中國(guó)漢族Wagner綜合征一家系臨床與分子遺傳學(xué)研究

蔡素萍 張達(dá)人 羅小玲 黃龍翔 王婷婷 許婷婷 劉旭陽(yáng),

1暨南大學(xué)附屬深圳眼科醫(yī)院，深圳 518040；2廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心，廈門 361016；3深圳市人民醫(yī)院眼科 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳 518020；4福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，福州 350005；5四川大學(xué)華西廈門醫(yī)院眼科，廈門 361021

Wagner綜合征是一種少見(jiàn)的遺傳性玻璃體視網(wǎng)膜疾病，以玻璃體空腔，玻璃體腔內(nèi)條帶狀、膜狀或網(wǎng)紗狀增生牽引為主要臨床表現(xiàn)，可繼發(fā)視網(wǎng)膜脫離、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮、進(jìn)行性夜盲、近視及早發(fā)白內(nèi)障，其中進(jìn)行性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮和繼發(fā)性視網(wǎng)膜脫離是引起視力嚴(yán)重下降的主要原因[1]。VCAN基因變異可引起Wagner綜合征，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。VCAN基因編碼的Versican蛋白是一種硫酸軟骨素蛋白聚糖，在胚胎發(fā)育中起重要作用，VCAN基因敲除的小鼠在胚胎期致死，說(shuō)明其致病機(jī)制為VCAN基因功能缺失[2-3]。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)Wagner綜合征病例及家系報(bào)道，本研究對(duì)中國(guó)漢族Wagner綜合征一家系的臨床表現(xiàn)及分子遺傳學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

家系信息采集自廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心和福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科。采用家系調(diào)查研究方法，于2020年1月在廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心收集中國(guó)漢族Wagner綜合征一家系共3代13名成員，其中確診患者共5例。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：MR-35-22-002800)，所有受檢者均充分了解本研究目的并自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1全身及眼科檢查 詳細(xì)詢問(wèn)所有受試者病史，全身檢查包括口面部、骨骼、關(guān)節(jié)、肌肉及聽(tīng)力檢查；眼科檢查包括裸眼視力和最佳矯正視力(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)視力表)、非接觸式眼壓計(jì)(TX-20，日本佳能公司)測(cè)量受試者眼壓，裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)情況，直接檢眼鏡、眼底照相(Visucam524，德國(guó)Carl Zeiss公司)、廣角眼底照相(歐寶200，德國(guó)歐寶公司)、光相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)(AngioPlexTMCirrus HD-OCT 5000，德國(guó)Carl Zeiss公司)檢查眼底情況，超聲生物顯微鏡(ultrasound biomicroscope，UBM)(法國(guó)光太公司)檢查眼前節(jié)及房角情況等，家系中已故成員病歷資料由其子女提供。

1.2.2分子遺傳學(xué)分析 基因檢測(cè)及分子遺傳學(xué)分析由暨南大學(xué)附屬深圳眼科醫(yī)院、深圳市人民醫(yī)院、四川大學(xué)華西廈門醫(yī)院共同完成。采用HaploPainter軟件繪制家系圖，并進(jìn)行系譜分析。采集受試者2 ml外周靜脈血于EDTA抗凝管中，提取基因組DNA樣本后，由上海韋翰斯生物醫(yī)藥科技公司對(duì)先證者DNA使用高通量目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)，芯片包含已知玻璃體視網(wǎng)膜疾病的386個(gè)基因，針對(duì)篩選出的變異位點(diǎn)，對(duì)該家系中其他家庭成員進(jìn)行共分離驗(yàn)證。采用美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)網(wǎng)站PredictProtein(https://predictprotein.org)對(duì)VCAN結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Wagner家系遺傳方式及特點(diǎn)

該家系符合Wagner綜合征臨床診斷者共5例(表1)，各代均有發(fā)病，其中男3例，女2例，1例已去世，表型正常者8人。家系中無(wú)近親結(jié)婚史，且3代連續(xù)發(fā)??；男女患者發(fā)病概率無(wú)明顯差別；患者雙親中必有一方患??；若父母雙方均未患病，所有子女均不患病。該家系遺傳模式符合常染色體顯性遺傳(圖1)。

