TIM-3 在常見腫瘤中的表達研究

薛 飛，趙穎海

（廣東醫(yī)科大學(xué)病理系，廣東 湛江 524023）

21 世紀以來，腫瘤免疫興起，免疫治療逐漸得到重視，如阻斷腫瘤負向免疫調(diào)控機制的抗CTLA-4和PD-1 或PDL-1 抗體、嵌合抗原受體T 細胞、腫瘤樹突狀細胞疫苗等逐步展開。針對傳統(tǒng)的CTLA-4、PD-1/PDL-1 等免疫檢查點的阻斷策略已經(jīng)取得較大的成功，現(xiàn)階段迫切需要發(fā)掘和研究新的免疫抑制點。作為新型免疫檢查點之一的TIM-3，其表達及功能為近年來研究熱點之一，已被發(fā)現(xiàn)在多個系統(tǒng)的常見的惡性腫瘤中發(fā)揮作用。目前，檢測TIM-3表達的方法較多，不同研究常常出現(xiàn)多種聯(lián)合檢測方法，并且TIM-3 表達方式多樣。針對TIM-3 的具體表達模式及不同實驗技術(shù)方法檢測下其表達意義是否一致，本文通過分納歸類不同實驗技術(shù)方法檢測下常見腫瘤中TIM-3 表達的狀態(tài)及意義，旨在全面的認識TIM-3。

1 TIM-3 及其配體

TIM 基因家族于2001 年被發(fā)現(xiàn)，在人類中，該基因成員位于5q33.2 染色體帶上，包括HAVCR1、HAVCR2 和TIMD4，分別編碼TIM-1、TIM-3 和TIM-4 分子，其中TIM-3 受到更多關(guān)注。TIM-3 是一種跨膜蛋白，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)由IgV 結(jié)構(gòu)域（含有N-連接糖基化位點）和粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域（含有O-連接糖基化位點）組成，而胞內(nèi)區(qū)為其胞漿尾巴[1]。TIM-3 表達于多種免疫細胞，研究發(fā)現(xiàn)，TIM-3 主要表達于Th1 細胞，另外也可在Th17 細胞、調(diào)節(jié)性T 細胞（Regulatory T cells，Tregs）、CD8+T 細胞、樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）、單核細胞、巨噬細胞和NK 細胞上表達等[2]，在調(diào)節(jié)細胞免疫及先天免疫中起重要作用。目前，已知TIM-3 的配體[3，4]包括半乳糖凝集素-9（Galectin-9，Gal-9），磷脂酰絲氨酸（PtdSer），高遷移率族蛋白1（HMGB-1）及癌胚抗原細胞粘附分子1（CEACAM-1）。GAL-9 廣泛于表達多種細胞，能特異性識別TIM-3 IgV 結(jié)構(gòu)域，最常見的作用是與TIM-3 結(jié)合后通過改變細胞內(nèi)的鈣離子流量，誘導(dǎo)Th1 細胞凋亡，從而抑制腫瘤免疫。PtdSer 常暴露在凋亡細胞的細胞膜上，可識別樹突狀細胞（DC）上的TIM-3，介導(dǎo)抗原交叉提呈。HMGB-1 是由免疫細胞分泌的一種炎癥介質(zhì)，正常情況下，HMGB-1 先與細胞死亡后暴露的核酸結(jié)合，并在與晚期糖基化終產(chǎn)物和Toll 樣受體結(jié)合后，介導(dǎo)內(nèi)化將其運輸至DC 內(nèi)體小泡，從而觸發(fā)免疫反應(yīng)。在腫瘤微環(huán)境中，HMGB1 高表達于腫瘤浸潤性DC，TIM-3 與HMGB1 結(jié)合，阻斷其核酸向內(nèi)體運輸，從而抑制先天免疫反應(yīng)。CEACAM-1 是最新發(fā)現(xiàn)的TIM-3 的配體，可通過順式二聚體相互作用促進TIM-3 的成熟和穩(wěn)定，抑制T 細胞活性，目前被認為在某些抗病毒反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用。

