浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因組序列測定及細(xì)胞分離鑒定

張冉昕,馬 巖,趙中飛,任江萍,凌 鋒,盧學(xué)新,朱武洋

狂犬病病毒是引起人與動物間狂犬病的主要病原體,屬于彈狀病毒科狂犬病病毒屬,基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA,大小約為12 kb,編碼5個結(jié)構(gòu)蛋白[1]。狂犬病病毒長期在野生動物和犬貓等家養(yǎng)動物間持續(xù)循環(huán)傳播,偶爾溢出感染引起人類的狂犬病。狂犬病的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的腦脊髓炎,一旦出現(xiàn)相關(guān)癥狀將引起不可逆轉(zhuǎn)的死亡,目前仍無有效治療手段。在我國,超過95%的人間狂犬病是由發(fā)病犬引起[2]。

2015 年世界衛(wèi)生組織(WHO)、世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和世界糧農(nóng)組織(FAO)聯(lián)合制定狂犬病消除計劃,旨在2030年實現(xiàn)消除由犬引起的人間狂犬病。中國作為長期飽受狂犬病威脅的國家,參與了上述提議并制定了符合我國的消除規(guī)劃[3]。目前,我國人間狂犬病病例自2007年以來持續(xù)下降,狂犬病的防控策略也從為高危人群注射疫苗轉(zhuǎn)為控制并消除動物間的狂犬病[4-5]。獲取動物間的狂犬病流行特征,從分子流行病學(xué)層面了解狂犬病病毒的變異等特點可為進(jìn)一步開展狂犬病防控工作提供理論數(shù)據(jù),促進(jìn)防控策略的更新。本實驗測定了浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因組序列,并對序列進(jìn)行比對分析,以期了解當(dāng)?shù)乜袢〔《镜姆肿恿餍刑卣?。并通過細(xì)胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化,分離獲得狂犬病病毒,為狂犬病疫苗更新、臨床治療等提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 樣本來自浙江省紹興市一犬傷多人事件的肇事犬,在負(fù)壓生物安全二級實驗室中采集腦組織并使用直接免疫熒光法(DFA):將陽性腦組織用80%冷丙酮固定后,用FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白抗體進(jìn)行檢測,確認(rèn)為狂犬病病毒陽性。將病犬腦組織標(biāo)本使用含1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液(SOLARBIO,P7630)的DMEM(GBICO,2186828)培養(yǎng)基研磨制備30%腦組織懸液,8000×g離心10 min保留上清,于－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計 參考近年浙江省2株狂犬病病毒(FJ712193、FJ712195)全基因組序列,設(shè)計擴(kuò)增狂犬病病毒全基因組核苷酸序列引物(表1)。

表1 狂犬病病毒基因組擴(kuò)增及測序用引物序列Tab.1 Primer sequences for rabies virus genome amplification and sequencing

1.3 全基因組序列測定與比對分析 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN,Cat.52904)提取腦組織懸液中的病毒RNA,提取操作參照試劑盒說明書。使用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit,Ver.2(Dye Plus)(Ta KaRa,Cat.＃RR057A)進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增,在25μL反應(yīng)體系中加入2.5μL的病毒RNA作為模板,反應(yīng)程序為50℃30 min完成逆轉(zhuǎn)錄過程,經(jīng)過5 min的95℃預(yù)變性后,進(jìn)行95℃30 s、(50～52)℃30 s、72℃60 s的擴(kuò)增程序,共計35個循環(huán)。使用1%瓊脂糖電泳確認(rèn)目的條帶擴(kuò)增,對符合預(yù)期長度的片段進(jìn)行序列雙向測定。使用Geneious 11.0軟件中De Novo Assemble方法,進(jìn)行序列拼接。對序列進(jìn)行間隔區(qū)和編碼區(qū)校正,獲得正確的全基因組序列,將其命名為ZJSX-2021。從GenBank中下載中國狂犬病病毒Ⅰ-Ⅶ型全基因組序列共32條,將本實驗測得序列與32株中國地區(qū)毒株全基因組序列進(jìn)行比對,用MEGA-X軟件中的Neibor-Joining Method(NJ,replications＝1000)繪制種系發(fā)生樹。

