基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)制作擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶ugt79b2/79b3雙突變體純合株系

滕 霄，郭偉岳, 李 茹，李 攀, 張雨飛, 冀蘆沙

(1. 聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059；2. 聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252059)

CRISPR體系是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)，能抵抗外源DNA侵襲[1]。研究發(fā)現(xiàn)，約90%古細(xì)菌和40%細(xì)菌中含有CRISPR系統(tǒng)[2]。CRISPR體系是由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats, R, 20～50 bp)及間區(qū)序列(spacers, S, 36 bp)間隔成簇排列，其5′端有前導(dǎo)序列(leader, L, 550 bp)和Cas蛋白基因(4～10個(gè))[3]。研究表明，新的RS序列往往會(huì)插入到L序列及其臨近的重復(fù)序列之間[4]。

Makarova等將CRISPR系統(tǒng)分為3種類型：I型系統(tǒng)由Cas1、Cas2及Cas3蛋白共同發(fā)揮基因編輯作用[5]；Ⅱ型系統(tǒng)僅由Cas9蛋白就可以進(jìn)行基因編輯[3]；Ⅲ型系統(tǒng)中Cas6在長(zhǎng)鏈pre-crRNA加工及加工后傳遞發(fā)揮重要作用[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞野生型(Columbia wild-type)，保存于聊城大學(xué)藥學(xué)院植物培養(yǎng)室。

菌株與載體：大腸桿菌E. coli DH5α、農(nóng)桿菌GV3101均由本實(shí)驗(yàn)保存；克隆載體pEASY-T1 Cloning Kit、pEASY-Blunt Cloning Kit均購(gòu)買于北京全式金生物技術(shù)有限公司；gRNA引物、基因序列均由上海生工生物工程有限公司合成、測(cè)序；

儀器：組織研磨儀(Tissuelyser-192)購(gòu)買于上海凈信生物儀器公司；

試劑與耗材：CRISPR/Cas9試劑盒購(gòu)買于江蘇百格生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒及DNA Maker等均分子生物學(xué)耗材均購(gòu)買于大連寶生物(TaKaRa)生物技術(shù)有限公司；DNA提取緩沖液購(gòu)買于美國(guó)賽默飛公司；甲醇、乙醇等有機(jī)試劑均購(gòu)買于北京國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 gRNA引物設(shè)計(jì)

根據(jù)擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)(TheArabidopsisInformation Resource, TAIR)查找擬南芥ugt79b2和ugt79b3的基因組序列號(hào)，分別為AT4G27560和AT4G27570，下載ugt79b2和ugt79b3全長(zhǎng)基因序列，分別設(shè)計(jì)ugt79b2和ugt79b3的sgRNA靶點(diǎn)序列，見(jiàn)表1。

1.3 大腸桿菌DH5α感受態(tài)制備

挑取新鮮活化的大腸桿菌DH5α單菌落，將其接種到LB液體培養(yǎng)基中(5 mL)，37 ℃，220 r/min過(guò)夜搖菌制備種子液；將種子液按照1：100的比例接種到新的LB液體培養(yǎng)基中(50 mL)，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)4～6 h后，紫外分光光度計(jì)測(cè)量菌液濃度，當(dāng)OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，停止振蕩培養(yǎng)；將大腸桿菌培養(yǎng)液冰浴冷卻30 min后，4 ℃，4500 r/min離心20 min，收集菌體；將細(xì)菌細(xì)胞于冰浴冷卻的去離子水中重懸，4 ℃，4500 r/min離心20 min，重懸3次后，將細(xì)菌細(xì)胞懸于冰浴冷卻的甘油中(10%，V/V)；精確量取100 μL細(xì)菌細(xì)胞液于1.5 mL無(wú)菌離心管中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)制備

挑取新鮮活化的農(nóng)桿菌GV3101單菌落，將其接種到LB液體培養(yǎng)基中(5 mL)，28 ℃，200 r/min過(guò)夜搖菌制備種子液；將種子液按照1：100的比例接種到新的LB液體培養(yǎng)基中(50 mL)，28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)8～10 h后，紫外分光光度計(jì)測(cè)量菌液濃度，當(dāng)OD600達(dá)到0.4～0.6時(shí)，停止振蕩培養(yǎng)；將農(nóng)桿菌培養(yǎng)液冰浴冷卻30 min后，4 ℃，4500 r/min離心20 min，收集菌體；將細(xì)菌細(xì)胞于冰浴冷卻的去離子水中重懸，4 ℃，4500 r/min離心20 min，重懸3次后，將細(xì)菌細(xì)胞懸于冰浴冷卻的甘油中(10%，V/V)；精確量取100 μL細(xì)菌細(xì)胞液于1.5 mL無(wú)菌離心管中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ugt79b2/79b3-Cas9載體構(gòu)建

