表觀遺傳調(diào)控在視網(wǎng)膜變性疾病中的應(yīng)用

張華 綜述 龐繼景 審校

1四川大學(xué)華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，成都 610041；2沈陽(yáng)何氏眼科醫(yī)院遺傳門診，沈陽(yáng) 110000

表觀遺傳是指在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)和功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致表型的變化。雖然生物遺傳信息主要受DNA序列調(diào)控，但也受表觀遺傳修飾調(diào)控，表觀遺傳調(diào)控方式多樣，機(jī)體中DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)調(diào)控是常見的表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)方式[1]。隨著人類表觀基因組計(jì)劃的深入研究，表觀遺傳學(xué)得到了飛速發(fā)展，目前已成為生物醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。表觀遺傳修飾發(fā)生在癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、眼部疾病等多種人類疾病[2]。廣義的視網(wǎng)膜變性類疾病是一組以視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞等視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性凋亡為主要特征的致盲性眼底疾病，包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、青光眼等。表觀遺傳調(diào)控在視網(wǎng)膜變性疾病中起重要作用。本文將對(duì)主要表觀遺傳調(diào)控方式在視網(wǎng)膜變性疾病中的研究現(xiàn)狀及未來(lái)展望做一介紹。

1 表觀遺傳調(diào)控機(jī)制

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，CpG二核苷酸胞嘧啶5'端共價(jià)結(jié)合1個(gè)甲基基團(tuán)，形成5-甲基胞嘧啶的生物學(xué)過(guò)程。DNA甲基化是目前研究較深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一，也是哺乳動(dòng)物主要的表觀遺傳調(diào)控方式。機(jī)體DNA甲基化主要通過(guò)DNMT催化實(shí)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物主要有2類DNMT，DNMT1維持DNA甲基化酶，主要在DNA復(fù)制過(guò)程中維持DNA甲基化水平；DNMT3是重新DNA甲基化酶，主要形成新的甲基化位點(diǎn)。真核生物中CpG二核苷酸集中的區(qū)域稱為CpG島，CpG島是甲基化的主要作用部位，大多數(shù)基因啟動(dòng)子區(qū)域含有CpG島。DNA甲基化功能取決于CpG二核苷酸的密度及其在基因的精確位置。

組蛋白(histone，H)是染色質(zhì)的最主要蛋白質(zhì)組分，染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元——核小體由2個(gè)H2A、2個(gè)H2B、2個(gè)H3、2個(gè)H4組成的八聚體和147 bp纏繞在外面的DNA組成。組蛋白修飾方式多樣，乙?；悄壳把芯枯^深入的組蛋白修飾方式，組蛋白乙?；饕l(fā)生在H3、H4的N端比較保守的賴氨酸位置上，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)協(xié)調(diào)進(jìn)行，組蛋白乙?；梢哉{(diào)節(jié)染色體組裝、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾過(guò)程。HDAC抑制劑(HDAC inhibitor，HDACi)能引起組蛋白和非組蛋白的高乙?；?，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以減少細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，調(diào)節(jié)各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，增強(qiáng)抗炎反應(yīng)[3]。DNA甲基化和組蛋白修飾可以相互作用，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b與HDAC2或HDAC1可以發(fā)生協(xié)同抑制作用[4]。

NcRNA是指不編碼蛋白質(zhì)或肽的RNA統(tǒng)稱，主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。MiRNA是一類高度保守、長(zhǎng)度為18～24個(gè)堿基的小ncRNA，miRNA可與靶點(diǎn)mRNA的3'非翻譯區(qū)特異結(jié)合，進(jìn)而剪切靶點(diǎn)mRNA并促其降解，抑制轉(zhuǎn)錄；lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)堿基的ncRNA，可與蛋白質(zhì)形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，也可與靶基因轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)鏈干擾mRNA剪切，主要在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5]。MiRNA和lncRNA表達(dá)異?？梢砸l(fā)各種病理過(guò)程，如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及免疫系統(tǒng)疾病等。

