大腸菌群不同檢測(cè)方法的結(jié)果分析

陳衛(wèi)民（永豐縣疾控中心檢驗(yàn)科，江西 永豐 331500）

大腸菌群是一類(lèi)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和厭氧的革蘭氏陰性菌群。日常生活用品的衛(wèi)生狀況主要是以人和動(dòng)物糞便作為主要指標(biāo)，具有普遍的指示菌性質(zhì)，可以作為衡量日用器具衛(wèi)生狀況的一個(gè)重要指標(biāo)。目前常用的大腸菌群檢測(cè)方法有：VRBA平板計(jì)數(shù)法、乳糖膽鹽多管發(fā)酵法、LST多管發(fā)酵法、紙片法、PCR試劑盒法、全自動(dòng)生化鑒定法等。在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB4789.3-2016）中，常規(guī)的檢測(cè)方法有VRBA平板計(jì)數(shù)法、乳糖膽鹽多管發(fā)酵法、LST多管法等。本次實(shí)驗(yàn)主要采用VRBA平板計(jì)數(shù)法和LST多管發(fā)酵法。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 檢測(cè)樣品選自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心，共70例。所有樣品均為真空包裝，包裝無(wú)任何破損。實(shí)驗(yàn)采用的儀器和試劑均采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。立式壓力蒸汽滅菌器（型號(hào)BKQ-B75II,廠家：山東博科）；生化培養(yǎng)箱（型號(hào)DZF-6050，廠家：上海一恒）光學(xué)顯微鏡（型號(hào)MF43-M，廠家：廣州明美）。

1.2 方法 對(duì)樣品的使用及保存嚴(yán)格遵守中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心的質(zhì)控樣品證書(shū)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB4789.3－2016）的要求進(jìn)行。

1.2.1 方法1采用單劑乳糖膽鹽酸發(fā)酵試管，分別用3支試管，在（36±1）℃下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 方法2用雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液，在（36±1）℃下培養(yǎng)24 h。觀察產(chǎn)酸是否產(chǎn)氣，如發(fā)黃或生成氣體，則此試樣為陰性。如果不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，就是大腸菌群的負(fù)數(shù)。從猜測(cè)性檢測(cè)陽(yáng)性的試管中取一種環(huán)狀培養(yǎng)液，將其轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)的瓊脂平板上，于（36±1）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，取出，觀察其形態(tài)，進(jìn)行革蘭染色及證實(shí)實(shí)驗(yàn)。選擇1～2個(gè)疑似大腸菌群的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色；同時(shí)用乳糖發(fā)酵管進(jìn)行接種，在（36±1）℃下培養(yǎng)24 h。所有的乳糖發(fā)酵管最后產(chǎn)生的產(chǎn)酸和革蘭氏染色呈陰性的無(wú)芽孢桿菌均可檢測(cè)到大腸菌群。采用冷凍干燥菌種管結(jié)腸菌［ATCC25922］，將其轉(zhuǎn)種到第5代營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，用0.85%的生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊浔葷岫冗_(dá)到0.5。然后用0.85%的生理鹽水稀釋到10-1,10-2，10-3。共比濁度試驗(yàn)用0.5的麥?zhǔn)蠁挝?0支，按5次稀釋?zhuān)謩e稀釋到10-1,10-2,10-3，然后用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管3支1 ml，然后將樣品溶液注入雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵罐中，在（36±1）℃下培養(yǎng)24 h［1-2］。

