驢源腸道乳酸細(xì)菌的篩選及生物學(xué)特性研究

左立康，黃 榮，羅 康，王同浩，董洪圣，王長法，馬青山

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院、山東省黑毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)工程技術(shù)研究中心、山東省驢產(chǎn)業(yè)科技協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 聊城 252059)

0 引言

目前，我國畜牧業(yè)正處于“飼料禁抗”的關(guān)鍵時刻，對“替抗”、“減抗”相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品具有旺盛的需求。益生菌因其能夠促進(jìn)動物生長、提高飼料利用率[1]，調(diào)節(jié)動物腸道菌群和免疫機(jī)能[2]，預(yù)防腹瀉發(fā)生[3，4]，且具有綠色、安全等方面特點，被認(rèn)為是畜禽飼料中極具潛力的促生長抗生素替代品。養(yǎng)殖中常用的益生菌菌種包括乳酸細(xì)菌、芽孢桿菌和酵母菌類等，其中以乳酸細(xì)菌為主。然而，實驗室篩得的菌種在養(yǎng)殖試驗驗證過程中，其功能往往不能較好的重現(xiàn)，這主要是由于實驗室篩選益生菌的條件或許同其應(yīng)用的環(huán)境有所區(qū)別，從而使益生菌應(yīng)用后在靶位點難以生長、定植及發(fā)揮功能[5]，因此，篩選來自同源動物的腸道土著益生菌種就顯得尤為重要。

驢產(chǎn)業(yè)是我國的特色畜牧業(yè)，也是關(guān)鍵的扶貧民生產(chǎn)業(yè)，然而，在集約化養(yǎng)殖模式下腹瀉是影響犢驢駒成活率的主要因素之一，也已成為驢養(yǎng)殖業(yè)中的一大難點[6]。應(yīng)用抗生素僅對大腸桿菌引起的腹瀉有治療效果但對應(yīng)激源等因素引發(fā)的腹瀉效果不佳，且存在產(chǎn)生耐藥菌及二次感染的風(fēng)險[7]，通過應(yīng)用益生菌制劑，尤其是乳酸菌制劑能夠減少應(yīng)用抗生素帶來的負(fù)面影響[8-10]，但源自驢腸道的益生菌菌種資源還較為匱乏，制約了驢用益生菌制劑的開發(fā)和應(yīng)用。因此，本研究基于原位/宿主益生菌策略(Autochthonous/Host-associated probiotic)從健康驢腸道中篩選乳酸細(xì)菌，并對其生物特性進(jìn)行研究，為開發(fā)驢用微生態(tài)制劑提供候選菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及供試菌株

試驗樣品來自山東省德州市禹城惠民驢場2歲德州驢直腸內(nèi)容物。試驗選用的指示菌株由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院分離并保存，2種供試菌株為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

1.2 主要培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉粉8 g，葡萄糖20 g，酵母粉4 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸錳0.04 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌30 min；

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

水解淀粉酶培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基1000 mL，可溶性淀粉2 g，瓊脂20 g。

Tween-80培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，CaCl20.01 g，NaCl 0.5 g，Tween-80 1.0 g，瓊脂1.5～2.5 g。

1.3 乳酸菌的分離與純化及形態(tài)觀察

取1 g驢腸道內(nèi)容物樣品于離心管中，加入9 mL無菌蒸餾水，振蕩搖勻。10倍稀釋，稀釋梯度為10-1～10-8。取不同稀釋度稀釋液100 μL均勻涂布于MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取表面光滑、菌落凸起、四周平整、乳白色、菌落直徑1.0～1.5 mm的單菌落，分區(qū)劃線接種于MRS平板上。純化3代，獲得菌種加入30%甘油，-80 ℃冰箱保存。

挑取純化培養(yǎng)24 h的單菌落涂片，革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)特征，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》選取革蘭染色為陽性、形態(tài)為桿狀或者球狀的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定及安全性分析

純化的菌種采用正向引物P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物P2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)合成，進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2× PCR mix 30 μL，引物各2.5 μL，菌液2 μL，ddH2O 23 μL。PCR程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠(含有萬分之一濃度的SYBR?Green I)上電泳30 min，紫外燈下觀察，確定產(chǎn)物PCR成功并達(dá)到要求后，將PCR產(chǎn)物送交上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行同源性分析。

將受試菌點接于哥倫比亞兔血瓊脂平板(青島，海博生物)，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察是否有溶血圈以及溶血圈類別。