2 表觀遺傳調(diào)控與視網(wǎng)膜變性疾病

2.1 DNA甲基化與視網(wǎng)膜變性

DNA甲基化是眼部基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，其在基因表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，是視網(wǎng)膜神經(jīng)元正常發(fā)育和有絲分裂后存活所必須的。異常的甲基化模式與RP、AMD、視網(wǎng)膜細(xì)胞氧化應(yīng)激易感性增強(qiáng)等多種視網(wǎng)膜疾病或病理基礎(chǔ)相關(guān)[6]。DNA甲基化與遺傳因素、環(huán)境因素、生活習(xí)慣密切相關(guān)，嗜煙AMD患者DNA甲基化程度明顯升高[5]。

視網(wǎng)膜細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中光感受器發(fā)生高甲基化，DNA甲基化改變可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜變性過(guò)程中的基因表達(dá)[7]。視網(wǎng)膜中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B特異性敲除，引起視網(wǎng)膜整體甲基化水平明顯降低，外叢狀層變薄，外節(jié)缺失，視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)異常，基因表達(dá)整體失調(diào)，光感受器細(xì)胞明顯減少，突觸前部和突觸后部標(biāo)志物表達(dá)減少[8]。DNMT1缺失引起出生后小鼠視網(wǎng)膜快速變性，影響視網(wǎng)膜神經(jīng)元的生成，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)明顯減少，顯著降低光感受器細(xì)胞分化和存活[9]。

RP模型rd1小鼠光感受器染色質(zhì)異常，甲基化明顯增加，DNMT3A表達(dá)顯著升高，rd1小鼠視網(wǎng)膜中參與細(xì)胞死亡、存活和細(xì)胞形態(tài)及神經(jīng)發(fā)育的基因高甲基化，抑制DNMTs可延緩rd1小鼠視網(wǎng)膜外植體光感受器細(xì)胞變性[10]。AMD患者IL17RC低甲基化，導(dǎo)致視網(wǎng)膜和血液中IL17RC蛋白和mRNA水平顯著升高[11]。AMD患者DNMT1和DNMT3b表達(dá)明顯增加，長(zhǎng)散布核元件1作為老年相關(guān)疾病全局甲基化的替代標(biāo)記，其甲基化水平明顯升高[12]。AMD患者視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞中谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶亞型mu1(glutathione S-transferase isoform mu1，GSTM1)啟動(dòng)子高甲基化，GSTM1和GSTM5的mRNA表達(dá)水平明顯降低，GSTM1和GSTM5在RPE細(xì)胞中的表觀遺傳抑制可能增加AMD患者視網(wǎng)膜對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性[13]。

氧化應(yīng)激和炎癥能夠降低人RPE細(xì)胞的活性，其中氧化應(yīng)激可以降低人RPE細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及SIRT1的表達(dá)和DNMTs的活性，炎癥可以降低DNMT1及SIRT1的表達(dá)和DNMTs及SIRT1的活性[14]。同型半胱氨酸可顯著增加人RPE細(xì)胞和小鼠視網(wǎng)膜的DNA甲基化和組蛋白去乙酰化水平，DNMT和HDAC活性顯著增強(qiáng)，抑制DNA甲基化和組蛋白去乙?；娠@著降低高同型半胱氨酸血癥對(duì)視網(wǎng)膜的影響[15]。

2.2 組蛋白修飾與視網(wǎng)膜變性

RP、DR、青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)缺血性損傷等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭芯^察到組蛋白修飾的變化。組蛋白乙?；侵饕慕M蛋白修飾方式，HDACi根據(jù)不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以分為羥肟酸類、環(huán)肽類、苯甲酰胺類和脂肪酸類；其中視網(wǎng)膜變性疾病中研究較多的是脂肪酸類(如丙戊酸鈉)和羥肟酸類(如曲古抑菌素A)。HDACi在神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療中起重要作用，RP小鼠模型中組蛋白乙?；黠@減少，光感受器變性之前，Ⅰ類和Ⅱ類HDAC過(guò)度激活，凝集素在AMD病理過(guò)程中起抗炎和抑制血管生成作用，HDACi可顯著提高RPE細(xì)胞中凝集素的表達(dá)[16]。在視網(wǎng)膜疾病中，HDACi治療可上調(diào)抗凋亡基因，如熱休克蛋白70的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因，如凋亡蛋白酶活化因子-1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase 3)的表達(dá)，抑制蛋白激酶B、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，Erk)活化，提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡過(guò)程；也可以改變神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的凋亡[17-19]。

丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是一種廣譜HADCi，目前作為抗驚厥藥物廣泛使用，VPA可以改善RP患者視野，延緩視力下降[17]，也可以抑制AMD血管生成和炎癥反應(yīng)[16]。大量研究表明VPA對(duì)RGC具有保護(hù)作用[3]。VPA通過(guò)刺激神經(jīng)元TrkB受體信號(hào)阻止N-甲基-D-天門冬胺酸(N-methyl-d-aspartate，NMDA)誘導(dǎo)的RGC死亡、視網(wǎng)膜變性及視覺功能損傷[20]。谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因缺失的小鼠在不升高眼壓的情況下發(fā)生進(jìn)行性RGC凋亡和視神經(jīng)變性，表現(xiàn)為青光眼特征，VPA治療可抑制此過(guò)程，改善視覺損傷，降低氧化應(yīng)激水平[21]。在缺血-再灌注大鼠模型中，VPA可減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡及RGC軸突損傷[18]。大鼠視神經(jīng)損傷后，VPA治療可以增加RGC存活率和pERK1/2的表達(dá)，抑制caspase 3活性；也可以激活腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和TrkB信號(hào)，抑制RGC凋亡[19,22]。

曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)是一種羥肟酸類，可以抑制類型Ⅰ和Ⅱ HDAC，是視網(wǎng)膜疾病中研究較多的HDACi之一。TSA可以調(diào)節(jié)rd1小鼠過(guò)氧化物酶體增生物激活受體活性，減少rd1小鼠光感受器變性[23]；可以顯著增加cpfl1小鼠視錐光感受器存活率，抑制其變性[24]；可以延緩缺血-再灌注損傷模型視網(wǎng)膜厚度變薄，提高RGC存活率，減少RGC變性[25]；可以減少缺血導(dǎo)致的視網(wǎng)膜內(nèi)層變性，改善ERG a波和b波振幅，降低腫瘤壞死因子α的表達(dá)[26]。脈絡(luò)膜新生血管是AMD的一種致盲性并發(fā)癥，TSA可以抑制脈絡(luò)膜新生血管生成。此外，TSA可以抑制RPE細(xì)胞在G1期的細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而抑制RPE細(xì)胞的增生，促進(jìn)RPE細(xì)胞對(duì)纖粘蛋白的黏附，抑制色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞遷移及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)，下調(diào)促血管生成的缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，上調(diào)抗血管生成和保護(hù)神經(jīng)的血小板源性生長(zhǎng)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制新生血管生成[27]。

其他HDACi也具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。丁酸鈉(sodium butyrate，NaB)廣泛用作動(dòng)物飼料添加劑，在預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮著重要作用。大鼠視神經(jīng)損傷后，NaB治療可促進(jìn)RGC存活，增加ERG反應(yīng)，上調(diào)Akt和Erk的磷酸化水平，增加組蛋白H3K14的乙?；絒19]。Ms-275是一種合成的苯甲酰胺衍生物，選擇性抑制HDAC1、2和3，對(duì)小鼠視神經(jīng)損傷后RGC的分化和存活具有保護(hù)作用[28]。