1.3 臨床觀察指標(biāo) 采用VRBA平板計(jì)數(shù)和LST多管發(fā)酵試驗(yàn)，其測(cè)定結(jié)果符合GB4789.3-2016標(biāo)準(zhǔn)。QC-FD-003號(hào)質(zhì)量控制樣品由3位具備檢驗(yàn)資格的檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)。按GB4789.3-2016標(biāo)準(zhǔn)，采用LST多管發(fā)酵法和VRBA平板計(jì)數(shù)法，對(duì)各試驗(yàn)方法進(jìn)行了比較。為比較吸液器和吸液器的作用，每位檢測(cè)者在進(jìn)行VRBA平板計(jì)數(shù)的同時(shí)，采用吸液器和吸液器進(jìn)行質(zhì)量控制。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了“z比分?jǐn)?shù)”的評(píng)定。在|z|≤2的情況下，該方法的效果是“滿意”；若2<|z|<3，則為“可疑”；在|z|≥3的情況下，該方法的結(jié)論是“不滿意”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。不符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)按正態(tài)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LST多管發(fā)酵法檢測(cè)結(jié)果分析LST多管發(fā)酵法（移液管）的測(cè)試結(jié)果是1.451，得到了“滿意”的結(jié)論。從表2可以看出，VRBA平板計(jì)數(shù)法（移液管）的測(cè)量結(jié)果是0.093，并且得到了“滿意”的結(jié)論。與LST多管發(fā)酵相比，VRBA平板計(jì)數(shù)的|Z|值較低，且與質(zhì)量控制樣品的特征值相近，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)醫(yī)院（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 LST多管發(fā)酵法檢測(cè)結(jié)果［n（%）］

2.2 VRBA平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果分析VRBA平板計(jì)數(shù)采用移液管測(cè)量|z|值為0.0931，得到了“滿意”的結(jié)論。VRBA平板計(jì)數(shù)儀采用吸液器測(cè)量|z|值為0.0.793，得出“滿意”的結(jié)論。用吸液器測(cè)量的|z|值小于吸液槍?zhuān)錅y(cè)量值與質(zhì)量控制樣本的特征值相近，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 VRBA平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果分析［n（%）］

3 討論

大腸菌群不是一種細(xì)菌，而是一種衛(wèi)生細(xì)菌，不是一種或一屬細(xì)菌，而是一種與排泄物污染相關(guān)的特定性質(zhì)的細(xì)菌。它們的生物化學(xué)和血清學(xué)特征不完全相同，它們的定義是：需要氧和兼性厭氧，37℃可分解乳糖和產(chǎn)酸的革蘭氏陰性的無(wú)芽孢桿菌。目前已知的細(xì)菌有大腸菌群，檸檬酸桿菌，產(chǎn)氣克雷伯氏菌，陰溝腸桿菌，埃希氏菌［3］。

大腸菌群屬中云埃希氏菌屬、檸檬酸綁菌屬、魔雷伯氏菌屬、腸桿菌屬等，均屬于大腸菌群科。本屬細(xì)菌來(lái)源于人體及溫血?jiǎng)游锏哪c道，其需氧性、兼性厭氧性、無(wú)芽孢；在35℃～37℃下，乳糖聲酸產(chǎn)氣可在48 h內(nèi)進(jìn)行，革蘭氏陰性。埃希氏菌屬是大腸菌群的主要成員，而埃希氏菌屬則是通常所說(shuō)的典型大腸菌群。所有的大腸菌都是由人類(lèi)和溫血?jiǎng)游锏呐判刮镏苯踊蜷g接產(chǎn)生的［4-5］。除了大腸菌群之外，該群體中的其他菌種，除了從糞便中直接獲得外，還可以從正常的大腸埃希氏菌中排出7~30天后發(fā)生的變化。因此，在食物中發(fā)現(xiàn)大腸菌群J代表食物受到了來(lái)自于暖血?jiǎng)游锏募S便的污染，而另一些則是由于長(zhǎng)期的糞便污染。

大腸菌群是一種與糞便污染相關(guān)的細(xì)菌，它們的生物化學(xué)和血清學(xué)都不完全相同，通常被認(rèn)為是由大腸菌群、枸櫞酸桿菌、克雷白氏菌、陰溝腸桿菌等組成。大腸菌群是一種被檢測(cè)到的糞便污染的指示菌，它是通過(guò)檢測(cè)到的菌群來(lái)判斷食物是否受到了糞便的污染。大腸菌群的數(shù)量是影響糞便污染程度和危害人類(lèi)健康的重要因素。糞便是人體的排泄物，包括正常人的排泄物，也包括腸炎病人和帶菌者的排泄物。另外，由于某些腸道細(xì)菌（例如志賀氏菌、沙門(mén)氏菌）也會(huì)出現(xiàn)，因此如果食物中含有糞便，那么就有可能被腸道細(xì)菌感染，從而引發(fā)食物中毒和傳染病。這是一種對(duì)人類(lèi)健康的潛在威脅［6］。

