奶牛乳腺炎診斷方法的綜合分析

王洪海，王海霞，劉麗，張作鵬

（1.大慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村社會(huì)事業(yè)服務(wù)中心，黑龍江大慶 163000；2.黑龍江職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150100；3.山東省青島市城陽(yáng)區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266109）

奶牛乳腺炎，又稱奶牛乳房炎，是奶牛的常見(jiàn)病和多發(fā)病。 奶牛乳腺結(jié)構(gòu)受到物理、化學(xué)或生理因素影響造成損傷，受到細(xì)菌、病毒等微生物的侵襲，引起了奶牛乳腺炎，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 為此，奶牛乳腺炎診療和預(yù)防至關(guān)重要，文獻(xiàn)報(bào)道的奶牛乳腺炎的診斷方法有多種，包括臨床觀察診斷法、體細(xì)胞計(jì)數(shù)法、理化實(shí)驗(yàn)診斷法、微生物培養(yǎng)鑒定、蛋白組學(xué)分析和基因?qū)W檢測(cè)等。 本文綜合分析奶牛乳腺炎診斷方法的特點(diǎn)，旨在選擇操作方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高、檢測(cè)成本較低的診斷方法，為快速檢測(cè)奶牛乳腺炎提供了可行的技術(shù)手段。

1 臨床觀察診斷

奶牛臨床型乳腺炎可通過(guò)觀察奶牛乳房和乳汁的變化來(lái)確定。 發(fā)生臨床型奶牛乳腺炎時(shí)，乳房臨床診斷比較明顯，出現(xiàn)不同程度的發(fā)紅和腫脹，有的甚至乳房發(fā)生變形，乳頭不對(duì)稱，乳房淋巴結(jié)腫大， 觸診乳房部位可見(jiàn)大小不一的腫塊，乳區(qū)溫度具有明顯差異。 臨床型乳腺炎患牛乳汁色澤異常，多數(shù)呈灰色或淡黃色，有的伴有塊狀或絮狀物，有的伴有出血，呈紅色，干奶期乳腺炎有的也呈水樣變化。 個(gè)別牛只也會(huì)出現(xiàn)體溫升高、食欲減退，精神萎靡等全身癥狀。 臨床觀察僅可進(jìn)行奶牛乳腺炎初步診斷。

2 體細(xì)胞計(jì)數(shù)法

奶牛乳汁中的體細(xì)胞來(lái)源牛的體細(xì)胞，主要包括分泌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。 乳腺炎患牛最直接的影響是引起乳汁腫的體細(xì)胞增加， 奶牛乳腺感染病原微生物時(shí)，乳腺的免疫防御機(jī)制被激活，大量的白細(xì)胞透過(guò)乳腺和毛細(xì)血管進(jìn)入乳汁，另外，因微生物感染和損傷脫落的乳腺細(xì)胞也進(jìn)入到乳汁中，引起了乳汁中體細(xì)胞數(shù)量急劇增加。 正常奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)量為2 萬(wàn)～20 萬(wàn)/毫升，超過(guò)50 萬(wàn)/毫升即可被診斷為奶牛乳腺炎。 體細(xì)胞計(jì)數(shù)法分為間接計(jì)數(shù)法和直接計(jì)數(shù)法。 間接法主要是通過(guò)體細(xì)胞裂解產(chǎn)生的凝膠或沉淀，間接計(jì)算出乳中體細(xì)胞數(shù)量，主要以加州乳腺炎檢測(cè)法（CMT）和蘭州乳腺炎檢測(cè)法（LMT）為代表，該方法簡(jiǎn)便、快速、成本低廉。 直接計(jì)數(shù)法是利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)乳中體細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)， 主要是通過(guò)儀器進(jìn)行檢測(cè)，目前，多數(shù)規(guī)模化奶牛場(chǎng)都使用奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定（DHI）進(jìn)行乳脂、乳蛋白和體細(xì)胞檢測(cè)，用于改善飼養(yǎng)方式， 診斷和預(yù)防奶牛乳腺炎，該方法需要專業(yè)儀器，檢測(cè)費(fèi)用較高，普及程度低。

3 理化實(shí)驗(yàn)診斷法

主要是包括乳汁電導(dǎo)率、pH 值和酶活性檢測(cè)。乳腺炎患牛乳中的鈉、氯等離子濃度升高，鉀離子濃度降低，氯化鈉有導(dǎo)電性，乳汁的電導(dǎo)率提高，因此，可通過(guò)檢測(cè)乳中的電導(dǎo)率來(lái)檢測(cè)奶牛乳腺炎。 隨著體細(xì)胞的大量增加，體細(xì)胞分泌的氨基葡萄糖苷酸酶和乳酸脫氫酶也隨著增多，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)酶的活性也可診斷奶牛乳腺炎。奶牛乳汁正常pH 值為6.2～6.6 ， 隨著乳腺中炎性反應(yīng)的發(fā)生，pH 值伴隨升高，呈現(xiàn)出堿性，為此，檢測(cè)乳中pH 值也能夠診斷奶牛乳腺炎。 雖然通過(guò)物理或者化學(xué)方法檢測(cè)乳汁的理化性質(zhì)，診斷奶牛乳腺炎，但是受到飼料配比、胎次和泌乳時(shí)間等影響，理化性質(zhì)變化較大，在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用較少。