2.3 NcRNA與視網(wǎng)膜變性

NcRNA在視網(wǎng)膜發(fā)育及視網(wǎng)膜相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用。在RP、AMD、DR、眼部炎癥、病理性血管生成等病變中，特異性miRNA的表達(dá)水平發(fā)生改變[6]。Rd10小鼠桿體中磷酸二酯酶基因β亞基(β subunit of the rod phosphodiesterase gene，Pde6g)第13個(gè)外顯子發(fā)生自發(fā)突變，引起大量miRNA變化顯著，1 900多個(gè)miRNA中，152個(gè)在rd10小鼠視網(wǎng)膜中差異表達(dá)，在變化最顯著的19個(gè)miRNA中，7個(gè)miRNA與視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)，其中miR-3473b、miR-7035-5p和miR-762對(duì)應(yīng)Pde6g的靶點(diǎn)[29]。淀粉樣-β低聚物可引起視網(wǎng)膜變性，其miRNA圖譜中61個(gè)miRNA變化顯著[30]。AMD的確切病因尚不清楚，目前較認(rèn)可的分子機(jī)制有炎癥、氧化應(yīng)激和病理性新生血管生成[31]。MiRNA在AMD免疫炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、病理性血管生成等多種生理病理過(guò)程發(fā)揮重要作用，miR-133、miR-222、miR-889、miR-4258等可以調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子，miR-20、miR-23、miR-24、miR-103等可以調(diào)節(jié)多種血管生成因子，miR-9、miR-146、miR-155、miR-661、miR-3121等可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控AMD的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[32]。AMD患者視網(wǎng)膜中miR-9、miR-125b、miR-146a、miR-155上調(diào)，可導(dǎo)致補(bǔ)體因子H和炎癥調(diào)節(jié)改變，進(jìn)而導(dǎo)致與炎癥和AMD相關(guān)的巨噬細(xì)胞數(shù)量、位置和表型的改變[31]。MiR-25、miR-184等參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激可提高miR-25的表達(dá)，進(jìn)而抑制整合素αV和PEDF的表達(dá)，導(dǎo)致RPE吞噬功能紊亂，引起RPE凋亡和視力損害[33]；抑制miR-184可提高RPE細(xì)胞ezrin蛋白的水平，也可導(dǎo)致溶酶體相關(guān)膜蛋白1下調(diào)，降低RPE吞噬功能[34]。AMD與缺氧密切相關(guān)，AMD患者HIF-1明顯上調(diào)，HIF-1可以活化VEGF的表達(dá)。MiR-17可以調(diào)節(jié)HIF-1和VEGF的基因表達(dá)；AMD患者玻璃體液中miR-152下調(diào)，miR-152可以調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)；miR-126是維持血管結(jié)構(gòu)的必要條件；miR-150可以調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增生和成管過(guò)程[31,33,35]。MiRNA目前已成為AMD的潛在治療靶點(diǎn)，其中，miR-889、miR-4258、miR-661、miR-3121等可能成為臨床上AMD的生物學(xué)標(biāo)志物[32]。

相對(duì)于miRNA，lncRNA在視網(wǎng)膜變性疾病中的研究正處于起步階段，lncRNA可影響視網(wǎng)膜發(fā)育并參與視網(wǎng)膜變性疾病的發(fā)生和發(fā)展。LncRNA也調(diào)節(jié)AMD進(jìn)程，早期AMD患者中共有266個(gè)差異表達(dá)基因，其中64個(gè)是lncRNA，RP11-234O6.2可以調(diào)節(jié)老化RPE細(xì)胞功能，早期AMD中RP11-234O6.2表達(dá)下調(diào)，外源性RP11-234O6.2可提高RPE細(xì)胞的存活率[36]。對(duì)lncRNA母體表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)的抑制可以治療光誘導(dǎo)引起的視網(wǎng)膜變性，光誘導(dǎo)后，MEG3表達(dá)顯著上調(diào)，MEG3沉默可降低促凋亡的caspase 3和caspase 7活性，上調(diào)抗凋亡的bcl-2表達(dá)，進(jìn)而抑制光誘導(dǎo)引起的光感受器細(xì)胞凋亡[37]。MEG3也參與糖尿病相關(guān)的微血管功能障礙，MEG3敲除可增加毛細(xì)血管變性和炎癥，加重視網(wǎng)膜血管功能障礙，體外實(shí)驗(yàn)中，MEG3敲除可以增加視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移和成管[38]。LncRNA ZNF503-AS1位于RPE細(xì)胞胞漿中，可以促進(jìn)RPE細(xì)胞分化，抑制RPE細(xì)胞增生和遷移；ZNF503-AS1由ZNF503反義轉(zhuǎn)錄而來(lái)，可以抑制ZNF503表達(dá)，而ZNF503可抑制RPE細(xì)胞分化，促進(jìn)RPE細(xì)胞增生和遷移[39]。

