噴霧誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)在植物真菌病害防治中的研究進(jìn)展

莫 芹，蔣 瑋，陳一帆，呂貝貝

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106）

病原真菌是一類自然界無處不在的微生物，能夠引起多種農(nóng)作物的真菌病害，是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要危害之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前植物病原真菌和類真菌的卵菌能夠造成全球多年生作物20%的產(chǎn)量損失以及果蔬高達(dá)25%的采后損失[1,2]。另外，曲霉屬、青霉菌屬和鐮刀菌屬的真菌也會(huì)造成谷物和食品的真菌毒素污染，甚至威脅動(dòng)物和人類的健康[3]。針對病原真菌的防控策略有殺真菌農(nóng)藥的使用、抗性品種培育、栽培管理和生物防控等，目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上真菌病害的防治主要還是依賴于化學(xué)農(nóng)藥，這也帶來了生態(tài)環(huán)境安全和病害抗藥性等難題，因此開發(fā)新的環(huán)境友好型防控策略逐漸受到研究人員的重視。

基于RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）開發(fā)的生物農(nóng)藥被認(rèn)為是極具潛力的新型植物保護(hù)產(chǎn)品，該技術(shù)在廣泛調(diào)節(jié)植物的基因表達(dá)和病蟲害防治上有很大的應(yīng)用潛力[4]。RNAi技術(shù)是一種真核生物天然存在的保守的細(xì)胞免疫機(jī)制，它由雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）和小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）介導(dǎo)，能夠?qū)е耺RNA的降解和轉(zhuǎn)錄的弱化。目前，RNAi技術(shù)的應(yīng)用大多是基于重組病毒載體和轉(zhuǎn)基因植物載體兩種策略開發(fā)的，這兩種策略分別被稱作為病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）[5]和宿主誘導(dǎo)基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）[6]。2017年美國孟山都公司推出HIGS開發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米SmartStax Pro品種，目前已經(jīng)在美國和加拿大獲得了商業(yè)化種植的批準(zhǔn)[7]。然而，由于多國政府對轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管非常嚴(yán)格，使得轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化成本較高，且部分國家消費(fèi)者對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受程度較低。為了提高RNAi產(chǎn)品的實(shí)用性，研究人員采用一種新的非轉(zhuǎn)基因RNAi策略開發(fā)植物保護(hù)產(chǎn)品，即噴霧誘導(dǎo)基因沉默（spray induced gene silencing，SIGS)技術(shù)。該技術(shù)不是通過重組病毒或者轉(zhuǎn)基因植物的方式，而是通過外源施用dsRNA或siRNA的方式來控制植物內(nèi)源基因或者病原體的靶標(biāo)基因的表達(dá)[8]。基于 SIGS技術(shù)開發(fā)的新型生物農(nóng)藥具有效率高、目標(biāo)特異性強(qiáng)、對環(huán)境友好等特點(diǎn)，是植物病蟲害防控上強(qiáng)有力的工具[9]。

目前，SIGS技術(shù)已經(jīng)被報(bào)道能夠有效防治核盤菌Sclerotinia sclerotiorum、葡萄孢菌Botrytis cinerea、禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum等農(nóng)業(yè)上重要的病原真菌[10]。本文主要針對真菌RNAi機(jī)制、SIGS技術(shù)原理及其在真菌病害防控上的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為基于SIGS開發(fā)防治病原真菌的新型生物農(nóng)藥提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 SIGS技術(shù)的原理

1.1 真菌RNAi機(jī)制

RNAi機(jī)制是真核生物的一種保守機(jī)制，早在1992年粗糙脈孢菌Neurospora crassa的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種由重復(fù)轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的 RNAi現(xiàn)象（被稱為 quelling），但其機(jī)制的解析是在模式動(dòng)物線蟲、果蠅等研究中完成[11]。與動(dòng)物模型相似，真菌RNAi機(jī)制首先由Dicer蛋白切割dsRNA得到大量siRNA來引發(fā)RNAi機(jī)制，這些siRNA被裝載到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex，RISC）中，使得mRNA被 Ago蛋白降解，從而沉默靶標(biāo)基因的表達(dá)。另外，在真菌中還存在由 RNA依賴型 RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）介導(dǎo)的循環(huán)機(jī)制，RdRP能夠從特定的單鏈RNA（ssRNA）或目標(biāo)mRNA產(chǎn)生dsRNA，進(jìn)一步激活或放大沉默反應(yīng)[12]，這也是RNAi技術(shù)在植物保護(hù)中應(yīng)用效率高、潛力大的原因之一。