1.5 乳酸菌生長曲線與產(chǎn)酸能力測定

生長曲線測定：將菌液在MRS液體培養(yǎng)基中按1%比例接種，37 ℃培養(yǎng)，每2 h取樣一次，分光光度計測其OD600值，繪制生長曲線。

產(chǎn)酸能力測定：將菌液在MRS肉湯中按1%比例接種，37 ℃培養(yǎng)，每6 h取樣一次，通過pH儀測其pH值，繪制菌株產(chǎn)酸曲線。

1.6 乳酸菌的產(chǎn)酶能力分析

產(chǎn)淀粉酶試驗：將受試菌接種于水解淀粉酶培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。滴加碘液，顯色，為防止光分解，5 min內(nèi)觀察。

脂肪酶試驗：將受試菌接種于Tween-80培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，室溫再培養(yǎng)1～2天。觀察是否有沉淀圈。

1.7 乳酸菌的耐受性研究

耐酸性試驗：利用0.5 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH值，分別為2、3、4、5、6、7、8、9，121 ℃滅菌30 min后，按1%比例接入待測乳酸菌種子液，設(shè)置3個重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)24 h，分光光度計測其OD600值。

耐膽鹽性試驗：配制含豬膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min后，按1%比例接入待測乳酸菌種子液，設(shè)置3個重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)24 h，分光光度計測其OD600值。

1.8 乳酸菌的抑菌性試驗

以實驗室保藏的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，采用國標(biāo)濾紙片法進(jìn)行乳酸菌的抑菌試驗[11]。指示菌為經(jīng)過37 ℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，與生理鹽水 1∶9稀釋，渦旋器混勻后涂布LB平板，加入載有待測乳酸菌的濾紙片。37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察指示菌生長情況，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果

分離菌株在MRS平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落呈不透明灰白色、表面光滑凸起、邊緣整齊、直徑1 mm左右大小的圓形(圖1)。革蘭氏染色陽性，顯微鏡鏡檢觀察菌株HR-03為圓形或橢圓形(圖2)。

圖1 菌株HR-03在MRS平板上的菌落形態(tài)

圖2 菌株HR-03革蘭氏染色結(jié)果

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

測序結(jié)果在NCBI Blast網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較，菌株HR-03同屎腸球菌同源性高于99%，結(jié)合進(jìn)化樹分析可知(圖3)，菌株HR-03鑒定為屎腸球菌。

圖3 通過16SrDNA核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 分離菌的安全性試驗

如圖4所示，點接分離的四株受試菌于兔血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，無溶血圈，菌株具有較好的安全性。

圖4 分離菌在兔血瓊脂平板上產(chǎn)生溶血圈情況

2.4 生長特性和產(chǎn)酸能力試驗結(jié)果

如圖5、6所示，屎腸球菌HR-03在0～6 h迅速生長，6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，pH值迅速下降；12 h后進(jìn)入生長平緩期，pH值也逐步趨于穩(wěn)定，最終菌珠HR-03發(fā)酵上清液pH值為4.57。

圖5 菌株HR-03的生長曲線

2.5 乳酸菌的產(chǎn)酶能力分析

將受試菌分別接種于水解淀粉培養(yǎng)基和Tween-80培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，未觀察到透明圈和沉淀圈，菌株HR-03無產(chǎn)淀粉酶和脂肪酶能力。

圖6 菌株HR-03的產(chǎn)酸曲線

2.6 乳酸菌的耐受性研究

2.6.1 耐酸性。由圖7可知，菌株HR-03在pH值為2～9的MRS肉湯中均能存活，其中在pH 6～7之間OD600值最高，表明屎腸球菌HR-03最適生長pH值為6～7。在pH值為2～5之間菌株HR-03的OD600值隨著pH值的降低而明顯下降，表明酸性環(huán)境對菌株HR-03的生長有抑制作用，但仍有細(xì)菌生長。由此可見，菌株HR-03具有較強的耐酸性能。

圖7 不同pH值對菌株HR-03生長的影響

2.6.2 耐膽鹽性。由圖8可知，屎腸球菌HR-03能夠耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%的豬膽鹽，其OD600值也隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降，表明高濃度的膽鹽對菌株HR-03的生長有抑制作用，當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.30%時，菌株的OD600值仍在0.7左右，由此可見，菌株HR-03具有良好的耐膽鹽能力。