表1 Wagner綜合征家系患者表現(xiàn)型分析Table 1 Phenotype analysis of patients from a Wagner syndrome family患者確診年齡(歲)視力(右眼/左眼)眼部主要表現(xiàn)是否手術(shù)突變位點(diǎn)類型Ⅱ-352均為手動(dòng)/眼前早發(fā)白內(nèi)障、人工晶狀體脫位、玻璃體濃縮、視網(wǎng)膜面紗樣增生膜、色素沉著、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮,虹膜無(wú)前后粘連,無(wú)明顯色素脫失,無(wú)明顯房水閃輝,KP(-)是c.9265+1G>A雜合Ⅱ-551無(wú)光感/0.6早發(fā)白內(nèi)障、視網(wǎng)膜面紗樣增生膜、色素沉著、視網(wǎng)膜脫離及黃斑水腫是c.9265+1G>A雜合Ⅲ-1260.1/0.25前房淺(約1/4 CT)、視網(wǎng)膜面紗樣增生膜、色素沉著、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮是c.9265+1G>A雜合Ⅲ-220未查前房淺(約1/4 CT)、眼底色素沉著否c.9265+1G>A雜合注:KP:角膜后沉著物;CT:角膜厚度Note:KP:keratic precipitate;CT:corneal thickness

圖1 Wagner綜合征家系圖 □：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；/：已故；：先證者Figure 1 Pedigree of a Chinese family with Wagner syndrome □:normal male;○:normal female;■:affected male;●:affected female;/:deceased;:proband

2.2 Wagner綜合征家系患者表型特征

先證者Ⅱ-3，男，52歲，雙眼人工晶狀體脫位。先證者女兒Ⅲ-1自幼雙眼視力差，伴有夜盲，曾因雙眼急性閉角型青光眼(右眼急性發(fā)作期，左眼臨床前期)在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行藥物降眼壓治療。先證者兒子Ⅲ-2夜間視力差，暫未出現(xiàn)其他眼部癥狀。該家系所有患者均無(wú)全身病史和全身異常表現(xiàn)，眼部病變具有以下特點(diǎn)：(1)前房淺(約1/4 CT)，有閉角型青光眼的發(fā)病趨勢(shì)。先證者及其胞弟Ⅱ-5已行白內(nèi)障手術(shù)，其前房狀況不能反映真實(shí)情況，先證者女兒Ⅲ-1和兒子Ⅲ-2雙眼前房淺(圖2)；(2)懸韌帶異常，玻璃體濃縮。先證者擴(kuò)瞳后可見(jiàn)雙眼人工晶狀體向下方移位，上方懸韌帶稀疏，瞳孔區(qū)可見(jiàn)濃縮的玻璃體(圖3)；(3)白內(nèi)障發(fā)病年齡早。家系中先證者及其胞弟Ⅱ-5在約40歲時(shí)已有明顯白內(nèi)障，因二人均已行白內(nèi)障手術(shù)，故無(wú)影像學(xué)資料；(4)視網(wǎng)膜牽拉膜形成。先證者及其女Ⅲ-1眼底均可見(jiàn)明顯的視網(wǎng)膜面紗樣增生膜形成，先證者胞弟Ⅱ-5曾因視網(wǎng)膜脫離行手術(shù)治療，眼底可見(jiàn)增生膜形成，牽拉視網(wǎng)膜，引起神經(jīng)上皮脫離，黃斑水腫(圖4)；(5)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮。先證者及其女Ⅲ-1眼后節(jié)OCT均可見(jiàn)明顯視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮變薄(圖5)；(6)眼底色素沉著。先證者及其胞弟Ⅱ-5、其女Ⅲ-1、其子Ⅲ-2雙眼底均可見(jiàn)不同程度色素沉著；(7)先證者瞳孔欠圓，但無(wú)葡萄膜炎病史，虹膜無(wú)前后粘連及明顯色素脫失，無(wú)明顯房水閃輝，KP(-)。