2 不同實驗技術(shù)檢測TIM-3 的表達

2.1 流式細胞術(shù) 流式細胞儀為集光電子物理、光電測量、計算機、細胞熒光化學(xué)、抗體技術(shù)為一體的高科技細胞分析儀，流式細胞術(shù)則是利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)，已知不少研究運用這一技術(shù)檢測TIM-3 的表達。研究發(fā)現(xiàn)，TIM-3 常常在腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）表達上調(diào)。其中，Gao X 等[5]和吉芃等[6]發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancers，NSCLC）中CD4+TIL 上TIM-3 的表達水平與患者生存預(yù)后呈負相關(guān)；Zhou GY 等[7]在研究原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）時也觀察到瘤內(nèi)CD4+和CD8+T 細胞上TIM-3 的表達高于癌旁組織。另外，TIM-3 在腫瘤患者外周血中同樣有表達上調(diào)。Takano S 等[8]檢測胃癌患者腫瘤組織和外周血中CD8+T 細胞表面TIM-3 和PD-1 的表達時發(fā)現(xiàn)，相比于健康對照組，兩者CD8+T 細胞表達PD-1 和TIM-3 均有上調(diào)，其中腫瘤組織內(nèi)PD-1+CD8+T 細胞和TIM-3+CD8+T 細胞數(shù)量明顯多于外周血。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)共表達PD-1 和TIM-3 的CD8+T細胞分泌IFN-γ 的功能顯著低于PD-1-TIM-3-和PD-1+TIM-3-CD8+T 細胞，提示TIM-3 和PD-1 的表達與CD8+T 細胞功能受損相關(guān)。Piao YR 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者外周血CD4+和CD8+T 細胞上TIM-3 的表達均明顯高于良性前列腺增生患者，Zhang W 等[10]研究顯示，膀胱癌患者外周血NK 細胞TIM-3 顯著上調(diào)，TIM-3+NK 細胞毒性顯著降低，TIM-3+NK 細胞頻率越高的患者相應(yīng)腫瘤細胞Gal-9 陽性率越高，并與患者預(yù)后總體呈負相關(guān)。Li XE 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤患者外周血CD3-CD56+NK 細胞數(shù)量明顯減少，不僅如此，TIM-3 在CD3-CD56+NK 細胞和CD14+單核細胞的表達均高于健康對照組，其表達水平與患者腫瘤細胞Ki-67指數(shù)呈正相關(guān)。另外，該研究還表明，TIM-3+NK 細胞分泌IFN-γ 能力明顯降低，TIM-3+單核細胞表現(xiàn)為M2 表型數(shù)量上升，TIM-3 在膠質(zhì)瘤的免疫中起負性調(diào)節(jié)作用?？傊琓IM-3 的高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)，TIM-3 的上調(diào)可能導(dǎo)致相關(guān)免疫細胞功能的受損，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這一點在關(guān)于食管癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、濾泡性細胞淋巴瘤[14]等的研究中也得到了證實。

2.2 免疫組織化學(xué)法 免疫組織化學(xué)通過抗體與所識別的組織或細胞中的抗原成分的特異性結(jié)合來鑒定目標抗原分子，常常由兩個要素組成，即識別組織或細胞中的抗原成分的抗體以及標記于抗體上的示蹤劑。示蹤劑包括酶分子，熒光素分子和重金屬原子等，而根據(jù)示蹤劑的不同可將免疫組織化學(xué)分為免疫熒光、免疫酶技術(shù)、免疫電鏡等。Li Z 等[15]運用免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，HCC 組織中TIL 上TIM-3 的表達明顯高于癌旁組織，同樣表達上調(diào)的還有PD-1，兩者表達呈正相關(guān)，其表達水平與腫瘤的分級顯著相關(guān)。Wang YY 等[16]發(fā)現(xiàn)，TIM-3 與食管胃交界部腺癌患者Siewert 分型密切相關(guān)，TIM-3 主要表達于TIL，TIM-3 和Gal-9（腫瘤細胞上表達）雙陽性者預(yù)后顯然更差。同樣，Liu ZJ 等[17]研究顯示，瘤內(nèi)Gal-9 的表達與TIL 上TIM-3 的表達水平與膠質(zhì)瘤的WHO 分級有關(guān)。TIM-3 不僅可表達于免疫細胞，也可以表達于腫瘤細胞。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌[18]及宮頸癌[19]的研究表明，與癌旁或良性組織對比，TIM-3 既可在TIL 中高表達，也可在腫瘤細胞中過表達。前者展開關(guān)于TIM-3 與錯配修復(fù)蛋白在子宮內(nèi)膜癌的表達研究，其結(jié)果表明，在MLH1 高甲基化、MSH6 缺失和中-高級別組織學(xué)分級的情況下，腫瘤細胞TIM-3 的表達水平明顯增高，提示抗TIM-3 治療在子宮內(nèi)膜癌或林奇綜合征患者中起潛在作用；后者檢測分析TIM-3 與Gal-9 及PDL-1的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)86%的PD-L1 陽性病例，包括100%PD-L1 陽性宮頸鱗癌中存在TIM-3/Gal-9 雙重表達，提示抗TIM-3 與抗PD-1/PD-L1 可能具有協(xié)同作用。在結(jié)直腸癌的相關(guān)研究中，有研究顯示[20]，TIM-3 在腫瘤組織中的表達水平高于正常組織，其表達水平與腫瘤大小、TNM 分期和遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。但Sun QY 等[21]的研究相反，該研究結(jié)合了TIM-3mRNA 的檢測及TIM-3 蛋白水平定量，顯示TIM-3 在結(jié)腸癌組織中的表達低于正常組織和癌旁組織，其與臨床病理參數(shù)的分析表明，TIM-3 表達下調(diào)與大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。類似的爭議還有，如Piao YR 等[9]發(fā)現(xiàn)TIM-3 在前列腺腫瘤組織（含上皮內(nèi)瘤變及腺癌）中的表達明顯高于瘤旁組織，與前列腺特異性抗原水平呈正相關(guān)，TIM-3 高表達提示前列腺癌患者的不良預(yù)后。然而，Wu JL 等[22]研究顯示，TIM-3 表達陰性的轉(zhuǎn)移性前列腺癌和轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌患者的總生存期較短，可作為兩者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素。另外，還有研究表明[23]，TIM-3 在腎細胞癌原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移瘤中的表達與患者較長的無進展生存和總生存期有關(guān)。運用免疫組織化學(xué)法進行TIM-3 研究的常見原發(fā)腫瘤還包括胰腺癌[24]、食管癌[25，26]、口腔癌[27]、頭頸部鱗狀細胞癌[28]、乳腺癌[29]、肺癌[30]等，涵蓋多個系統(tǒng)?？傮w而言，均較一致地顯示TIM-3 在腫瘤組織中的表達高于瘤旁，且與患者TMN 分期呈正相關(guān)，這與運用流式細胞術(shù)檢測TIM-3 的結(jié)果基本相符，但TIM-3 在部分腫瘤的表達及作用仍存在爭議，還需要進一步的研究來驗證。