圖8 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽對菌株HR-03生長的影響

2.7 乳酸菌的抑菌試驗

如圖9所示，屎腸球菌HR-03對大腸桿菌抑菌圈直徑為12 mm，有較強抑制作用；而對金黃色葡萄球菌沒有產(chǎn)生抑菌圈，無抑制作用。

圖9 菌株HR-03對大腸桿菌抑制結(jié)果

3 討論

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是動物腸道中正常菌群的重要組成部分，定植于動物腸道黏膜表面可降低腸道內(nèi)pH值、抑制病原菌生長、減少體內(nèi)毒素含量，維持腸道健康、提高動物免疫能力[12-15]。屎腸球菌作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖已有多年歷史，其優(yōu)良性能已得到廣大畜牧生產(chǎn)者的認(rèn)可。然而，在畜牧生產(chǎn)中往往出現(xiàn)乳酸菌等益生菌應(yīng)用效果不穩(wěn)定等情況發(fā)生，這一方面或許是由于乳酸菌不耐高溫，導(dǎo)致產(chǎn)品中乳酸菌活菌數(shù)波動較大，從而影響應(yīng)用效果[16]；另一方面主要是由于非同源菌株很難定植在動物腸道內(nèi)，或是定殖后因為各種因素?zé)o法發(fā)揮理想效果[5]，章文明等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，同源益生菌對動物更加安全，效果更為穩(wěn)定，由此可見，篩選動物同源益生菌菌種，并對其特性進(jìn)行研究對于開發(fā)新的益生菌制劑至關(guān)重要。

本研究從健康德州驢腸道內(nèi)容物中分離純化得到一株乳酸菌HR-03，利用形態(tài)特征觀察、分子生物學(xué)手段鑒定為屎腸球菌，并對其安全性能、生長性能、產(chǎn)酸性能、產(chǎn)酶性能、耐受性能及抑菌特性等進(jìn)行了初步研究，獲得安全性高、耐受性好且具有抑制病原菌性能的屎腸球菌HR-03，可作為后續(xù)開發(fā)驢源益生菌制劑的候選菌種。以往研究中，篩選驢源益生菌的研究報道較為有限，王卓等[18]從驢腸道內(nèi)分離鑒定出羅伊氏乳桿菌，并對其安全性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明分離的乳酸菌對小鼠安全，而且能夠增強小鼠免疫力，這同本試驗中篩選的屎腸球菌無潛在致病性結(jié)果一致；劉宇等[19]也從驢糞便樣本中分離出具有較好安全性的干酪乳桿菌LV1，并對其生長性能、pH耐受性進(jìn)行了研究，但并未對篩選菌種的產(chǎn)酶、抑菌等性能進(jìn)行分析。

作為飼喂養(yǎng)殖動物的益生菌，能否耐受胃酸和膽鹽是衡量一個菌種性能是否優(yōu)良的重要指標(biāo)。以往研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌具有較好的耐酸性，Guerra等[20]研究表明屎腸球菌CECT410在pH=2.0的條件下可以存活；盧冰霞等[21]從健康雞盲腸中分離出1株屎腸球菌J4，該菌株在pH值為2.0的條件下也可存活。同以上結(jié)果一致，本試驗分離的屎腸球菌HR-03在pH值為2.0的條件下也能存活，且在pH值為4.0的MRS肉湯中培養(yǎng)24 h后，其OD600值仍在0.3以上，表明此菌株具有較好的的耐酸性。膽鹽有助于脂肪的消化，可促進(jìn)脂肪酸和維生素的吸收，但對微生物具有抑殺作用。研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌對膽鹽也具有較好的耐受性，王煒宏等[22]分離出的1株屎腸球菌，用含膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的MRS肉湯處理后，菌株存活率仍能保持在50%以上。本試驗中分離出的屎腸球菌HR-03也具有較好的膽鹽耐受性，同以往研究結(jié)果一致。

菌種的產(chǎn)酶、抑菌等特性同益生菌制劑的能否發(fā)揮作用有重要關(guān)系。以往研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌具有較好的抑菌活性但產(chǎn)酶活性較低，Valenzuela等[23]研究發(fā)現(xiàn)，分離的屎腸球菌對金黃色葡萄球菌和李斯特菌具有較好的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)屎腸球菌HR-03對致病性大腸桿菌有明顯抑制作用，抑菌圈直徑為12 mm，但對金黃色葡萄球菌沒有抑制效果，這或許同不同屎腸球菌菌株產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物有關(guān)。另外，Zeyner等[24]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼喂屎腸球菌SF68后，可以明顯抑制腸道內(nèi)致病性大腸桿菌的生長，這同本研究結(jié)果一致，本研究篩選的驢源屎腸球菌HR-03對致病性大腸桿菌也有明顯抑制作用，而且產(chǎn)酸性能較好，這對于防控大腸桿菌導(dǎo)致的驢駒腹瀉具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究從健康驢腸道內(nèi)容物中，分離篩選得到一株安全性、耐受性良好，且能夠抑制病原性大腸桿菌的屎腸球菌HR-03。作為驢源腸道菌種，有利于在驢腸道內(nèi)定植，可為后續(xù)驢用益生菌制劑研制提供菌種資源。