圖2 患者Ⅲ-1和Ⅲ-2雙眼眼前節(jié)照相 顯示雙眼前房淺 A：患者Ⅲ-1右眼 B：患者Ⅲ-1左眼 C：患者Ⅲ-2右眼 D：患者Ⅲ-2左眼 圖3 先證者Ⅱ-3左眼眼前節(jié)照相 A：人工晶狀體向下方移位 B：上方懸韌帶稀疏，瞳孔區(qū)可見(jiàn)濃縮的玻璃體機(jī)化膜Figure 2 Anterior segment images of both eyes of patients Ⅲ-1 and Ⅲ-2 Anterior chambers were shallow A:right eye of Ⅲ-1 B:left eye of Ⅲ-1 C:right eye of Ⅲ-2 D:left eye of Ⅲ-2 Figure 3 Photograph of the left anterior segment of the proband Ⅱ-3 A:The intraocular lens shifted downward B:The upper suspensory ligament was sparse,and the condensation of organized vitreous membrane was observed in pupil area

圖6 Wagner綜合征患者VCAN基因序列片段 該家系中所有患者VCAN基因上發(fā)現(xiàn)1個(gè)雜合經(jīng)典剪接位點(diǎn)變異c.9265+1G>A，如紅色方框及紅色箭頭所示Figure 6 VCAN gene sequence fragment of patients with Wagner syndrome A heterozygous canonical splicing site variant c.9265+1G>A was found in the VCAN gene of all patients in the family,as shown by the red box and red arrow

圖4 先證者及患者Ⅱ-5、Ⅲ-1彩色眼底照相 先證者及其女兒Ⅲ-1雙眼眼底均可見(jiàn)明顯的視網(wǎng)膜面紗樣增生膜(箭頭)形成及色素沉著；先證者胞弟Ⅱ-5左眼眼底可見(jiàn)增生膜(箭頭)形成及色素沉著 A：先證者右眼 B：先證者左眼 C：先證者女兒Ⅲ-1右眼 D：先證者女兒Ⅲ-1左眼 E：先證者胞弟Ⅱ-5左眼Figure 4 Color fundus images of proband and patients Ⅱ-5,Ⅲ-1 Obvious retinal veil-like proliferative membrane (arrow) was observed in both eyes of the proband and his daughter Ⅲ-1,and pigmentation was seen in their fundus.The proliferative membrane (arrow) and pigmentation was observable in the fundus of the left eye of the proband's younger brother Ⅱ-5 A:right eye of proband B:left eye of proband C:right eye of proband's daughter Ⅲ-1 D:left eye of proband's daughter Ⅲ-1 E:left eye of proband's younger brother Ⅱ-5

圖5 先證者及患者Ⅱ-5、Ⅲ-1黃斑OCT圖像 先證者及其女兒Ⅲ-1均可見(jiàn)雙眼視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜明顯萎縮變??；先證者胞弟Ⅱ-5左眼眼底增生膜牽拉視網(wǎng)膜引起神經(jīng)上皮脫離及黃斑水腫 A：先證者右眼 B：先證者左眼 C：先證者女兒Ⅲ-1右眼 D：先證者女兒Ⅲ-1左眼 E：先證者胞弟Ⅱ-5左眼Figure 5 Macular OCT images of proband and patients Ⅱ-5,Ⅲ-1 Significant atrophy and thinning of the retina and choroid were seen in both eyes of the proband and his daughter Ⅲ-1.Proliferative membrane was observed in the fundus of left eye of Ⅱ-5,the proband's younger brother,stretching the retina and causing neuroepithelial detachment and macular edema A:right eye of proband B:left eye of proband C:right eye of proband's daughter Ⅲ-1 D:left eye of proband's daughter Ⅲ-1 E:left eye of proband's younger brother Ⅱ-5

2.3 基因測(cè)序

高通量目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序和Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)該家系中VCAN基因上的1個(gè)雜合經(jīng)典剪接位點(diǎn)變異c.9265+1G>A，該變異與疾病共分離(圖6)。該變異為罕見(jiàn)變異，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道在Wagner綜合征型玻璃體視網(wǎng)膜病變患者中檢測(cè)到該變異，相關(guān)信息已被收錄在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)和Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)中，在千人基因組、ExAC、gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中均未收錄該變異，ACMG評(píng)級(jí)為PM2。該變異為經(jīng)典剪接變異，可能導(dǎo)致該基因的功能缺失，ACMG評(píng)級(jí)為PVS1。參照ACMG指南，該變異為可能致病性變異。該變異位于剪切位點(diǎn)，通過(guò)蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)，其堿基對(duì)取代可引起截短1 754個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物形成，導(dǎo)致單倍體劑量不足，糖胺聚糖附著位點(diǎn)嚴(yán)重減少，使Versican蛋白功能出現(xiàn)異常。