盡管沉默機(jī)制相似，但目前研究發(fā)現(xiàn)在不同宿主中RNAi的生理功能有所不同，而且仍存在一些功能尚未被報(bào)道。真菌RNAi具有很廣泛的生物學(xué)功能，包括控制轉(zhuǎn)座子活性、參與病毒防御、調(diào)控內(nèi)源性基因、介導(dǎo)異染色質(zhì)的形成、調(diào)節(jié)毒性和抗藥性，以及適應(yīng)環(huán)境壓力條件等[13]。根據(jù)生理功能的需要，目前在真菌中主要發(fā)現(xiàn)兩種RNAi途徑：一種為經(jīng)典的依賴Dicer的RNAi途徑，在絲狀真菌粗糙脈孢菌N.crassa和裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe等模式系統(tǒng)中已有大量研究[14]；另一種為在卷枝毛霉Mucor circinelloides中發(fā)現(xiàn)的非經(jīng)典 RNAi 途徑（Non-Canonical RNAi Pathway，NCRIP），該途徑依賴于RdRP和新型核糖核酸酶Ⅲ類似物R3B2，主要在調(diào)節(jié)毒力和轉(zhuǎn)座子遷移方面發(fā)揮重要作用[15]。

完整的RNAi機(jī)制是SIGS成功控制病原真菌的前提，大多數(shù)真菌都具有RNAi機(jī)制的重要組分，包括Dicer蛋白、Ago蛋白和RdRP。然而，在進(jìn)化過程中有些真菌也丟失了RNAi機(jī)制中的一些關(guān)鍵組分，例如釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因組丟失了Ago1和Dcr1蛋白編碼基因[16]；玉米黑粉菌Ustilago maydis基因組丟失了Ago1、RdRP1-3和Dcr1蛋白編碼基因[17]；以及真菌類隱球菌Crytpococcus deuterogatti基因組分別丟失了Ago1、Ago2、Dcr1和RdRp1蛋白編碼基因[18]。RNAi機(jī)制在真菌進(jìn)化過程中起著非常重要的作用。有學(xué)者認(rèn)為在進(jìn)化過程中RNAi機(jī)制可能對一些真菌的生存不利，它們在丟失RNAi機(jī)制重要組分的同時(shí)可能進(jìn)化出比RNAi更有利生存的其他防御機(jī)制[18]。

1.2 SIGS原理

隨著RNAi機(jī)制的逐步研究，以及HIGS和VIGS技術(shù)在植物害蟲、線蟲、病毒、真菌等病蟲害防控上的成功應(yīng)用，該技術(shù)也逐漸被科學(xué)家認(rèn)可為一種非常有潛力的新型植物保護(hù)技術(shù)[19]。2016年，加州大學(xué)的Wang和Jin[20]研究發(fā)現(xiàn)在植物表面噴灑靶向病原體關(guān)鍵基因的dsRNAs或siRNAs可以有效地保護(hù)作物免受病原菌的侵害，他們將這種策略稱之為SIGS技術(shù)。SIGS技術(shù)是通過非轉(zhuǎn)基因方式將dsRNA傳遞到植物和病原菌中的，是RNAi技術(shù)在植物保護(hù)領(lǐng)域，繼VIGS和HIGS策略之后的應(yīng)用補(bǔ)充。該技術(shù)的原理為：將以病原體關(guān)鍵基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA和/或siRNA噴灑到植物表面，再通過兩種可能的途徑來沉默病原體關(guān)鍵基因。第一種途徑是真菌病原體直接攝取RNA分子進(jìn)而誘導(dǎo)真菌的RNAi。另一種途徑為宿主植物首先攝取RNA分子, dsRNA被植物DCL蛋白切割成siRNA。未剪切的dsRNA和siRNA在真菌侵染過程中被轉(zhuǎn)移到真菌細(xì)胞中，從而誘導(dǎo)真菌的RNAi。兩種情況最后均能降解真菌病原體的mRNA以抵消病原體的毒性或?qū)е虏≡w死亡（圖 1）。一般地，要實(shí)現(xiàn) SIGS技術(shù)進(jìn)行真菌病害防控的目的需要具備兩個(gè)基本條件：一是病原真菌能夠從環(huán)境或寄主中攝取dsRNA，該現(xiàn)象被稱為環(huán)境RNAi（environmental RNAi，eRNAi）或跨界RNAi（cross-kingdom RNAi，cRNAi）；二是病原真菌具有完整的RNAi機(jī)制，使得攝取的dsRNA能夠沉默關(guān)鍵基因的表達(dá)。