2.3 聚合酶鏈反應(yīng)/連接酶檢測反應(yīng)（PCR-LDR）基因多態(tài)性又稱遺傳多態(tài)性，是指一個生物群體中同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因。關(guān)于TIM-3 基因多態(tài)性與癌癥風(fēng)險關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)[31]，TIM-3 單核苷酸多態(tài)性與多種人類癌癥的易感性相關(guān)。Cui SJ 等[32]采用PCR-LDR 法檢測TIM-3 的基因多態(tài)性，結(jié)果顯示TIM-3 rs10053538C＞A 等位基因可增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險，并通過調(diào)節(jié)TIM-3 的表達影響患者的預(yù)后。Liu YB 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，TIM-3 rs10053538 和rs10515746 與大腸癌的易感性無關(guān)，然而，rs10053538 的CA+AA 基因型與晚期臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加有關(guān)，攜帶rs10053538 的CA+AA 基因型患者的無病生存期和總生存期明顯短于CC 基因型患者，這一點在Wu JL 等[34]關(guān)于卵巢癌與TIM-3 基因多態(tài)性的關(guān)系的研究得出的結(jié)論基本一致。除此以外，有關(guān)乳腺癌[35]的研究報道，TIM-3 rs10053538GT+TT 基因型不僅增加乳腺癌的遺傳易感性，還與TIM-3 高表達和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。由此可見，越來越多的證據(jù)顯示，TIM-3 基因的多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著一定的聯(lián)系。

2.4 多種聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）目前常用的方法包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）、逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）等，TIM-3 mRNA 的檢測可以較為直觀且準確地反映TIM-3 基因的表達，避免某種情況下基因表達不完全反映在蛋白水平中。檢測標本來源可分為患者的血液、腫瘤病灶或培養(yǎng)的腫瘤細胞系等。Yu MM 等[20]提取腸癌組織和癌旁組織的總RNA 進行RT-qPCR 分析，結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)TIM-3 mRNA 表達水平是癌旁組織的5 倍以上。有學(xué)者[36]系統(tǒng)地研究了與免疫逃逸和T 細胞耗竭有關(guān)的不同基因在結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織、配對的正常組織及血循環(huán)中的表達水平，結(jié)果顯示，盡管結(jié)直腸癌患者循環(huán)中TIM-3 mRNA 表達水平與健康人相似，但腸癌組織中包括TIM-3 在內(nèi)的多個免疫抑制點的mRNA 水平顯著升高，提示患者機體的免疫功能受抑狀態(tài)。另外，研究對比結(jié)直腸癌早期和晚期之間基因表達差異顯示，TIM-3 mRNA 在晚期腫瘤組織中表達升高，提示其在結(jié)直腸癌進展中可能起作用。除此以外，已知在食管癌[12]、卵巢癌[34]、乳腺癌[37]、宮頸癌[38]等多種腫瘤中，腫瘤細胞或TIL 中TIM-3 mRNA 的表達水平均明顯升高，并與腫瘤組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)，與患者的預(yù)后呈負相關(guān)。