按照表1制備ugt79b2,ugt79b3 Oligo二聚體，20 μL反應(yīng)體系中加入18 μL Anneal Buffer、1 μL cas-ugt79b2-F (10 μmol/L)、1 μL cas-ugt79b2-R(10 μmol/L)或18 μL Anneal Buffer、1 μL cas-ugt79b3-F (10 μmol/L)、1 μL cas-ugt79b3-R(10 μmol/L)。接著95 ℃變性5 min，然后以0.2 ℃/s緩慢降低溫度進(jìn)行退火，直到20 ℃。將上述制備成功的Oligo二聚體與CRISPR/Cas-9載體進(jìn)行連接，具體連接體系如表2所示，25 ℃反應(yīng)1 h。

1) 適當(dāng)放大選擇港口的中轉(zhuǎn)時(shí)間差閾值條件后，由于港口選擇范圍的擴(kuò)大使得港口群內(nèi)某些核心樞紐港的泊位資源壓力得到緩解，非核心樞紐港的泊位資源得到進(jìn)一步利用。

反應(yīng)結(jié)束后，取5.0 μL上述連接體系反應(yīng)液，加入20 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法將連接體系轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。轉(zhuǎn)化液涂布到LB平板中，37 ℃倒置培養(yǎng)1 d，用表1中cas9引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。若菌落PCR呈陽(yáng)性，則搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，并取部分菌液送生物公司測(cè)序。將100%測(cè)序正確陽(yáng)性菌落，一部分置于-80 ℃超低溫冰箱保存，另一部分提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液涂布到含有利福平(50 μg/L)和卡那霉素(50 μg/L)的LB平板中，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，用表1中cas9引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。若菌落PCR呈陽(yáng)性，則搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，一部分置于-80 ℃超低溫冰箱保存，另一部分用于后續(xù)擬南芥花侵染。

1.6 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系如表3所示。

PCR程序：(1) 預(yù)熱：96 ℃預(yù)變性5min；(2) PCR循環(huán)(35～40次)：96 ℃變性50 s，50～60 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s～2 min；(3) 延伸：72 ℃延伸10 min；(4) 4 ℃保存。

1.7 擬南芥花浸染與ugt79b2/79b3-Cas9突變陽(yáng)性株系篩選

將ugt79b2/79b3-Cas9GV3101菌液活化后，采用農(nóng)桿菌蘸花法侵染野生型擬南芥的花序(抽薹約1 cm)，侵染后，過(guò)夜黑暗處理，每隔1周侵染1次，反復(fù)侵染3次。一段時(shí)間后，收集農(nóng)桿菌侵染后的擬南芥種子，并置于卡那霉素(50 μg/L)的MS平板中篩選，長(zhǎng)勢(shì)良好株系為陽(yáng)性植株，移栽到土壤中繼續(xù)培養(yǎng)。三代篩選后，獲得陽(yáng)性純合株系。提取陽(yáng)性純合株系DNA，PCR鑒定陽(yáng)性株系后，進(jìn)一步送生物公司測(cè)序，確定是否突變。

1.8 植物基因組DNA提取

用小剪刀剪取擬南芥幼嫩葉片(1 cm3)一片，置于1.5 mL EP管中；加入直徑2.0 mm的氧化鋯株和100 μL DNA提取緩沖液；混合均勻后，置于組織研磨儀上震蕩破碎10～60 s；4200 r/min 離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管中，4 ℃保存，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增模板。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA靶點(diǎn)序列選擇

從擬南芥信息資源庫(kù)TAIR中下載ugt79b2和ugt79b3全長(zhǎng)基因組序列，二者同源性高達(dá)99%，根據(jù)sgRNA軟件設(shè)計(jì)ugt79b2和ugt79b3的sgRNA靶點(diǎn)序列，多次篩選，最終確定UGT79B2/79B3共同保守靶序列sgRNA(圖1)：GCCAACAAATTGGCTGAGAAAGG；利用該靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，其中擬南芥ugt79b2靶點(diǎn)序列引物Oligo(5′-3′)：cas-ugt79b2-F為CAGAAATGGGTGGTTTGAAGTTTC，cas-ugt79b2-R為AAGACTTGTAGTGACTCTTT

CCAAT；擬南芥ugt79b3靶點(diǎn)序列引物Oligo(5′-3′)cas-ugt79b3-F為CAGAAATGGGTGGTTTGAAGTTTC，cas-ugt79b3-R為GTTTCCTTCGATTTCTCTGGCTG。