圖1 噴霧誘導(dǎo)基因沉默（SIGS）技術(shù)保護(hù)作物對抗真菌病原體Fig.1 Spray-induced gene silencing (SIGS) for crop protection against fungal pathogens

1.3 真菌環(huán)境RNAi、系統(tǒng)性RNAi和跨界RNAi機(jī)制

自1986年Fire和Mello在模式動(dòng)物秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans的研究中提出RNAi的概念[21]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)線蟲也能夠通過取食和浸泡獲得環(huán)境中的dsRNA，并且誘發(fā)細(xì)胞RNAi，他們將這種因環(huán)境中的dsRNA而誘發(fā)的序列特異基因沉默稱之為eRNAi；而RNAi效應(yīng)能夠擴(kuò)散到起初沒有接觸到dsRNA的細(xì)胞和組織中的現(xiàn)象也被稱為系統(tǒng)性RNAi（systemic RNAi，sRNAi）[22]。eRNAi和sRNAi是大多數(shù)動(dòng)植物的普遍現(xiàn)象，與模式線蟲和擬南芥相比，真菌的eRNAi和sRNAi機(jī)制目前研究仍然較少[23]?；蚪M測序分析等工具研究發(fā)現(xiàn)真菌基因組中沒有編碼SID蛋白（一種與線蟲dsRNA攝取相關(guān)的關(guān)鍵蛋白）的同源基因，因此真菌很可能依賴于胞吞作用來促進(jìn)dsRNA的攝取[24,25]。2016年Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)葡萄孢菌B.cinerea能夠吸收熒光標(biāo)記的dsRNA，這是真菌eRNAi的首次報(bào)道，但他們沒有解析其吸收機(jī)理。Wytinck等[27]利用活細(xì)胞成像、轉(zhuǎn)基因真菌培養(yǎng)和內(nèi)吞抑制劑添加等方式確定了真菌菌核病菌S.sclerotiorum的攝取機(jī)制是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用發(fā)生的。雖然沒有識別dsRNA的受體蛋白，但通過RNAi介導(dǎo)的敲除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些網(wǎng)格蛋白、膜結(jié)合蛋白、以及促進(jìn)內(nèi)源性囊泡形成和真菌出芽過程中的蛋白參與了 dsRNA的攝取和加工。此外，胞吞作用對絲狀真菌的生長繁殖和致病性均有重要作用，一些病原真菌可能通過調(diào)節(jié)受體的內(nèi)吞作用從而影響其對植物的致病性[27]。

即使真菌細(xì)胞具有完整的RNAi組分，eRNAi或sRNAi功能的缺失也會(huì)影響SIGS的基因沉默效果，如葉枯病菌Zymoseptoria tritici也具有完整的RNAi核心組分，但仍對dsRNA不敏感[28]；質(zhì)粒介導(dǎo)的dsRNA不能引發(fā)白根腐菌Rosellinia necatrix的sRNAi從而不能利用SIGS技術(shù)達(dá)到很好的根腐病防治效果[29]。真菌對dsRNA的吸收能力是SIGS防控成功與否的關(guān)鍵，不同種屬的病原真菌對dsRNA的吸收能力不同，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，植物病原真菌灰霉病菌B.cinerea、菌核病菌S.sclerotiorum、番茄絲核病菌Rhizoctonia solani、黑曲霉Aspergillus niger和大麗輪枝病菌Verticillium dahliae能夠有效吸收 dsRNA，但炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides不能吸收，而在一種有益真菌綠木霉Trichoderma virens中吸收較弱。局部利用靶向致病菌毒力相關(guān)基因的dsRNA進(jìn)行的SIGS試驗(yàn)結(jié)果表明，SIGS的成功與否很大程度上取決于病原體對RNA的吸收效率[10]。