3 總結(jié)與展望

視網(wǎng)膜變性是致盲的主要原因之一，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜。上世紀(jì)80年代以前，一般把原因不明的視網(wǎng)膜變性，如RP稱為原發(fā)性或特發(fā)性變性，用以和有較明確誘因的其他視網(wǎng)膜變性，如AMD等相區(qū)別。在過(guò)去的30多年里，隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的進(jìn)展，大多數(shù)原因不明的原發(fā)性視網(wǎng)膜變性被發(fā)現(xiàn)和基因突變及由此而產(chǎn)生的功能性蛋白缺失有關(guān)；這類疾病現(xiàn)在也叫遺傳性視網(wǎng)膜變性。雖然每年都有造成視網(wǎng)膜變性的新突變基因被發(fā)現(xiàn)，仍有20%以上的這類臨床表現(xiàn)相似的病人在基因?qū)用嬲也坏街虏≡?。近年?lái)的研究發(fā)現(xiàn)在這些病例中，有一些即使基因的核苷酸序列不發(fā)生突變，其基因的表達(dá)和功能也能發(fā)生可遺傳的改變，并最終導(dǎo)致表型的變化，引起疾病，這是表觀遺傳學(xué)的基礎(chǔ)。

目前研究證實(shí)多種因素可以影響視網(wǎng)膜變性的進(jìn)程。在所有類型的視網(wǎng)膜變性，包括由基因或者其表達(dá)問(wèn)題造成的遺傳性視網(wǎng)膜變性、環(huán)境和/或遺傳等多因素造成的視網(wǎng)膜變性(AMD、青光眼、DR等)中均可能發(fā)生DNA甲基化、組蛋白乙?；cRNA表達(dá)障礙等表觀遺傳變化；某些表觀遺傳藥物，如SAHA等臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行中。表觀遺傳調(diào)控可以改善視網(wǎng)膜基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化與存活，減少細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)及血管生成，減少光感受器變性。然而表觀遺傳調(diào)控治療突變基因明確的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病尚不是首選，因?yàn)閱渭儽碛^遺傳調(diào)控很難徹底改善由基因突變?cè)斐傻牡鞍兹笔?，需要借助基因治療等手段達(dá)到徹底糾正病因的目的[40]。其次，表觀遺傳影響或調(diào)控視網(wǎng)膜變性的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，其在視網(wǎng)膜凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥、新生血管生成等方面的研究較淺，機(jī)制方面有待進(jìn)一步闡明。再次，表觀遺傳存在交互調(diào)控現(xiàn)象，DNA甲基化和組蛋白修飾相互作用引起轉(zhuǎn)錄激活或沉默[4,41]，改變一種表觀遺傳調(diào)控方式，可以引起另一種表觀遺傳調(diào)控方式代償性的改變，這給視網(wǎng)膜變性疾病的治療帶來(lái)不確定因素。表觀遺傳交互調(diào)控視網(wǎng)膜變性疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選是治療的關(guān)鍵所在，同時(shí)，表觀遺傳藥物大多缺乏特異性，這樣無(wú)法有針對(duì)性地進(jìn)行靶向治療。盡管表觀遺傳調(diào)控視網(wǎng)膜變性有待于更充分的探索，但表觀遺傳失調(diào)顯然是視網(wǎng)膜變性的重要原因之一，表觀遺傳調(diào)控可能是多因素造成的視網(wǎng)膜變性疾病的有效治療手段，也是對(duì)不適合基因替代療法的這類患者在治療方法上的補(bǔ)充。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突