3 討論

本研究中通過(guò)對(duì)家系成員詳細(xì)的臨床檢查發(fā)現(xiàn)，該Wagner綜合征家系的眼部病變共同特征包括懸韌帶異常、早發(fā)白內(nèi)障、玻璃體空腔、玻璃體濃縮、玻璃體腔中面紗狀增生膜、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮變薄、牽拉性視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜色素沉著。先證者白內(nèi)障術(shù)后出現(xiàn)雙眼人工晶狀體脫位，部分患者還存在淺前房等閉角型青光眼的發(fā)病誘因。Wagner綜合征的癥狀通常在青春期出現(xiàn)，但也可以在幼年時(shí)期開(kāi)始。除該家系所表現(xiàn)出的臨床特征外，有研究者報(bào)道部分Wagner綜合征患者還可出現(xiàn)因黃斑牽拉引起位移產(chǎn)生假性斜視外觀、小眼癥、虹膜萎縮和原始玻璃體持續(xù)增生等臨床表現(xiàn)[4-5]。

Stickler綜合征是一種結(jié)締組織疾病，其眼部特征與Wagner綜合征類似，都存在較典型的玻璃體凝膠結(jié)構(gòu)異常和視網(wǎng)膜改變，不同的是，Wagner綜合征沒(méi)有全身系統(tǒng)性病變，而Stickler綜合征可合并關(guān)節(jié)、頜面部及聽(tīng)力損傷等全身異常[6-7]。但常見(jiàn)的1型Stickler綜合征多數(shù)僅有眼部異常表現(xiàn)[8]，在臨床上不易與Wagner綜合征區(qū)分，需進(jìn)一步行遺傳學(xué)檢查加以鑒別。Wagner綜合征與Stickler綜合征在遺傳學(xué)方面有明顯區(qū)別，前者是由于位于染色體5q的VCAN基因變異導(dǎo)致，幾乎完全外顯[9]，后者則由于位于染色體12q的膠原合成相關(guān)基因變異導(dǎo)致，遺傳方式也較為多樣，最常見(jiàn)的是由COL2A1基因變異引起[10]，還可見(jiàn)于COL11A1、COL11A2、COL9A1、COL9A2及COL9A3等基因[11-14]。Wagner綜合征還需與Jansen綜合征及侵蝕性玻璃體視網(wǎng)膜病變綜合征相鑒別。Jansen綜合征常見(jiàn)臨床表現(xiàn)為視網(wǎng)膜脫離[15]，侵蝕性玻璃體視網(wǎng)膜病變除了與Wagner綜合征有相似的臨床表現(xiàn)外，由于脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮更明顯，可引起進(jìn)行性夜盲和向心性視野縮窄[16]。

Wagner綜合征由VCAN基因變異引起。VCAN有15個(gè)外顯子，編碼一種具有3 396個(gè)氨基酸的大型硫酸軟骨素蛋白聚糖Versican。Versican蛋白在胚胎發(fā)育中起重要作用，VCAN基因敲除的小鼠在胚胎期致死，說(shuō)明其致病機(jī)制為VCAN基因的功能缺失。Versican是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是玻璃體的組成部分，參與維持玻璃體結(jié)構(gòu)的完整性[17]。已知Versican的4種轉(zhuǎn)錄物/同工型蛋白質(zhì)分別是包含2個(gè)外顯子的V0(NM004385.4)、缺乏外顯子7的V1(NM001164097)、缺乏外顯子8的V2(NM001164098)和缺乏外顯子7及外顯子8的V3(NM001126336)[18]，由外顯子7和外顯子8的可變剪接產(chǎn)生，并且在許多組織中表達(dá)，其中包括眼組織[18-19]。這2個(gè)外顯子包含糖胺聚糖附著位點(diǎn)，可支持硫酸軟骨素側(cè)鏈聚集。糖胺聚糖殘基在翻譯后與外顯子7和外顯子8編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相連，這些殘基參與了玻璃體凝膠的形成[17]。迄今為止，所有已被報(bào)道的Wagner綜合征患者基因變異均影響了VCAN基因的保守內(nèi)含子7受體剪接位點(diǎn)或內(nèi)含子8的供體剪接位點(diǎn)[18,20-26]。