植物葉片主要通過氣孔和表面?zhèn)谖誨sRNA，但葉片表面存在阻礙吸收的疏水性角質(zhì)層和核酸降解酶，因此植物葉片對dsRNA分子的吸收是極其微量的，這也給SIGS技術(shù)在植物保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用帶來了很大的挑戰(zhàn)[30]，病原真菌在侵染植物時(shí)造成的傷口可能會(huì)輔助植物對 RNA的吸收。植物細(xì)胞能夠通過其RNAi機(jī)制將吸收長鏈的dsRNA加工為21-24 nt的siRNA，并且利用胞間連絲和韌皮部使其在細(xì)胞之間進(jìn)行長距離運(yùn)輸[31]。另外，大量試驗(yàn)證明，植物與真菌之間也存在雙向RNA分子的傳遞現(xiàn)象，這種在不同物種間傳遞的基因沉默被稱為 cRNAi[32-34]。病原真菌在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了類似于效應(yīng)子功能的小 RNA，跨界進(jìn)入寄主植物調(diào)控植物的防衛(wèi)反應(yīng)，從而幫助病菌侵染和定殖，增加致病性。例如灰霉病菌可以產(chǎn)生多種小RNA（Bc-siR3.1、Bc-siR3.2、Bc-siR5和Bc-siR37）來抑制宿主植物的免疫相關(guān)基因[35]；小麥條銹菌能產(chǎn)生Pst-milR1通過cRNAi的方式靶定到寄主小麥的重要抗病基因病程相關(guān)蛋白2（pathogenesis related proteins 2，PR2）[36]。對應(yīng)地，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的dsRNA或siRNA也能進(jìn)入真菌影響真菌生長和致病力，起到保護(hù)植物的作用。目前以HIGS技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因株系能夠有效保護(hù)植物防控多種病原真菌和卵菌，如小麥白粉病菌Blumeria graminis[37]、小麥葉銹菌Puccinia triticinia[38]、鐮刀菌屬Fusariumspp.[39]、致病疫霉Phytophthora infestans[40]、辣椒疫霉Phytophthora capsici[41]等?？梢哉fcRNAi是HIGS技術(shù)在真菌病害防控研究的主要理論依據(jù)。但對于SIGS技術(shù)來說，真菌通過cRNAi方式攝取靶標(biāo)dsRNA或siRNA需要依賴植物對外源dsRNA的吸收效率和RdRP介導(dǎo)的沉默信號放大效應(yīng)，只有積累足夠的siRNA形成系統(tǒng)性，再被真菌攝取后才能有效控制病原。而且，在這個(gè)過程中 dsRNA也隨時(shí)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)外的核酸酶降解。