1.4 病毒細(xì)胞分離 使用10%FBS的DMEM培養(yǎng)Neuro-2a細(xì)胞(ATCC,CCL-131)至對數(shù)期,消化制備細(xì)胞懸液,500×g離心5 min獲取細(xì)胞,按1×106個細(xì)胞用1 m L病毒懸液重懸,置入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min,調(diào)整細(xì)胞密度為4×105cells/m L,在96孔板中每孔接種150μL病毒細(xì)胞混合液,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后轉(zhuǎn)入33℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h收獲培養(yǎng)上清,同時對每孔細(xì)胞進(jìn)行直接熒光法檢測,孔內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光灶的判為陽性,收集保存上清即為F1代;同時參照已建立方法對F1代進(jìn)行狂犬病病毒核酸檢測[6]。將出現(xiàn)熒光灶較多的F1代繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),使用MOI＝0.2進(jìn)行接種培養(yǎng)72 h用于擴(kuò)增病毒,直到培養(yǎng)至F3代。參照中國藥典中狂犬病病毒滴度測定方法測定F1-F3代的病毒滴度,同時使用1.3的方法測定F1-F3代的全基因組序列,分別比對F0與F1、F2和F3核苷酸序列和氨基酸變化情況,分析病毒基因序列的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 狂犬病病毒ZJSX-2021全基因組序列組成 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后核酸片段與預(yù)期大小相符(圖1),經(jīng)測序拼接獲得了ZJSX-2021狂犬病病毒街毒株全基因組核苷酸序列,基因組全長11782 bp,包含3′端、5′端和5個開放閱讀框(ORF),與狂犬病病毒株基因分布模式一致。3′端核蛋白基因上游有一段59個核苷酸的先導(dǎo)保守不翻譯序列(leader),5′端L基因下游有一處117個核苷酸的非翻譯區(qū)(trailer);在N-P-M-G間有2、2、6個核苷酸的間隔序列。

2.2 種系發(fā)生分析 對ZJSX-2021狂犬病病毒株基因序列與來源于GenBank中的中國其他地區(qū)代表不同基因型的32株序列進(jìn)行基于狂犬病病毒全基因組序列種系發(fā)生分析(圖2),結(jié)果顯示,本實驗分離得到的浙江紹興狂犬病病毒(ZJSX-2021)基因序列仍屬于我國狂犬病病毒株優(yōu)勢種ChinaⅠ型,與全部參考病毒ChinaⅠ型序列相比一致性為97.10%～99.31%。在與32株不同基因型的全基因組比對中,本株序列與2014年山東省分離得到1株狂犬病病毒株(JQ970486)一致性最高為99.31%,有79個核苷酸不同;其次與2013年北京豐臺區(qū)分離得到的1株狂犬病病毒株(KC660078)一致性達(dá)99.28%,共有85個核苷酸不同;與2014年重慶分離得到的1株狂犬病病毒株(KY912036)相差最大,一致性僅僅有83.81%,有1500個核苷酸不同。在不同ORF比對后,結(jié)果顯示在核苷酸序列比對中結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列最低一致性在83.20%～87.91%,同一基因型內(nèi)一致性均高于99%;在氨基酸序列比對中,N蛋白和L蛋白的序列較為保守,不同型別間的一致性最低在95%左右,在同一基因型內(nèi),一致性幾乎為100%。P蛋白和M蛋白相較于G蛋白變異較大,P蛋白和M蛋白的最低一致性分別為87.92%和85.89%,低于G蛋白的90.67%,但在同一基因型內(nèi),一致性最高可達(dá)到100%。相關(guān)比對結(jié)果和變異位點數(shù)見表2。

表2 浙江紹興狂犬病病毒(ZJSX-2021)不同基因變異情況統(tǒng)計表Tab.2 Statistical table of gene variants of Zhejiang Shaoxing rabies virus(ZJSX-2021)

2.3 病毒細(xì)胞分離培養(yǎng) 細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒72 h后,對孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行DFA檢測,在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞胞核周圍形成綠色圓環(huán)狀的病毒包涵體(圖3);將獲得的F1代繼續(xù)傳代培養(yǎng),病毒滴度持續(xù)增高,從F1代3.19×102FFU/m L增至F3代5.71×107FFU/m L,可認(rèn)為成功分離得到此毒株ZJSX-2021。

2.4 病毒序列穩(wěn)定性分析 ZJSX-2021腦組織研磨液記作F0代,通過對F0代細(xì)胞分離培養(yǎng)得到F1、F2、F3代病毒懸液與F0代全基因組序列的各個蛋白區(qū)域核苷酸和氨基酸序列分別進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)F0代與F1、F2和F3代全基因組核苷酸序列表現(xiàn)出較高的相似性,差異在0.47%～0.51%,其中A-G的轉(zhuǎn)化發(fā)生次數(shù)最多,占總變異的39.62%。核苷酸序列的一致性明顯底于氨基酸序列的一致

