人參黑斑病生防菌的分離鑒定及防效

張 寧，張晶晶，李雅淑，李冉琪，侯 微，曲正義，李亞麗，鄭培和,2*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林 132109）

人參Panax ginseng為五加科人參屬多年生草本植物，是我國歷史悠久的名貴中藥材。現(xiàn)代研究認為人參具有抗疲勞、抗氧化、抗糖尿病及抗癌等作用[1]。人參黑斑病作為人參重要病害之一，直接影響了人參的產(chǎn)量和品質(zhì)。人參黑斑病主要由人參鏈格孢Alternaria panax引起，多發(fā)病于人參葉片，產(chǎn)生灰褐色病斑，導致植株光合作用速率下降，影響其能量積累，造成人參植株提前落葉枯萎、果實干癟甚至使參根減產(chǎn)[2]，常年發(fā)病率為20%～30%，嚴重時可達70%[3]。目前人參病害的防治手段主要是化學防治[4,5]，但病原菌繁殖快，適應性強，容易對化學試劑產(chǎn)生耐藥性[6]，且長期施用化學試劑會引發(fā)藥材農(nóng)藥殘留超標、環(huán)境污染和土壤微生物失衡[7]等系列問題。生物防治安全有效，是綠色可持續(xù)的病害防治手段，對人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

作為生防菌的一大類別，芽胞桿菌具有抗逆性強和抑菌譜廣的特點，可通過調(diào)節(jié)激素促進植物生長，被廣泛應用于植物病害防治。研究表明貝萊斯芽胞桿菌可有效防治馬鈴薯瘡痂病、花生白絹病、小麥紋枯病等多種病害[8-10]。在人參病害防治中也發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliauefaciens對人參銹腐病菌抑菌率可達 80.95%，且能明顯降低人參根際土壤真菌豐度指數(shù)[11]。內(nèi)生芽胞桿菌Bacillus endophyticus對人參立枯病具有較好的防治效果[12]。張曉云等[13]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis對人參黑斑病菌生長具有一定的抑制作用，抑菌率為52.58%。目前，關(guān)于人參黑斑病芽胞桿菌生防菌的研究較少，防治人參黑斑病的貝萊斯芽孢桿菌更是鮮見報道。本研究以人參鏈格孢為靶標菌，對人參根際土壤進行分離篩選，得到一株具有廣譜抗真菌活性的生防菌株YJ 3-7，通過形態(tài)學和生物學方法對其進行了鑒定，并評估了該菌株的抑菌作用和防治效果，旨在豐富人參生防菌資源，為人參黑斑病的生物防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、人參鏈格孢A.panax、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、腐皮鐮刀菌Fusarium solani、土赤殼Ilyonectria mors-panacis、刺盤孢Colletotrichum higginsianum、交鏈格孢Alternaria alternata和細極鏈格孢Alternaria tenuissima，由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所保存。貝萊斯芽胞桿菌B.velezensisYJ 3-7，分離自吉林市左家鎮(zhèn)人參根際土壤。

供試人參種苗：4年生黃果品種人參種苗，購買自吉林省樺甸市。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基用于拮抗作用試驗，LB培養(yǎng)基用于細菌分離和保存。

1.2 拮抗菌的分離純化與篩選

參考許帥等[14]的方法處理土壤樣品，分別取100 μL濃度為10-3、10-4和10-5土壤懸浮液涂布于LB平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑選單菌落平板劃線純化，鏡檢無雜菌后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

以人參鏈格孢為靶標菌，采用平板對峙法[15,16]篩選具有顯著拮抗效果的細菌。在 PDA平板中央接種直徑為5 mm的人參鏈格孢菌餅，在距菌餅20 mm處相對的4點，用接種針點接待測菌株，以不接分離菌株的平板為對照。25 ℃培養(yǎng)觀察抑菌效果，待培養(yǎng)至對照組菌落占培養(yǎng)皿總面積 75%以上，十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌塊直徑）×100。在對峙平板上挑取靶標菌落邊緣菌絲，置于光學顯微鏡下觀察人參鏈格孢菌絲形態(tài)。

1.3 菌株YJ 3-7的鑒定

1.3.1 形態(tài)學觀察 將拮抗菌株在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，25 ℃培養(yǎng)72 h，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色和透明程度，對拮抗菌株進行革蘭氏染色試驗并置于顯微鏡下觀察。