目前尚無(wú)研究表明Versican在晶狀體內(nèi)表達(dá)，但在多個(gè)不同VCAN變異位點(diǎn)的Wagner綜合征研究報(bào)道中均存在白內(nèi)障[1-3]，而在國(guó)外與本研究相同的c.9265+1G>A雜合突變家系中亦存在白內(nèi)障這一表型[25-26]，且該突變與表型共分離，因此可認(rèn)為本研究中早發(fā)白內(nèi)障這一表型與VCAN變異密切相關(guān)。該家系基因分析并未發(fā)現(xiàn)與Wagner綜合征及早發(fā)白內(nèi)障這一表型共分離的其他變異位點(diǎn)。因此，目前尚無(wú)其他證據(jù)提示本病是由于其他基因變異引起的早發(fā)白內(nèi)障。然而，也不排除白內(nèi)障表型與VCAN基因相關(guān)其他基因變異有關(guān)的可能性，亦有可能由于玻璃體異常導(dǎo)致了繼發(fā)性晶狀體發(fā)育異常，值得深入研究。

目前雖然尚不能完全解釋W(xué)agner綜合征的確切分子發(fā)病機(jī)制，但很明顯其涉及剪接。內(nèi)含子7剪接受體位點(diǎn)變異可以激活21個(gè)堿基對(duì)的隱蔽剪接位點(diǎn)，使其成為外顯子8的異常轉(zhuǎn)錄本[18,20,24]，有研究報(bào)道在攜帶c.9265+1G>A變異的Wagner綜合征患者的血液中能夠發(fā)現(xiàn)少量該異常轉(zhuǎn)錄本[21]。本研究首次在中國(guó)漢族一家系中確定了VCAN基因c.9265+1G>A變異是該Wagner綜合征分子遺傳學(xué)上的致病原因，定位在外顯子8側(cè)翼的保守剪接位點(diǎn)，并推斷該基因產(chǎn)生變異后持續(xù)降低剪接位點(diǎn)的作用強(qiáng)度，從而促進(jìn)外顯子產(chǎn)生的同工型蛋白V2亞型增加。此前有研究表明，在剪接受體位點(diǎn)(c.4004-1、-2和-5)變異的Wagner綜合征患者V2表達(dá)可增加80倍，能夠進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)[20,22]。V2蛋白具有相當(dāng)數(shù)量的側(cè)鏈，因此，進(jìn)一步探討V2蛋白側(cè)鏈的功能及相互作用有助于解釋該家系眼部表型的機(jī)制，如高發(fā)病率的視網(wǎng)膜脫離或容易引起視網(wǎng)膜脫離的周邊部視網(wǎng)膜病變，以及進(jìn)行性的視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮導(dǎo)致視力嚴(yán)重下降及視功能障礙。本研究家系具有玻璃體濃縮、視網(wǎng)膜增生及牽拉、黃斑病變、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮等Wagner綜合征的較典型臨床表型，與國(guó)外對(duì)該病c.9265+1G>A這一變異位點(diǎn)的相關(guān)研究結(jié)果比較[25-26]，本研究中Wagner綜合征家系的眼前節(jié)相關(guān)癥狀及體征，如淺前房及伴發(fā)急性閉角型青光眼、早發(fā)白內(nèi)障及懸韌帶異常、晶狀體脫位等相關(guān)表型未見(jiàn)報(bào)道。本研究于國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了中國(guó)漢族Wagner綜合征一家系的VCAN基因變異，為該疾病家系臨床表型及基因變異位點(diǎn)提供了更多的數(shù)據(jù)，對(duì)指導(dǎo)Wagner綜合征的診斷具有一定意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明蔡素萍：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)、實(shí)施研究、起草及修改文章；張達(dá)人、王婷婷：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、起草文章；羅小玲：修改文章；黃龍翔：分析和解釋數(shù)據(jù)、起草文章；許婷婷：采集數(shù)據(jù)、起草文章；劉旭陽(yáng)：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)、指導(dǎo)試驗(yàn)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱及定稿