2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）通過Western blot 法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，利用抗體進行檢測，可定量或定性確定細胞或組織中蛋白質(zhì)的表達情況。檢測標本常常是腫瘤病灶或培養(yǎng)的腫瘤細胞系。目前已應(yīng)在胃癌[39]、結(jié)直腸癌[20]、乳腺癌[29，37]及宮頸癌[38]等中發(fā)現(xiàn)，TIM-3 表達上調(diào)往往提示患者的預(yù)后不良。

2.6 體外細胞實驗 體外細胞實驗包括細胞遷徙侵襲檢測、Transwell 實驗、細胞凋亡檢測、細胞增殖檢測等，主要應(yīng)用于目標腫瘤細胞系的研究。Cheng SQ等[29]通過AdV-TIM-3 上調(diào)和TIM-3-siRNA 下調(diào)TIM-3 在乳腺癌細胞系中的表達水平，證實TIM-3過表達可促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，而TIM-3 失表達則作用相反，這點與TIM-3 在宮頸癌細胞系[38]中的研究結(jié)論一致。郭艷等[39]研究發(fā)現(xiàn)，TIM-3 在胃癌組織CD4+TIL 細胞中呈高表達狀態(tài)，TIM-3 高表達可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進胃癌AGS 細胞增殖、侵襲，從而促進胃癌進展。淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）也是一種免疫檢查點，作為T細胞穩(wěn)態(tài)的負調(diào)節(jié)因子，常常表達于活化的CD4+、CD8+和NK 細胞，Chen BJ 等[40]將彌漫大B 細胞淋巴瘤細胞系與預(yù)置的T 細胞在抗LAG-3 和抗TIM-3的條件下共培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞死亡率呈劑量依賴性增加，驗證了阻斷TIM-3 或LAG-3 可以誘導(dǎo)CD8+T 細胞的抗淋巴瘤活性?？傊?，通過體外細胞功能實驗同樣證實，TIM-3 至少在多種常見腫瘤的進展中起一定的作用，TIM-3 可作為潛在的預(yù)后標記物。

2.7 動物實驗 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)攜帶實體瘤的小鼠體內(nèi)CD8+TIL 上可表達TIM-3，且同時表達PD-1。PD-1除了作為較早期被發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點之一并與其配體PDL-1 被廣泛研究外，還被認為是慢性疾病中耗竭狀態(tài)T 細胞的一種標記。有研究[41]分離荷瘤小鼠CD8+TIL，并在體外直接檢測其分泌細胞因子的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與TIM-3-PD-1+TIL 和TIM-3-PD-1-TIL 相比，TIM-3+PD-1+TIL 表現(xiàn)出最嚴重的衰竭狀態(tài)，表現(xiàn)為不能增殖和產(chǎn)生IL-2、腫瘤壞死因子和干擾素-γ。已有研究發(fā)現(xiàn)[28]，在TIM3 過表達的Tgfbr1/Pten2cKO 頭頸部鱗狀細胞癌小鼠模型中，抗TIM-3 單抗可通過靶向CD4+TIM-3+細胞和CD8+TIM-3+細胞，減少髓系來源的抑制細胞，恢復(fù)效應(yīng)T細胞功能，有效抑制腫瘤生長。曲美替尼作為一種絲裂原激活的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK）抑制劑，已被證明對晚期黑色素瘤患者有效。Liu Y 等[42]將曲美替尼和抗TIM-3 單克隆抗體（MAb）聯(lián)合治療B16-F10 黑色素瘤小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗TIM-3 單抗可對抗MEK 抑制劑帶來的促TIM-3 表達的作用，通過刺激CD8+T 細胞增強其抗腫瘤免疫功能。上述的動物實驗無一不進一步說明TIM-3 在腫瘤免疫中起負性調(diào)節(jié)作用，TIM-3 靶向治療不容忽視。

3 總結(jié)

在單種或多種不同實驗技術(shù)方法聯(lián)合檢測下，TIM-3 的作用逐漸清晰，其在腫瘤免疫中的作用不可忽視。TIM-3 基因的多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著一定的聯(lián)系，TIM-3 表達（包括蛋白質(zhì)、mRNA）更是涵蓋多個系統(tǒng)常見惡性腫瘤，包括呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、淋巴造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，其表達不限于CD4+T、CD8+T 細胞、NK 細胞等免疫細胞以及部分腫瘤細胞。在這些腫瘤中，TIM-3 往往處于高表達狀態(tài)，通過誘導(dǎo)Th1 細胞凋亡，損害CD8+T細胞及NK 細胞免疫功能，以及與PD-1 共表達加重T 細胞“耗竭狀態(tài)”等途徑對抗腫瘤免疫。盡管目前依然存在一些爭議，但越來越多的研究證實，TIM-3 的高表達往往是惡性腫瘤患者不良預(yù)后的重要因素之一，在未來TIM-3 有望成為評估腫瘤預(yù)后的新指標。