1.3.2 分子生物學鑒定 使用細菌基因組提取試劑盒提取菌株YJ 3-7的基因組DNA，利用細菌通用引物27-F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492-R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）以及 gyrA-F（5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3'）和 gyrA-R（5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3'）PCR擴增YJ 3-7的16S rDNA和gyrA基因序列。PCR反應條件：94 ℃預變形4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，獲得同源序列，使用Mega 7.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株YJ 3-7不同發(fā)酵液對人參鏈格孢生長的抑制作用

挑取菌株YJ 3-7接入LB液體培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h制備菌株YJ 3-7發(fā)酵液，菌體數(shù)量為1×108cfu/mL。將發(fā)酵液室溫10000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌，濾液為無菌發(fā)酵液；將發(fā)酵液室溫10000 r/min離心10 min，收集菌體使用無菌水將菌體重懸，調(diào)整菌懸液濃度為5×107cfu/mL；將發(fā)酵液放置于高壓滅菌鍋，121 ℃、15 min即為滅活發(fā)酵液。分別將發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液、菌懸液和滅活發(fā)酵液以10%的比例添加到PDA培養(yǎng)基中并倒平板，以不添加其他液體的PDA培養(yǎng)基作為對照，每個處理3次重復。待平板凝固后在中央接入直徑5 mm的人參鏈格孢菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)至對照組菌落占培養(yǎng)皿總面積的75%以上，十字交叉法進行測量計算抑菌率。

1.5 菌株YJ 3-7對人參黑斑病的防效測定

1.5.1 離體葉片試驗防效測定 將人參鏈格孢轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃靜置培養(yǎng)15 d備用。在培養(yǎng)皿中鋪一層濕濾紙，放入無菌載玻片，并放置一個濕棉球備用。取人參展葉期新鮮葉片，用75%酒精表面消殺30 s，無菌水沖洗2～3次，超凈工作臺中晾干。使用無菌牙簽對葉片進行創(chuàng)傷處理，每個葉片刺傷 2處，向葉片噴灑菌株YJ 3-7發(fā)酵液，待葉片表面風干后將葉片放置在培養(yǎng)皿中的載玻片上，向刺傷處接種人參鏈格孢4 mm菌餅，封口膜封口。試驗設噴灑無菌水作為對照，每個處理6個重復。于光照培養(yǎng)箱中25 ℃、12 h光暗交替培養(yǎng)6 d，采用十字交叉法記病斑直徑，計算抑菌率。

1.5.2 盆栽試驗防效測定 將人參種苗栽種在直徑21 cm、高15 cm的盆缽中，基質(zhì)配比為草炭土:珍珠巖:蛭石＝5:4:1，每盆3株，溫室培養(yǎng)人參生長至展葉期，選取長勢基本一致的健康人參苗進行試驗。使用無菌牙簽避開葉脈在人參葉片上制造傷口，每個葉片6處，向人參植株均勻噴施菌體數(shù)量為1×108cuf/mL的菌株YJ 3-7發(fā)酵液，至每片處理葉片均滴下液滴。以噴施多菌靈1000倍液作為對照，噴施無菌水作為空白對照，24 h后向葉片傷口處接種10 μL黑斑菌菌絲段懸液（1×106cfu/mL），每組每次處理9株人參植株（約100片葉片），3次重復，接種病原菌后溫室培養(yǎng)10 d統(tǒng)計病害情況。病害分級標準及計算參考劉亞苓等[17]。

1.6 菌株YJ 3-7抑菌譜測定

參照1.2中平板對峙法測定菌株YJ 3-7對其他8種病原菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

從人參根際篩選共分離出細菌 73株，其中菌株YJ 3-7對人參鏈格孢的抑制作用最強（圖1），抑制率達 83.77%。使用顯微鏡觀察對峙平板菌絲和對照菌落菌絲，發(fā)現(xiàn)與正常生長的人參鏈格孢菌絲相比，YJ 3-7對峙培養(yǎng)的人參鏈格孢菌絲細弱，隔膜間的菌絲膨大，整個菌絲呈不規(guī)則彎曲凸起現(xiàn)象（圖2）。

圖1 菌株YJ 3-7對人參鏈格孢的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of YJ 3-7 strain on A.panax

