已有23個(gè)SPI被鑒定出來[12]。SPI編碼表達(dá)沙門菌絕大多數(shù)毒力因子,對(duì)沙門菌的致病性起至關(guān)重要的作用,而SPI-1與SPI-2在各血清型沙門菌中分布廣泛,具有非常重要的功能。T3SS可分泌幾種效應(yīng)蛋白刺激宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,引起一系列細(xì)胞反應(yīng)。SPI-1編碼與沙門菌侵襲力相關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)1(T3SS1),編碼的蛋白可以侵入宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,在沙門菌侵襲巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。目 前,SPI-1上 發(fā) 現(xiàn) 含 有inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iac、prg、sic等 基 因,與 侵 襲 力 有 關(guān) 的Ⅲ型分泌系統(tǒng)成分。本次疫情分離菌株發(fā)現(xiàn)編碼T3SS1轉(zhuǎn)位蛋白的基因sipA、sipB、sipC、sipD,編碼T3SS1效應(yīng)蛋白的基因sopD、sopE2,編碼分子伴侶的基因sicP、invB,編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子invA、invE、invF、invH、hilA、orgA、orgB。SPI-2是 由細(xì)菌全身致病性相關(guān)毒力基因組成的一個(gè)基因簇島,是沙門菌在胞內(nèi)存活和發(fā)揮毒力的重要毒力島。本次疫情分離菌株在SPI-2上發(fā)現(xiàn)編碼二元系統(tǒng)的基因(ssrA和ssrB),編碼T3SS2結(jié)構(gòu)成分的基因(ssa)如:spiC/ssaB、ssaC、ssaD、ssaE、ssaG、ssaH、ssaI、ssaJ、ssaK、ssaL、ssaM、ssaV、ssaN、ssaO、ssaP、ssaQ、ssaR、ssaS、ssaT、ssaU,編 碼T3SS2效應(yīng)蛋白的基因(sse)如sseA、sseB、sseC、sseD、sseE、sseF、sseG、sseL,編碼T3SS2特異性伴侶蛋白的基因(ssc):sscA、sscB。本次疫情菌株與黏附有關(guān)的基因有I型菌毛、Peg、Stb、Sef、Sth、Bcf、Tcf、Saf、Std、Ste、Stf、Stk、Csg、Mis L和Sin H等74種菌毛和菌毛操縱子基因,其中沙門菌Ⅰ型菌毛又稱Fim菌毛,廣泛分布于沙門氏菌屬內(nèi),本次疫情菌株主要攜 帶fimA、fimC、fimD、fimF、fimH、fimI、fimY、fimW、fimZ基因,沙門菌Ⅰ型菌毛是菌體表面的一種粘附因子,參與介導(dǎo)細(xì)菌粘附多種細(xì)胞的過程,是沙門菌定植和侵襲宿主的關(guān)鍵,在沙門菌感染機(jī)體的初始階段起著重要作用。同時(shí)沙門菌Ⅰ型菌毛也能促進(jìn)生物被膜形成,且在天然免疫過程發(fā)揮著重要作用,還與鞭毛存在聯(lián)系,能調(diào)節(jié)鞭毛基因表達(dá)和菌體運(yùn)動(dòng)[13-14]。而鞭毛不僅是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官,也是重要的毒力因子,鞭毛所提供的動(dòng)力可能是細(xì)菌入侵細(xì)胞的重要因素,鞭毛蛋白可以作為黏附素,有助于細(xì)菌在細(xì)胞表面的吸附及其后的侵襲與定居。所以,沙門菌在感染過程中,除了I型菌毛,鞭毛和Ⅲ型分泌系統(tǒng)毒力島多種毒力因子參與沙門菌的致病過程外,其運(yùn)動(dòng)、黏附、侵襲和存活時(shí)間等還受到多種毒力因子的影響和調(diào)控。

通過比對(duì)耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù),本次疫情11株菌株均含有與氟喹諾酮類(如:萘啶酸)有關(guān)的acrA、acrB、acrR、CRP、emrA、emrB、emrR、marA、marR、MdtK、soxS、sdiA和soxR耐藥基因,也含有與氨基糖苷類(如:鏈霉素)有關(guān)的acrD、AAC(6′)-Iy、baeR、cpxA和kdpE耐藥基因。此外,還均含有其他11種耐藥基因,其中bacA、GlpT、PmrF和ugd等4種基因參與沙門菌外排泵作用而介導(dǎo)耐藥;gyrA、mdfA、mdsC、mdtB、mdtC和msbA等6種基因參與沙門菌抗生素靶點(diǎn)改變作用而介導(dǎo)耐藥;TEM-60基因參與沙門菌抗生素滅活作用而介導(dǎo)耐藥。王偉等[15]通過基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)外排泵系統(tǒng)相關(guān)的耐藥基因可能介導(dǎo)沙門菌多重耐藥表型,目前,一般認(rèn)為acr AB是沙門菌最主要的外排泵,它與四環(huán)素、氯霉素等多重耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。另外,菌株耐藥基因情況分析推測(cè),除了現(xiàn)有耐藥表型外,已具備對(duì)氨基糖苷類和青霉素類抗生素耐藥的潛力,因此,臨床治療時(shí)應(yīng)規(guī)范抗生素的使用,以免激發(fā)新的耐藥表型。

