松乳菇人工栽培技術(shù)研究

向健偉，徐曉瑩，周 志，1b，黃建國，馬 瓊，1b

（1.湖北民族大學(xué)，a.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實驗室；b.生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000；

2.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715）

松乳菇（Lactarius deliciosus）又稱松樹菌、松毛菌等，為擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目紅菇科乳菇屬的食用菌。松乳菇屬于外生菌根型真菌，不僅味道鮮美，而且具有一定的保健補(bǔ)益作用。但由于其獨(dú)特的生長方式，松乳菇只能與松樹的根系共生形成外生菌根，才能發(fā)育成成熟的子實體，因此松乳菇離體人工栽培有難度。目前市售松乳菇主要以野生采摘為主，而近年來松乳菇的市場需求量不斷增加，野生采摘力度也在加大，這在一定程度上造成了生態(tài)環(huán)境的污染和松乳菇資源的破壞［1］。

隨著野生松乳菇產(chǎn)量的逐年下降，人工栽培松乳菇在未來將成為生產(chǎn)松乳菇的趨勢。野生松乳菇的人工栽培馴化最初見于1940年Elias等［2］研究了生物素與根瘤對根系共生型真菌的生長影響，探究了松乳菇的離體培養(yǎng)技術(shù)。由于松乳菇子實體化過程中特殊的營養(yǎng)需求和生態(tài)需求，松乳菇由菌絲體階段轉(zhuǎn)化為子實體階段仍存在難點(diǎn)。為此，本文從松乳菇培養(yǎng)的生態(tài)分布、營養(yǎng)需求、人工栽培技術(shù)等方面，研究了目前松乳菇人工栽培技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，以期為松乳菇的人工栽培提供新思路。

1 松乳菇生態(tài)需求

1.1 空間分布

松乳菇空間分布范圍廣，在野生環(huán)境中松乳菇需要與松樹根系共生，因此在多年樹齡的松林均可發(fā)現(xiàn)其蹤影。從地理位置看，松乳菇在亞熱帶、溫帶分布較為豐富，尤其在北半球范圍較廣。中國多省份均有松乳菇的分布，總體上主要分布在長江中下游地區(qū)。在云南、貴州、湖北、湖南、安徽等地區(qū)，松乳菇更為常見［3，4］。

1.2 生境需求

松乳菇通常以單生或者群生的方式與松科植物形成共生根系，因此植被類型是影響松乳菇生態(tài)分布的主要因素。通過對松乳菇生長地植被類型的實地調(diào)查結(jié)果來看，在野生松乳菇生長的森林中，植物區(qū)系豐富，表現(xiàn)出喬木、灌木、草本植物、苔蘚的錯綜交雜，在針葉林、針葉闊葉混交林中均有松乳菇分布，但是在這類森林中主要以松屬類植物為主，尤其是馬尾松、黃山松、油松居多［3，4］。松乳菇生長地的降水量、光照、平均溫度也會對松乳菇生長產(chǎn)生影響。相較于正常水分條件，干旱脅迫下的松乳菇菌絲體的生物量有所下降［5］。從外生菌根真菌和宿主植物的共生關(guān)系角度來看，干旱脅迫對松乳菇的生長具有雙重效應(yīng)。一方面，干旱條件會使宿主植物的生長受到抑制，導(dǎo)致宿主提供給真菌的有機(jī)物減少，影響真菌的生長。另一方面，水分的減少會直接影響真菌自身的生長發(fā)育。光照和溫度也會影響松乳菇子實體的生長狀態(tài)，一般在16～20℃，光照適中的地區(qū)更適合松乳菇生長。溫度的高低會影響松乳菇子實體的顏色，光照的強(qiáng)弱會影響松乳菇的出菇量［6］。此外，土壤狀態(tài)也會影響松乳菇的生長和分布。在滿足營養(yǎng)需求的條件下，松乳菇可以在多類型的土壤中發(fā)生。在黃壤、黃棕壤、黃紅壤、石灰土、石英砂巖土上均發(fā)現(xiàn)有松乳菇的存在。Satoshi等［7］發(fā)現(xiàn)在頂部混交林中，共生型的乳菇屬真菌子實體的數(shù)量會隨著土壤有機(jī)質(zhì)沉積厚度的增加而減少。同時，發(fā)生地有苔蘚或其他如松針等地被物存在時，更加有利于子實體的生長，這一點(diǎn)可能與松乳菇子實體化需要合適的濕度條件有關(guān)。

2 松乳菇的營養(yǎng)成分與生理活性

松乳菇味道鮮美，營養(yǎng)豐富。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，松乳菇子實體中粗蛋白、多糖、脂類、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富［8］。松乳菇子實體中還含有大量Mg、Ca、Fe等，是優(yōu)質(zhì)的礦質(zhì)元素來源。松乳菇子實體含有豐富的氨基酸，尤其谷氨酸含量較其他蘑菇高，這也是松乳菇味道鮮美的重要原因之一。