圖2 顯微鏡下菌株YJ 3-7對人參鏈格孢的抑制作用Fig.2 Microscopically inhibiting effect of strain YJ 3-7 on A.panax

2.2 拮抗菌的鑒定

菌株YJ 3-7在LB培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好，菌落呈不透明乳白色，培養(yǎng) 24 h后菌體呈光滑圓斑狀，邊緣規(guī)則，表面濕潤；培養(yǎng)48 h后菌體表面出現(xiàn)粗糙皺褶，邊緣呈不規(guī)則波浪形，挑取時呈黏稠狀（圖 3A）。顯微鏡觀察菌株呈單細胞桿狀，革蘭氏染色呈陽性（圖3B）。

圖3 菌株YJ 3-7在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（A）和菌體顯微鏡形態(tài)（B）Fig.3 Colony morphology of strain YJ 3-7 on LB medium (A)and microscopic morphology (B)

測序獲得菌株YJ 3-7的16S rDNA基因序列1105 bp，gyrA基因序列930 bp。將兩組測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST序列分析發(fā)現(xiàn)，菌株YJ 3-7的 16S rDNA序列與貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensisKKLW（CP054714.1）相似性為98.45%（圖4）；gyrA序列與貝萊斯芽胞桿菌At1（CP041145.1）和 NGN-6（NZ_CP007165.1）相似性均為 99.79%（圖5）。使用MEGA7軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，二者均與貝萊斯芽胞桿菌聚為一類。綜合菌落形態(tài)、革蘭氏染色、16S rDNA和gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株YJ 3-7鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖4 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株YJ 3-7系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YJ 3-7 based on the sequence of 16S rDNA

圖5 基于gyrA基因序列構(gòu)建菌株YJ 3-7系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain YJ 3-7 based on the sequence of gyrA gene

2.3 菌株YJ 3-7不同發(fā)酵液對人參鏈格孢生長的抑制作用

使用添加不同處理的菌株YJ 3-7發(fā)酵液制作的培養(yǎng)基進行抑制試驗，添加菌株YJ 3-7發(fā)酵液和菌懸液的培養(yǎng)基上人參鏈格孢幾乎不生長，抑菌率分別為98.76%和98.27%；添加無菌發(fā)酵液對人參鏈格孢具有較強的抑菌效果，抑菌率達70.62%；添加滅活發(fā)酵液對人參鏈格孢生長抑制能力較弱，抑制率為26.17%（表1）。

表1 菌株YJ 3-7不同發(fā)酵液處理對黑斑病菌的抑制作用Table 1 Inhibition effect of different fermentation broth of strain YJ 3-7 on A.panax

2.4 離體葉片試驗

在接種人參鏈格孢菌餅3 d后，經(jīng)菌株YJ 3-7發(fā)酵液處理的人參葉片未出現(xiàn)明顯病斑，對照組葉片出現(xiàn)黃褐色病斑；接種6 d后，經(jīng)菌株YJ 3-7發(fā)酵液處理的人參葉片病斑較小，病斑直徑為4.13 mm，對照組葉片病斑較大，病斑直徑約11.21 mm。接種6 d后，菌株YJ 3-7發(fā)酵液對人參鏈格孢的抑制率為63.24%，表明菌株YJ 3-7對人參鏈格孢侵染離體葉片具有良好的防治效果（圖6）。

圖6 菌株YJ 3-7發(fā)酵液在人參離體葉片上對人參鏈格孢的抑制效果Fig.6 Inhibitory effect of fermentation broth of strain YJ 3-7 on A.panax on detached leaves of ginseng

2.5 盆栽試驗防效

如表2和圖7所示，菌株YJ 3-7處理組的病情指數(shù)為22.81，略高于多菌靈稀釋液處理組，顯著低于對照組的病情指數(shù)71.11。菌株YJ 3-7和多菌靈1000倍液對人參黑斑病的防效達67.92%和72.81%，表明菌株YJ 3-7對人參黑斑病具有較好的防治效果。

表2 菌株YJ 3-7發(fā)酵液對人參黑斑病的防治效果Table 2 Control efficiency of strain YJ 3-7 fermentation broth on ginseng black spot disease

圖7 菌株YJ 3-7發(fā)酵液對人參黑斑病的防治效果Fig.7 Control efficiency of strain YJ 3-7 fermentation broth on ginseng black spot disease