2.2 ugt79b2/79b3-Cas9載體構(gòu)建

按照上述方法構(gòu)建ugt79b2/79b3-Cas9載體后，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證ugt79b2/79b3-Cas9陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ugt79b2陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR條帶大小為1368 bp如圖2(a)所示，ugt79b3陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR條帶大小為1362 bp如圖2(a)所示。將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液送生物公司測(cè)序，結(jié)果如圖2(b)所示，測(cè)序結(jié)果與TAIR公布序列一致，100%正確，該結(jié)果表明ugt79b2/79b3-Cas9載體構(gòu)建成功。

注：(a)CRISPR/ugt79b2/79b3-Cas9菌落PCR驗(yàn)證(M：Marker；1：UGT79B2引物驗(yàn)證；2：UGT79B3引物驗(yàn)證)；(b)：CRISPR/ugt79b2/79b3-Cas9菌落基因測(cè)序結(jié)果比對(duì)。圖2 ugt79b2/79b3-Cas9載體構(gòu)建

2.3 ugt79b2-cas9嵌合體篩選

將上述構(gòu)建成功的ugt79b2/79b3-Cas9 GV3101侵染擬南芥，獲得T0代種子，潮霉素篩選后，獲得陽(yáng)性株系99株，分別命名T1-1,T1-2,…,T1-99。提取99株幼苗DNA，以cas9-ugt79b2為引物，送公司測(cè)序，結(jié)果如表4所示，ugt79b2-cas9嵌合體篩選獲得，缺A堿基7株，A堿基替換為G或C堿基12株，A堿基插入3株，缺A、G堿基2株。

表4 ugt79b2-cas9突變體植株

2.4 ugt79b2-Cas9單突變純合體篩選

選取T1代突變株系，繼續(xù)培養(yǎng)，獲得T2代種子，潮霉素篩選后，獲得陽(yáng)性株系24株，分別命名T2-1-1, T2-1-2…T2-2-1, T2-2-2…T2-24-1, T2-24-2…。提取X株幼苗DNA，以cas9-ugt79b2為引物，送公司測(cè)序，結(jié)果如表5所示，ugt79b2-cas9純合突變體選獲得，缺A堿基2株，A堿基替換為G或C堿基3株，A堿基插入1株，缺A、G堿基1株。

表5 ugt79b2-cas9突變純合體植株

2.5 ugt79b2/ugt79b3-Cas9雙突變純合體篩選

提取ugt79b2-Cas9單突變純合體幼苗基因組DNA，以cas9-ugt79b3為引物，送公司測(cè)序，結(jié)果如圖3所示，ugt79b2/ugt79b3-Cas9雙突變純合體篩選獲得1株A堿基插入突變，用于后續(xù)ugt79b2、ugt79b3功能驗(yàn)證研究。

圖3 ugt79b2/ugt79b3-Cas9雙突變純合體篩選

3 討論

植物糖基轉(zhuǎn)移酶是植物體內(nèi)能夠?qū)⒏鞣N糖基轉(zhuǎn)移到小分子化合物上，如多肽類、激素類以及次級(jí)代謝產(chǎn)物等，改變小分子化合物特性，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的酶類[10]。研究發(fā)現(xiàn)，糖基轉(zhuǎn)移酶參與非生物脅迫、調(diào)節(jié)激素平衡、參與次級(jí)代謝響應(yīng)、參與生物脅迫、參與解毒反應(yīng)、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[11-16]。根據(jù)報(bào)道，糖基轉(zhuǎn)移酶UGT79B2/79B3能夠糖基化次級(jí)代謝物花青素類化合物，超表達(dá)擬南芥表現(xiàn)出抗冷、抗鹽、抗旱等表型[17]。雖然擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT79B2/79B3的基因功能早已被研究，但是植物體內(nèi)代謝平衡是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)獲得ugt79b2/ugt79b3-Cas9雙突變純合體為其他物種中ugt79b2/ugt79b3同源基因雙突變體篩選提供技術(shù)支持。