表3 浙江紹興狂犬病病毒ZJSX-2021F0與F1、F2、F3代核苷酸氨基酸序列突變個數(shù)比較Tab.3 Comparison of nucleotide amino acid sequence mutations between Zhejiang Shaoxing rabies virus(ZJSX-2021)F0 and F1,F2 and F3 generations

3 討論

狂犬病給我國帶來沉重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生體系。隨著狂犬病疫苗免疫的普及和人們對狂犬病認(rèn)識的加深,我國人間狂犬病發(fā)病率已經(jīng)得到有效控制[7-8],但動物間狂犬病的流行情況尚不明確,亟需積累相關(guān)的數(shù)據(jù),此外我國狂犬病的防控策略正處于從人間狂犬病防控向阻斷動物間狂犬病傳播轉(zhuǎn)變的階段,而動物間狂犬病的流行和傳播目前相關(guān)研究較少,本實驗通過對浙江地區(qū)1株犬源狂犬病病毒的分離與全基因序列的測定分析,也為研究我國動物間狂犬病流行特點提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

狂犬病病毒株根據(jù)其流行情況可分為7個種群(ChinaⅠ-Ⅶ),每個毒株群的規(guī)模和流行范圍各不相同[9]。我國各省份狂犬病發(fā)病情況也存在明顯差異。本實驗分離得到的ZJSX-2021分屬ChinaⅠ型,是我國狂犬病病毒優(yōu)勢種群。ChinaⅠ型流行地區(qū)較廣,分布范圍達(dá)25個省份,在全國約2/3地區(qū)都曾出現(xiàn),并以犬傳播為主,目前尚未在與人更為密切的犬中建立循環(huán)[10]。浙江省處于狂犬病高發(fā)省市江蘇省和福建省之間,一直存在狂犬病零星散發(fā)病例,本實驗從分子流行病學(xué)層面通過研究浙江地區(qū)狂犬病病毒流行特點,為探究浙江地區(qū)狂犬病病毒種屬分類提供參考,為浙江地區(qū)狂犬病防疫防控工作的開展提供思路。

狂犬病病毒共編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白,其中核蛋白是狂犬病病毒穩(wěn)定高效表達(dá)的蛋白,其氨基酸序列在5個結(jié)構(gòu)蛋白中最為保守,往往作為狂犬病病毒的分型依據(jù)[11-12],主要與狂犬病病毒毒力有關(guān),在位點333的精氨酸與神經(jīng)侵襲力和跨突觸傳播能力相關(guān),能使病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中擴(kuò)散的速度更快[13]。本實驗運(yùn)用全基因組測序方法對浙江紹興街毒株進(jìn)行序列分析,與以往只針對核蛋白或糖蛋因白進(jìn)行序列分析有所不同,全基因組序列比對分析以更全面的角度對序列進(jìn)行比對,會使各序列之間的信息更加全面被了解。但目前利用全基因序列進(jìn)行比對分析的相關(guān)數(shù)據(jù)較少,需要我們繼續(xù)深入研究。

狂犬病病毒具有嗜神經(jīng)性,早期狂犬病病毒分離主要通過乳鼠顱內(nèi)接種完成,近年來通過細(xì)胞分離培養(yǎng)狂犬病病毒時有報道[14]。細(xì)胞分離培養(yǎng)狂犬病病毒已有成功報道,但成功率相對較低且難以達(dá)到較高滴度,實驗流程尚未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本實驗對細(xì)胞培養(yǎng)分離狂犬病病毒方法進(jìn)行了嘗試,利用小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(Neuro-2a)成功分離狂犬病病毒,并在3次傳代培養(yǎng)后獲得高滴度的狂犬病病毒懸液。通過在細(xì)胞中分離培養(yǎng)病毒,既可以減少實驗動物的使用,也可以降低時間人力成本,同時為開展病毒的復(fù)制過程探討、抗病毒物質(zhì)對病毒的作用方式與機(jī)制研究,以及研究病毒干擾現(xiàn)象的本質(zhì)和變異的規(guī)律性研究等提供實驗基礎(chǔ)。

利益沖突:無

引用本文格式:張冉昕,馬巖,趙中飛,等.浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因組序列測定及細(xì)胞分離鑒定[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(10):849-853.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.130