2.6 抑菌譜測定

平板對峙試驗結(jié)果表明，菌株YJ 3-7對其他8種病原菌均表現(xiàn)出良好的抑制效果（圖8），抑菌率均在 65%以上，其中對刺盤孢的抑制作用最強，抑菌率可達 82.29%，對灰葡萄孢的抑制作用最弱，抑制率為65.73%（表3）。

圖8 菌株YJ 3-7對病原真菌的拮抗作用Fig.8 Antagonism assay of strain YJ 3-7 against fungal phytopathogens

表3 菌株YJ 3-7對病原真菌的拮抗作用Table 3 Antagonism assay of strain YJ 3-7 against fungal phytopathogens

3 討論

近年來，由于化學農(nóng)藥的不合理使用，農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境遭到嚴重破壞，土壤狀況也不容樂觀。隨著全球?qū)沙掷m(xù)發(fā)展的日益重視，生物防治替代化學防控已迫在眉睫[19]。貝萊斯芽胞桿菌與解淀粉芽胞桿菌親緣關(guān)系密切，可以促進植物生長發(fā)育，改善土壤環(huán)境[20,21]，產(chǎn)生細菌素、抗菌肽物質(zhì)限制植物病原菌生長[22,23]。多項研究表示貝萊斯芽胞桿菌可影響病原真菌正常生長代謝，使真菌菌絲出現(xiàn)明顯細弱、扭曲和腫脹現(xiàn)象[24,25]。目前，已有貝萊斯芽胞桿菌在香蕉枯萎病、扁豆枯萎病、葡萄灰霉病和小麥赤霉病等病害防治相關(guān)的研究[26-29]，但貝萊斯芽胞桿菌在人參病害防治方面鮮有報道。本研究從人參根際分離出了一株對人參鏈格孢生長具有抑制作用的菌株YJ 3-7，經(jīng)形態(tài)學觀察、16S rDNA和gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育分析將其鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。菌株YJ 3-7可有效限制人參鏈格孢的生長，使人參鏈格孢菌絲出現(xiàn)明顯扭曲和腫脹現(xiàn)象，抑制率達83.77%，其發(fā)酵液對人參黑斑病菌的也具有明顯的抑制效果，該研究結(jié)果為人參黑斑病的生物防治提供了新的菌種資源。

室內(nèi)平板試驗僅能在一定程度上反應拮抗菌的抑菌效果，其防治能力有待進一步回歸植物，通過向植物接種拮抗菌進行研究。Medhioub等[30]通過離體組織試驗表示貝萊斯芽胞桿菌 OEE1可以降低梨和蘋果火疫病的發(fā)病率；朱娜等[31]使用離體葉片接種實驗測定出解淀粉芽胞桿菌 TS-1203對蘋果葉枯病防效達70.1%；孫旺旺等[32]通過盆栽試驗和大田試驗對拮抗菌防效進行測定，表示貝萊斯芽胞桿菌BPC6對生菜軟腐病具有較好的防治作用。本研究運用離體葉片試驗及盆栽試驗測定菌株YJ 3-7對人參黑斑病的防治效果，結(jié)果表明菌株YJ 3-7發(fā)酵液處理后的人參葉片病斑小、發(fā)病程度輕、發(fā)病率低，盆栽防效達67.92%，略低于多菌靈防效72.81%，說明貝萊斯芽胞桿菌可以有效限制人參葉片上黑斑病菌的生長并對葉片上病斑的擴展具有一定的抑制作用。

本研究以人參鏈格孢為靶標菌從人參根際分離出一株細菌YJ 3-7，可有效抑制人參鏈格孢生長，通過細菌形態(tài)學、系統(tǒng)發(fā)育分析等將菌株YJ 3-7鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。YJ 3-7發(fā)酵液、無菌發(fā)酵液和菌懸液對人參鏈格孢均具有良好的抑制作用，能有效防治人參黑斑病。且該菌株抑菌譜廣，可抑制其他8種植物病原真菌生長，是一株有應用潛力的生防菌株。接下來將進一步探索菌株YJ 3-7的抑菌機制，通過大田試驗檢測拮抗菌實際抑菌效果和抑菌穩(wěn)定性，為生防菌的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。