2 SIGS技術(shù)在植物真菌病害防治中的研究進(jìn)展

目前，SIGS技術(shù)對真菌病害的防治研究對象主要有引起枯萎病的鐮刀菌屬、引起作物和采后果蔬花卉灰霉病的葡萄孢菌、引起莖腐病的菌核病菌、以及一些其他重要病原真菌，詳見表1。早在2013年Francis等[42]就測定了體外合成 dsRNA對兩種主要病原真菌—尖孢鐮刀菌F.oxysporum和黑條葉斑病菌Mycosphaerella fijiensis孢子萌發(fā)的影響，篩選獲得了有效抑制香蕉黑斑病和枯萎病的潛在靶點(diǎn)，但當(dāng)時(shí)篩選到的靶點(diǎn)仍然以HIGS技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因香蕉株系進(jìn)行抗病能力測試。直到2016年SIGS才被證明是一種防控谷物致病菌禾谷鐮刀菌的有效方法。Koch等[43]將同時(shí)靶向 3個(gè)麥角甾醇生物合成基因（CYP51A、CYP51B和CYP51C）的dsRNA噴施到大麥葉片后可以有效地降低3個(gè)靶標(biāo)mRNA的合成，并顯著降低鐮刀菌在寄主植物上的生長。隨后該團(tuán)隊(duì)利用生物信息學(xué)工具優(yōu)化了 dsRNA靶標(biāo)的設(shè)計(jì)來提高其沉默效率，從而進(jìn)一步提高SIGS的抗病效率[44]。2020年，Koch團(tuán)隊(duì)比較了人工設(shè)計(jì)和計(jì)算機(jī)工具設(shè)計(jì)的dsRNA的沉默效率，他們發(fā)現(xiàn)靶向真菌RNAi機(jī)制的關(guān)鍵組分（Ago和Dicer蛋白）可以保護(hù)大麥葉片免受禾谷鐮刀菌感染，而且試驗(yàn)證明基于人工設(shè)計(jì)的 dsRNA具有更高的基因沉默效率。此外，靶向生長關(guān)鍵蛋白（微管蛋白和肌球蛋白）的dsRNA能夠抑制禾谷鐮刀菌的生長，減輕中國南方小麥赤霉病的病害程度[45]。最近的一項(xiàng)研究表明靶向尖孢鐮刀菌生長關(guān)鍵因子（CYP51、Chs1和EF2）的dsRNA以葉面噴霧、葉柄吸附和蘸根方式均能顯著控制病原毒性[46]。

表1 SIGS技術(shù)在真菌病害防治中的研究進(jìn)展Table 1 Research progress on SIGS in the control of fungal pathogens

第二個(gè) SIGS主要研究對象是引起水果、蔬菜和花卉采前/后灰霉病的葡萄孢菌。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)在水果、蔬菜和花卉表面噴施靶向DCL1和DCL2的dsRNA能夠有效抑制病原毒性，與對照相比，接種到水果和蔬菜表面的病灶大小顯著降低。Austein等[47]利用 RNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析來指導(dǎo)dsRNA靶標(biāo)的設(shè)計(jì)，并獲得了有效防治葡萄孢菌侵害的多個(gè)有效靶標(biāo)。在dsRNA傳遞方式的改良上，Nerva等[48]證明以高壓噴涂葉片和莖吸收的方式比普通葉片噴施方式對葡萄灰霉病的防治效果更好。

此外，SIGS技術(shù)在其他重要病原防治上也有大量報(bào)道，例如靶向囊泡運(yùn)輸途徑相關(guān)基因（VPS51+DCTN1+SAC1）的dsRNA能夠有效降低多種病原真菌的病害程度，包括黑曲霉A.niger、絲核病菌R.solani、大麗輪枝病菌V.dahliae等[10]；體外施用靶向幾丁質(zhì)酶編碼基因的siRNA能夠抑制菜豆殼球孢菌Macrophomina phaseolina的菌絲生長[49]；體外合成靶向致病疫霉P.infestans的dsRNA分子能夠有效防治馬鈴薯晚疫病[50]；向大豆葉面直接噴施靶向乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、甘氨酸裂解系統(tǒng)H蛋白和核糖體S16蛋白的dsRNA均能夠減少大豆銹菌Phakopsora pachyrhizi的銹斑數(shù)量和病菌量，進(jìn)而有效防控大豆銹病的發(fā)生[53]。以上這些試驗(yàn)成功案例表明SIGS技術(shù)可以為開發(fā)一種保護(hù)植物免受真菌病害的新工具。