松乳菇具有一定的生理活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)乳菇屬和口蘑屬等外生菌根型真菌具有分泌胞外蛋白酶的能力，Nygren等［9］認(rèn)為胞外蛋白酶活性是外生菌根型真菌的主要生理特性之一。松乳菇含有的多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性，能清除自由基，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［10-13］，在抗腫瘤方面效果顯著。

3 松乳菇菌絲體的培養(yǎng)

松乳菇離體人工栽培就是模擬野生的生態(tài)條件和營養(yǎng)條件，進(jìn)行野生松乳菇的人工馴化，以期脫離共生植物就能產(chǎn)出松乳菇子實體的栽培技術(shù)。人工栽培松乳菇的實現(xiàn)需要建立在明確松乳菇從菌絲體生長階段到子實體階段的營養(yǎng)需求基礎(chǔ)上，目前已經(jīng)有大量的研究工作圍繞松乳菇菌絲體的營養(yǎng)需求展開。

3.1 培養(yǎng)基的選擇

松乳菇菌絲生長較緩慢且組織分離過程中極易被污染，因此篩選合適的培養(yǎng)基配方對組織分離培養(yǎng)菌絲體具有重要意義。PDA培養(yǎng)基被認(rèn)為是培養(yǎng)松乳菇菌絲體的適宜培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的松乳菇菌絲體生長速度快，長勢好。吳連旺等［14］、Li等［15］分別用固體PDA和液體PDA培養(yǎng)基培育不同來源的松乳菇，結(jié)果顯示松乳菇菌絲體在不同PDA培養(yǎng)基上都生長良好。

3.2 營養(yǎng)成分的需求

同大多數(shù)食用菌一樣，松乳菇的生長需要合適的碳源和氮源。松乳菇的碳源譜廣泛，能較好地利用蔗糖、果糖、葡萄糖、淀粉等。Zhang［16］研究了4種外生菌根型真菌在離體培養(yǎng)條件下對氮營養(yǎng)的吸收特性，發(fā)現(xiàn)松乳菇對NH4+-N和Glu-N兩種氮源的吸收效率較高，說明松乳菇能夠有效地利用環(huán)境中的氮源，在貧瘠的土壤中也能生長良好。碳源、氮源和磷源的不同也影響著松乳菇對微量元素的吸收。碳源會影響菌絲體對K、Ca的吸收，氮源會影響菌絲體對Fe、Mn的吸收，而磷源會影響菌絲體對P、Mg、Zn的吸收［17］。這說明在優(yōu)勢碳源、氮源及磷酸鹽含量豐富的地區(qū)，松乳菇能夠更好地生長。因為共生菌根的存在，松乳菇與宿主植物發(fā)生信號分子的傳遞和物質(zhì)交換，研究人員在培養(yǎng)基中添加維生素B1、赤霉素、肌醇等促生長因子來促進(jìn)松乳菇菌絲體的生長。

3.3 添加共聚物培養(yǎng)

所謂添加共聚物培養(yǎng)，就是在松乳菇培養(yǎng)過程中，除了必需的營養(yǎng)物質(zhì)外，添加松樹組織或相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)。在實驗室培養(yǎng)條件下，失去了宿主植物共生的影響，松乳菇很難完成從菌絲體向成熟子實體轉(zhuǎn)化這一過程。為了模擬野生環(huán)境，培養(yǎng)料中添加共聚物成為松乳菇人工栽培的一個新思路。在培養(yǎng)基中添加松木屑［8］、松木土、松根浸出液［18］等共聚物來促進(jìn)松乳菇生長，這種方法在一定程度上能夠促進(jìn)松乳菇菌絲體的生長，但是否促進(jìn)子實體發(fā)育還缺少直接證據(jù)。詹少華［19］以雜樹葉為共聚物來培養(yǎng)松乳菇，通過后期補(bǔ)料的方式成功培育出了較小的松乳菇菇蕾，但未得到成熟子實體?？梢娝扇楣阶訉嶓w的轉(zhuǎn)化過程與成熟過程可能需要不同的營養(yǎng)組分，或松乳菇子實體轉(zhuǎn)化完成后，成熟過程需要某種營養(yǎng)關(guān)鍵因子的持續(xù)供應(yīng)，這在一定程度上加大了松乳菇人工栽培的難度。

4 松乳菇人工栽培現(xiàn)狀

4.1 人工馴化流程

松乳菇的人工栽培需要遵循“母種的獲取-菌絲體擴(kuò)繁-子實體培育”這個傳統(tǒng)步驟。目前主要采用組織分離法和孢子培養(yǎng)法來獲取母種，組織分離方法簡單快捷，是目前主要采用的母種制備方法。在菌絲體培育階段，有觀點(diǎn)認(rèn)為松乳菇的子實體化與松樹根系形成菌根不是必需的，很可能與菌根化的菌絲體生物量有關(guān)。因此通過改變培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件，通過深層液體發(fā)酵等方法來獲得高生物量的松乳菇菌絲體成為一種趨勢。松乳菇子實體培育階段，雖然研究者們進(jìn)行了大量的工作，但是由于松乳菇菌絲體向子實體轉(zhuǎn)化的機(jī)制還不清楚，目前還沒有取得明顯的進(jìn)展。目前松乳菇的子實體培育，主要是通過菌根化種植、菌絲體直接接種等方式進(jìn)行半人工栽培。雖然有松乳菇子實體培育成功的報道，但是培育的子實體數(shù)量少，體積小，由此說明在脫離宿主植物的情況下，實現(xiàn)松乳菇子實體的培育具有可行性，但是完全脫離宿主植物實現(xiàn)人工栽培得到成熟子實體仍有難度。