大腸菌群是食品衛(wèi)生安全的主要衛(wèi)生指標(biāo)。目前，我國(guó)食品中大腸菌群的測(cè)定主要有VRBA平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法，MPN計(jì)數(shù)法又分為乳糖膽鹽多管法和GB4789.3-2016多管發(fā)酵法。目前，我國(guó)在預(yù)包裝食品中，使用GB4789.3-2016標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的VRBA板數(shù)和LST多管發(fā)酵方法，僅在代用茶、辣椒、粽子等少數(shù)品種中使用了GB/T4789.3-2003規(guī)定的乳糖膽鹽多管發(fā)酵工藝。

VRBA平板計(jì)數(shù)所用的VRBA培養(yǎng)液無(wú)需消毒，直接配制，并在2 min內(nèi)加熱沸騰。食物中的大腸菌群是革蘭氏陰性的，一般不會(huì)產(chǎn)生芽孢，但當(dāng)VRBA的煮沸時(shí)，就會(huì)殺死大腸菌群。對(duì)最后的測(cè)試結(jié)果沒(méi)有任何影響。VRBA培養(yǎng)基中所含的晶體紫色不能抑制革蘭氏陰性菌，但能有效地抑制革蘭氏陽(yáng)性菌。VRBA與其它培養(yǎng)基不同，它需要進(jìn)行兩次注入，（1）第二次覆蓋能在培養(yǎng)皿內(nèi)形成厭氧微環(huán)境，對(duì)其它需氧菌的生長(zhǎng)起到抑制作用；（2）對(duì)細(xì)菌的擴(kuò)散和生長(zhǎng)起到了很好的抑制作用，易于計(jì)數(shù)［7-9］。

MPN計(jì)數(shù)法是一種以泊松分布為基礎(chǔ)的間接計(jì)數(shù)方法，它是一種將統(tǒng)計(jì)與微生物學(xué)相結(jié)合的定量檢驗(yàn)方法，但其準(zhǔn)確度沒(méi)有VRBA平板計(jì)數(shù)法高。

VRBA平板計(jì)數(shù)是一種簡(jiǎn)便、靈敏、易于計(jì)數(shù)的方法。該方法具有較高的準(zhǔn)確度。MPN計(jì)數(shù)法是一種以統(tǒng)計(jì)概率為基礎(chǔ)的間接計(jì)數(shù)法，它比VRBA平板計(jì)數(shù)法具有更高的敏感性和精確度。VRBA平板計(jì)數(shù)法和LST多管發(fā)酵方法對(duì)質(zhì)量控制樣品進(jìn)行了檢驗(yàn)，其|z|值都小于2，且效果良好。VRBA平板計(jì)數(shù)的結(jié)果|Z|值較LST多管發(fā)酵法（MPN）測(cè)定的|Z|值較低，與質(zhì)控樣品的特征值相近，兩者之間存在較大的差別，表明VRBA平板計(jì)數(shù)方法的敏感性和精確度較高。

本次研究中采用VRBA平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)后|z|值為0.93，LST多管發(fā)酵法檢測(cè)|z|值為1.451。VRBA平板計(jì)數(shù)法用移液管檢測(cè)|z|值為0.93，使用移液槍檢測(cè)|z|值為0.793。數(shù)據(jù)對(duì)比過(guò)后，VRBA平板計(jì)數(shù)法得出的檢測(cè)結(jié)果比LST多管發(fā)酵法結(jié)果更為準(zhǔn)確。VRBA平板計(jì)數(shù)法使用移液管進(jìn)行檢測(cè)比使用移液槍結(jié)果更為準(zhǔn)確，值得推廣使用［10-12］。

移液管和移液槍是實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)的一種加樣設(shè)備。GB/T4789.3-2003標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，加樣設(shè)備只能采用無(wú)菌式移液管，而GB4789.3-2016中則明確指出，該設(shè)備可以采用移液器，但不能采用無(wú)菌吸管。在質(zhì)量控制樣本中，吸管與吸管的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)吸管的測(cè)量值小于吸液槍?zhuān)瑴y(cè)量的結(jié)果與質(zhì)量控制樣品的特征值相近，并且兩者之間存在明顯的差別，表明采用移液管進(jìn)行測(cè)量更準(zhǔn)確。