4 微生物培養(yǎng)鑒定

據(jù)報(bào)道， 多數(shù)的奶牛乳腺炎發(fā)生都是由病原微生物感染引起的，引起奶牛乳腺炎的常見(jiàn)病原微生物有20 多種，主要包括細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等。乳汁中病原微生物的培養(yǎng)鑒定是細(xì)菌性奶牛乳腺炎診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。主要是通過(guò)采集乳汁樣品接種于適宜的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)、染色、鏡檢、純化等流程進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，利用生化鑒定法對(duì)不同菌種進(jìn)行鑒定，判定病原菌的種類。 該診斷方法工作量大、操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間比較長(zhǎng)，通常情況需要3 天時(shí)間才能完成，容易受主觀影響判斷出假陽(yáng)性結(jié)果。雖然現(xiàn)在可利用全自動(dòng)細(xì)菌分析儀進(jìn)行檢測(cè)，但也費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且成本較高。

5 蛋白組學(xué)分析

隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 又極大豐富奶牛乳腺炎的診斷技術(shù)。利用質(zhì)譜和凝膠電泳方法對(duì)乳腺炎發(fā)病期的相關(guān)蛋白進(jìn)行鑒定，不僅提供了新的治療靶點(diǎn)，更是找了新的診斷性生物標(biāo)記物。 急性期蛋白（APP）是非特異性的先天免疫物質(zhì)，具有消滅感染乳腺的微生物、修復(fù)受損乳腺組織的作用。 奶牛乳腺發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，原本數(shù)量較低APP 的在刺激下，迅速升高，炎癥消失后又恢復(fù)到正常水平。 對(duì)奶牛、山羊等反芻動(dòng)物敏的急性期單位主要是結(jié)合珠蛋白（HP）和血清淀粉樣蛋白A（SAA），據(jù)報(bào)道隨著隱性乳腺炎加重和乳汁SCC 增加， 乳清HP 含量與SCC 呈極顯著正相關(guān)；乳腺炎患牛乳中SAA 含量顯著升高。因此，可利用蛋白組學(xué)技術(shù)檢測(cè)、鑒定奶牛乳汁中急性期蛋白的表達(dá)情況來(lái)診斷奶牛乳腺炎。但是該方法需要較多的實(shí)驗(yàn)儀器，須在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部完成，不適合奶牛場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行診斷。

6 基因?qū)W檢測(cè)

基于基因分析引起奶牛乳腺炎的病原微生物被學(xué)者們研究的越來(lái)越廣泛，主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）、 多重PCR、 熒光定量PCR、16sRNA 基因序列測(cè)定和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等方法檢測(cè)奶牛乳腺炎。 與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)詳細(xì)，基因檢測(cè)具有時(shí)間短、靈敏度高、范圍廣、不受抗生素影響等優(yōu)點(diǎn)，在奶牛乳腺炎診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 單一PCR 和熒光定量PCR 可根據(jù)特定病原微生物設(shè)計(jì)引物， 具有準(zhǔn)確性和敏感性， 但不能進(jìn)行多種病原菌的檢測(cè)， 而多重PCR 可檢測(cè)多種病原菌， 具有廣譜性， 但敏感程度又大大降低， 實(shí)用性不高。 而LAMP 方法彌補(bǔ)了PCR 的缺點(diǎn)， 具有檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和特異性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于奶牛乳腺炎。 16sRNA 測(cè)序主要是依據(jù)病原菌微生物具有16sRNA 基因的結(jié)構(gòu)保守性，基因大小在1500bp， 比較適中， 容易實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，測(cè)序后可明確病原菌的種屬，近年來(lái)，研究者利用微生物培養(yǎng)和16sRNA 測(cè)序相結(jié)合的方式診斷奶牛乳腺炎，取得良好的效果。 日本的Notomi 等人發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），LAMP 是在等溫條件下擴(kuò)增目標(biāo)基因的，不需要PCR 退火變性延伸等反應(yīng)階段，程序簡(jiǎn)單，另外通過(guò)在反應(yīng)體系中加入熒光染料，在直接在紫外照射下觀察，反應(yīng)時(shí)間僅需1 小時(shí)，縮短檢測(cè)時(shí)間， 在水浴鍋內(nèi)可完成實(shí)驗(yàn)， 儀器簡(jiǎn)便。 因此，LAMP 技術(shù)操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，反應(yīng)時(shí)間短，適合對(duì)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)奶牛乳腺炎的主要病原微生物的檢測(cè)， 減少病原菌傳播和抗生素的使用，確保乳品優(yōu)質(zhì)、安全。