3 SIGS技術(shù)的潛力與挑戰(zhàn)

RNAi技術(shù)在真菌病害防治中的研究多以HIGS技術(shù)進(jìn)行，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIGS技術(shù)能夠?yàn)闊煵?、棉花、香蕉、大麥和小麥等多種作物提供了有效的保護(hù)[54]。雖然HIGS技術(shù)可以為這些植物提供系統(tǒng)水平的抗性，但大多數(shù)作物品種缺乏成熟的轉(zhuǎn)化方法，以及公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受度可能會(huì)限制其在商業(yè)作物中的應(yīng)用。SIGS技術(shù)采用一種更通用的dsRNA傳遞策略，可以應(yīng)用于任何植物，以該技術(shù)開發(fā)的新型核酸農(nóng)藥也是替代傳統(tǒng)農(nóng)藥的可行性方案之一。就防治效率來說，HIGS和SIGS因不同的dsRNA設(shè)計(jì)和不同的目標(biāo)病原可能各有優(yōu)劣。研究證明，在實(shí)驗(yàn)室條件下長度為200～500 nt的dsRNA-CYP51以SIGS技術(shù)防治禾谷鐮刀菌的效率比 HIGS高 30%左右，而隨著其長度的進(jìn)一步增加，兩者的防控效率差異趨平[44]。Hu等[53]研究發(fā)現(xiàn)HIGS和SIGS均能有效防控大豆銹病的發(fā)生。

SIGS作為綠色防控技術(shù)在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面具有很大的優(yōu)勢，與化學(xué)農(nóng)藥相比，具有環(huán)境殘留少、抗藥性發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外基于SIGS的RNA生物農(nóng)藥的開發(fā)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，仍然面臨很多挑戰(zhàn)。首先，真菌SIGS機(jī)制尚未完全清晰闡明。不同病原真菌的RNAi機(jī)制和dsRNA攝取機(jī)制存在進(jìn)化上的差異，且 dsRNA進(jìn)入植物細(xì)胞產(chǎn)生表觀遺傳效應(yīng)也需要進(jìn)一步研究，因此分子靶標(biāo)的設(shè)計(jì)需要進(jìn)一步通過生物信息學(xué)和遺傳學(xué)工具的輔助，例如小RNA測序技術(shù)可能是解析真菌發(fā)病和SIGS機(jī)制與過程的有效工具，能夠幫助設(shè)計(jì)有效防控病原真菌的分子靶標(biāo)。其次，dsRNA的合成成本和遞送效率可能是限制其商業(yè)化應(yīng)用的主要原因。目前用于真菌防控研究的dsRNA分子多以酶合成（MEGA script?RNAi kit）的方法進(jìn)行制備，但該方法價(jià)格高昂不適合田間大規(guī)模應(yīng)用。利用微生物工程菌合成的方法可能是降低dsRNA制備成本的可行性方案，目前大腸桿菌Escherichia coli、釀酒酵母S.cerevisiae和芽胞桿菌Bacillusspp.等多種工程菌被用來大規(guī)模合成dsRNA分子，而dsRNA的成本也從2008年的約1.2萬美元/g，降至2020年的0.5美元/g[55]。此外，dsRNA的遞送技術(shù)也在不斷更新，高壓噴施、莖稈注射、蘸根等方式被證明能提高dsRNA遞送效率[56,57]，通過納米材料包埋等方式也能將dsRNA的防治效果延長到30 d左右[58]，但這些方式和材料在開發(fā)時(shí)也需要考慮成本和可操作性的問題。最后，SIGS技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入到田間應(yīng)用也需要提高脫靶預(yù)測的準(zhǔn)確性和可控性，以便進(jìn)行充分的風(fēng)險(xiǎn)評估。盡管該技術(shù)具有較高的序列特異性，但長dsRNA產(chǎn)生的siRNA仍然有脫靶結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。目前在美國和歐盟的農(nóng)藥和植物保護(hù)產(chǎn)品監(jiān)管框架中，還沒有針對RNA噴劑相關(guān)植物保護(hù)產(chǎn)品的具體數(shù)據(jù)要求[59]。而歐洲食品安全局（EFSA）的一項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)評估也將RNA生物農(nóng)藥分類為安全的，其評價(jià)依據(jù)為可噴灑的RNA對動(dòng)物/人類構(gòu)成的風(fēng)險(xiǎn)很低[60]。Koch等[61]認(rèn)為RNA生物農(nóng)藥（如孟山都和拜耳公司的BioDirectTM技術(shù)）進(jìn)入市場只是時(shí)間問題，因此我國的RNA生物農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估也需要加強(qiáng)，以促進(jìn)其未來的市場定位，同時(shí)也需要盡早開展教育工作和宣傳活動(dòng)，促進(jìn)公眾對該技術(shù)和產(chǎn)品的認(rèn)識和理解。