4.2 松乳菇的菌根化栽培

所謂菌根化就是松乳菇菌絲體與宿主植物幼嫩的短根相接觸，形成共生關(guān)系，從而得到菌根苗的過程［20］。早期的菌根合成就是在實驗室通過利用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基來實現(xiàn)菌根苗的合成［21］，整個過程耗時久且菌根數(shù)量有限。后來Zambonelli等［22］通過不斷改進(jìn)菌絲體培養(yǎng)和菌根化方法，成功在溫室內(nèi)合成菌根苗。菌根化一方面會影響宿主幼根對營養(yǎng)素的吸收，另一方面幼根的快速生長會給松乳菇提供有機(jī)物，菌根化菌絲體生物量和菌絲體侵染程度影響著菌根的生長。利用菌根苗進(jìn)行仿野生栽培也取得了一定成果。通過菌根化方式已經(jīng)成功建立松乳菇菌根苗培育基地和松乳菇菌根人工示范林，可見菌根苗栽培松乳菇是可行的。在新西蘭，松乳菇菌根苗的種植已形成一定規(guī)模，松乳菇半人工種植已經(jīng)成為一個新產(chǎn)業(yè)。從新西蘭南部到北部地區(qū)，種植園在共生栽培3年后獲得了少量松乳菇子實體。在新西蘭南部一個種植園中，連續(xù)6年30株菌根苗每年可生產(chǎn)100 kg以上的松乳菇［23］。雖然種植菌根苗能夠成功得到松乳菇子實體，但是這些技術(shù)并沒有大規(guī)模推廣，說明松乳菇菌根化栽培仍然存在一些技術(shù)難點(diǎn)。

5 松乳菇人工栽培的難點(diǎn)

松乳菇菌根共生體構(gòu)建以后，其菌絲體的延生及菌根的形成和發(fā)展，依賴于菌絲體與植物根系及根系周圍微環(huán)境間的物質(zhì)交換和信息交換。許多小分子及大分子有機(jī)物被分泌到根系周圍土壤中，這些分泌物在調(diào)節(jié)共生關(guān)系及與其他有機(jī)體之間的相互作用時發(fā)揮了極其重要的作用。目前關(guān)于這兩者之間的相互作用鮮有報道，松乳菇與宿主植物之間的物質(zhì)交換和信號傳遞過程還需要深入研究。在分子生物學(xué)層面，松乳菇遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未建立，相關(guān)功能基因的克隆還未開展。Goh等［24］提取了松乳菇菌株的基因組DNA，進(jìn)行了基因組測序，發(fā)現(xiàn)該菌株基因組大小估計為54 Mbp，具有12 753個基因。從龐大的基因組中找出關(guān)鍵控制基因，是揭示松乳菇子實體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。此外，松乳菇子實體不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組有不同的表達(dá)情況，松乳菇不同發(fā)育時期的生物代謝表達(dá)存在一定的差異。相較于幼菇期，成熟期有16 789個差異表達(dá)基因，其中ATP酶、多功能伴侶蛋白等家族基因是松乳菇子實體化各階段高表達(dá)的基因［25］。尋找出控制松乳菇子實體轉(zhuǎn)化和發(fā)育的關(guān)鍵基因?qū)λ扇楣饺斯ぴ耘嗟膶崿F(xiàn)具有重大意義。

6 小結(jié)

松乳菇的人工栽培技術(shù)是一個具有前景的研究課題，一方面松乳菇營養(yǎng)成分豐富，經(jīng)濟(jì)價值高，其人工栽培技術(shù)具有廣闊的市場前景；另一方面，探索松乳菇人工栽培技術(shù)也可對其他外生菌根型真菌的人工馴化提供指導(dǎo)意義。目前，松乳菇的栽培技術(shù)研究僅停留在半人工栽培階段，關(guān)于松乳菇的完全人工離體栽培研究甚少。未來需要對松乳菇的生理生化和生態(tài)學(xué)特征、菌絲體和宿主根系之間的物質(zhì)交換和信號傳遞、松乳菇關(guān)鍵基因的挖掘以及菌根與土壤微環(huán)境間的相互作用等方面進(jìn)行深入研究。將分子生物學(xué)技術(shù)如核苷酸測序技術(shù)、基因組組學(xué)關(guān)聯(lián)分析及生物信息學(xué)技術(shù)與松乳菇的人工栽培技術(shù)緊密結(jié)合起來，必將推動松乳菇人工栽培技術(shù)的發(fā)展。