CRISPR/Cas9是目前唯一優(yōu)先應(yīng)用于基因編輯的Ⅱ型系統(tǒng)。與I型和Ⅲ型系統(tǒng)不同，Ⅱ型系統(tǒng)僅需要2個(gè)RNA元件和1個(gè)Cas蛋白即可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA靶序列的切割[18]。為了進(jìn)一步精簡(jiǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，科研人員將必需元件crRNA與tracrRNA的核心序列合并為一個(gè)sgRNA，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在sgRNA引導(dǎo)下，Cas9蛋白能夠切割雙鏈DNA[19]。隨著CRISPR/Cas9試劑盒的研發(fā)，使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛的用于真核生物內(nèi)源基因編輯，如水稻、棉花、擬南芥、小鼠、斑馬魚、果蠅等[20-25]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由兩大核心技術(shù)組成：(1)構(gòu)建sgRNA-Cas9表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中發(fā)揮基因編輯作用；(2)將合成的sgRNA序列與表達(dá)純化的Cas9蛋白導(dǎo)入到受體細(xì)胞中發(fā)揮切割作用[26]。鏈球菌(Streptococcus pyogenes)中SpCas9蛋白最先被用于基因編輯研究，該蛋白由一個(gè)HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)RuvC-like結(jié)構(gòu)域組成[27]。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別在靶DNA的PAM序列(NGG)上游3個(gè)堿基處對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，形成平末端。真核系統(tǒng)中，還需要在Cas9蛋白中添加一段核定位信號(hào)，以保證該蛋白能夠順利進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮功能。sgRNA是單鏈RNA，約20個(gè)堿基，可以與靶DNA序列互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而引導(dǎo)sgRNA-Cas9復(fù)合物在特定位點(diǎn)上發(fā)生切割[26]。因此，構(gòu)建sgRNA-Cas9表達(dá)載體時(shí)，僅僅需要改變sgRNA中特異位點(diǎn)的識(shí)別序列。本研究中，根據(jù)擬南芥信息資源庫(kù)TAIR中下載ugt79b2和ugt79b3全長(zhǎng)基因組序列，二者同源性高達(dá)99%，sgRNA軟件設(shè)計(jì)ugt79b2和ugt79b3的sgRNA靶點(diǎn)序列，多次篩選，最終確定1條sgRNA序列：GCCAACAAATTGGCTGAGAAAGG；利用該靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，其中擬南芥ugt79b2靶點(diǎn)序列引物Oligo(5′-3′)：cas-ugt79b2-F為CAGAAATGGGTGGTTTGAAGTTTC，cas-ugt79b2-R為AAGACTTGTAGTGACTCTTTCCAAT；擬南芥ugt79b3靶點(diǎn)序列引物Oligo(5′-3′)cas-ugt79b3-F為CAGAAATGGGTGGTTTGAAGTTTC，cas-ugt79b3-R為GTTTCCTTCGATTTCTCTGGCTG。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組編輯應(yīng)用過(guò)程中具有成本低、操作簡(jiǎn)單，且突變效率高等特點(diǎn)，還能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)編輯，在遺傳育種與基因功能研究等領(lǐng)域取得了高速發(fā)展。對(duì)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變株系，科研工作者通過(guò)3種靶點(diǎn)分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。第1種，基于Sanger測(cè)定的靶點(diǎn)分析技術(shù)[28]。研究表明，基于Sanger測(cè)序的靶點(diǎn)分析技術(shù)比較適應(yīng)于簡(jiǎn)單突變的樣品。第2種，基于高通量測(cè)序的靶點(diǎn)分析技術(shù)[29]。當(dāng)植株突變類型同時(shí)涉及簡(jiǎn)單突變、嵌合突變或者一次需要測(cè)量大量靶點(diǎn)突變、解析多倍體物種時(shí)，往往采用基于高通量二代測(cè)序的靶點(diǎn)分析技術(shù)。目前該類技術(shù)包括Cas-analyzer、CRISPR-GA、AGEseq、Hi-TOM和CRISPResso等。第3種，基于非測(cè)序手段的靶點(diǎn)分析技術(shù)。與上述兩種方法相比，基于非測(cè)序手段的靶點(diǎn)分析技術(shù)可以在無(wú)法獲知具體堿基變異序列時(shí)，就能夠非常簡(jiǎn)單地判斷該基因是否編輯成功，包括T7E1(T7 endonuclease 1)法[30]、PCR-RE(PCR/restriction enzyme)法[31]和HRM(High-resolution melting assay)法[32]等。本研究中，我們采用基于Sanger測(cè)序的靶點(diǎn)分析技術(shù)就能分析ugt79b2-cas9嵌合體、ugt79b2-Cas9單突變純合體、ugt79b2/ugt79b3-Cas9雙突變純合體，測(cè)序結(jié)果顯示，ugt79b2-cas9嵌合體篩選獲得，缺A堿基7株，A堿基替換為G或C堿基12株，A堿基插入3株，缺A、G堿基2株；ugt79b2-cas9純合突變體選獲得，缺A堿基2株，A堿基替換為G或C堿基3株，A堿基插入1株，缺A、G堿基1株；ugt79b2/ugt79b3-Cas9雙突變純合體篩選獲得1株A堿基插入突變，用于后續(xù)ugt79b2、ugt79b3功能驗(yàn)證研究。