本次疫情分離菌株以萘啶酸的單重耐藥為主,與溫州地區(qū)尤榮開等報(bào)道的常用抗菌藥物的敏感性基本相似[16],與浙江省2008年分離的209株甲型副傷寒沙門菌[17]和曲梅等報(bào)道的甲型副傷寒沙門菌對(duì)萘啶酸100%耐藥[18]一致,而云南省2005－2012年91株甲型副傷寒沙門菌病原學(xué)特征分析對(duì)萘啶酸也是普遍耐藥的[19],該結(jié)果提示副傷寒沙門菌可能普遍對(duì)萘啶酸耐藥,在治療副傷寒沙門菌時(shí),應(yīng)特別關(guān)注對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥問題。同時(shí),本研究結(jié)果顯示甲型副傷寒沙門菌對(duì)氨基糖苷類抗生素(慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素)敏感率大部分都很高,但有學(xué)者認(rèn)為該類藥物難以滲入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),盡管體外藥敏試驗(yàn)較好也不作為首選藥物,并且此類藥物不良反應(yīng)大。而第三、四代氟喹諾酮類藥物為DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑,能阻礙細(xì)菌DNA復(fù)制合成,從而達(dá)到殺菌作用,其具有敏感率高殺菌作用強(qiáng)、毒性低、不良反應(yīng)少、復(fù)發(fā)率低,療效好,價(jià)格適中等優(yōu)點(diǎn),可作為治療甲型副傷寒的首選藥物,但氟喹諾酮類藥物避免用于18歲以下未成年人、孕婦患者,因此應(yīng)選擇第三、四代頭孢菌素或頭霉素類藥物。還有其他類型抗菌藥物的臨床應(yīng)用也應(yīng)該按照研究結(jié)果和應(yīng)用指南進(jìn)行使用和管理。

通過以上研究?jī)?nèi)容的分析,提示本次甲型副傷寒沙門菌暴發(fā)疫情分析菌株具有同一傳染源,將病原體基因組測(cè)序和生物信息分析技術(shù)應(yīng)用于傳染病監(jiān)測(cè),是傳染病流行病學(xué)的最新突破,是疾病防控的新策略和新方法。副傷寒沙門菌感染為一種常見的細(xì)菌性疾病,既往報(bào)道的暴發(fā)疫情大多與水或者食物被污染有關(guān),當(dāng)食品被被污染后,可因加工過程中加熱不徹底或與其他食品交叉污染導(dǎo)致胃腸炎暴發(fā)。綜合以上分析,推斷本次疫情系由甲型副傷寒沙門菌污染食材引起食源性疾病暴發(fā)事件,由于客觀原因我們?cè)谡{(diào)查過程中始終未能從食物、水體等環(huán)境樣本中檢測(cè)出甲型副傷寒沙門菌,本次暴發(fā)疫情的調(diào)查沒有形成完整的病原學(xué)證據(jù)鏈,只能推論為由單一傳染源引起的散發(fā)性暴發(fā),還需要做進(jìn)一步深入研究和分析。因此,建議:①學(xué)校將食源性疾病暴發(fā)事件處置方案納入學(xué)校疫情防控應(yīng)急管理機(jī)制,完善監(jiān)測(cè)和報(bào)告機(jī)制,監(jiān)測(cè)到學(xué)校出現(xiàn)疑似食源性疾病暴發(fā)事件要按規(guī)定第一時(shí)間上報(bào);②學(xué)校重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)校內(nèi)食堂和餐飲的管理,要保持嚴(yán)格的檢查力度和頻度,采取有效措施消除老鼠、蟑螂、蒼蠅和其他有害昆蟲及其孳生條件,確保食堂和餐廳內(nèi)外環(huán)境整潔衛(wèi)生;③重點(diǎn)教育學(xué)生養(yǎng)成良好的個(gè)人飲食衛(wèi)生習(xí)慣,牢記“吃熟食、喝開水、勤洗手”的要求。

利益沖突:無

引用本文格式:李毅,謝愛蓉,謝中必.基于全基因組測(cè)序的甲型副傷寒沙門菌暴發(fā)疫情分離株分子特征研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(10):898-905.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.135