QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定全血中10種新型合成大麻素

張志遠(yuǎn)，宋 輝*，李 想，許英健，朱 昱*，王 磊

（1．中國(guó)刑事警察學(xué)院 刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110854；2．新疆喀什市公安局，新疆 喀什 844000）

合成大麻素（Synthetic cannabinoids，SCs）是一類能夠與人體內(nèi)源性大麻素受體CB1或CB2結(jié)合產(chǎn)生生理活性的人工合成化合物，其作用與天然大麻中的四氫大麻酚相似甚至更強(qiáng)，是目前品種最多、數(shù)量最大的新精神活性物質(zhì)（New psychoactive substance，NPS）［1-2］。合成大麻素在世界各地快速蔓延態(tài)勢(shì)日趨嚴(yán)重，且新品種和新物質(zhì)層出不窮、種類繁多。資料顯示［3］，截至2020年底，全世界范圍內(nèi)已鑒定和報(bào)告給聯(lián)合國(guó)毒品和犯罪問(wèn)題辦公室（UNODC）的新精神活性物質(zhì)數(shù)量達(dá)1 047種，而合成大麻素類化合物數(shù)量已達(dá)794種，遠(yuǎn)超芬太尼類（398種）［4］。吸食合成大麻素易產(chǎn)生心跳過(guò)速、血壓升高、胸痛、口齒不清、幻覺(jué)亢奮等副作用，出現(xiàn)自傷自殘等暴力行為［5-7］，甚至?xí)?dǎo)致心肌梗塞或器官衰竭造成死亡［8］。為堅(jiān)決遏制和嚴(yán)厲打擊新型合成大麻素違法犯罪，我國(guó)自2021年7月1日起對(duì)合成大麻素類新精神活性物質(zhì)實(shí)行整類列管［9］。

血液樣本是濫用藥物檢測(cè)最常用的生物檢材之一，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前體內(nèi)藥物毒物分析最重要的檢測(cè)手段。Ong等［10］建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)分析全血中29種合成大麻素的方法，目標(biāo)物主要包括吲哚、吲唑酰胺和萘酰吲哚類合成大麻素，方法檢出限為0．1~6．0 ng/mL；王冠翔等［11］建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析血液中吲唑酰胺類合成大麻素的方法，其中6種合成大麻素的檢出限為0．01~0．05 ng/mL；Krotulski等［12］采用液相色譜-質(zhì)譜分析了血清中84種合成大麻素的凍融穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)合成大麻素的血清樣本在-20℃下可至少穩(wěn)定1個(gè)月；徐恩宇等［13］分別建立了氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速鑒別血液中4種新型合成大麻素的方法，其中ABCHMINACA等4種新型合成大麻素采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢出限為0．1~0．5 ng/mL，氣相色譜-質(zhì)譜法需用時(shí)21 min，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法僅需5 min，表明液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)更適合血液中合成大麻素的定性及定量檢測(cè)。

QuEChERS是一種針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠和安全的前處理方法，比單一的乙腈沉淀蛋白、固相萃取等方法具有更好的提取與凈化效果［14-15］。基于四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）模式能夠以高精度和高分辨率監(jiān)測(cè)目標(biāo)物前體離子的所有碎片離子，同時(shí)具有可靠的定性分析和準(zhǔn)確的定量分析功能，且具有較強(qiáng)的去除背景干擾能力，能夠顯著提高復(fù)雜背景下目標(biāo)物的靈敏度［16］。本文建立了QuEChERS法結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-QE-Orbitrap MS）同時(shí)測(cè)定全血中10種新型合成大麻素的分析方法，其中ADB-BINACA（N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基）-1-芐基-1H-吲唑-3-甲酰胺）、ADB-BICA（N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基）-1-芐基-1H-吲哚-3-甲酰胺）、AB-FUBICA（N-（1-氨基-3-甲基-1-氧代丁-2-基）-1-（4-氟芐基）-1H-吲哚-3-甲酰胺）等物質(zhì)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000高效液相色譜儀、Thermo Scientific Q Exactive四極桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Xcalibur質(zhì)譜 工作站、Hypersil GOLDTMVanquish色 譜 柱（100 mm×2．1 mm，1．9 μm）均購(gòu) 于 美國(guó)Thermo Scientific公司；梅特勒電子天平（精確值：十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler公司）；HC-3018高速離心機(jī)（安徽中科中佳公司）；XW-80A渦旋振蕩器（海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠）。

1.2 材料與試劑

AB-FUBICA、5F-ADBICA（N-（1-氨甲酰基-2，2-二甲基丙基）-1-（5-氟戊基）吲哚-3-甲酰胺）、ADB-BICA、ADB-FUBICA（N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基）-1-（4-氟芐基）-1H-吲哚-3-甲酰胺）、ADB-BINACA、ADB-BUTINACA（N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基）-1-丁基-1H-吲唑-3-甲酰胺）、4F-MDMB-BUTINACA（2-［1-（4-氟丁基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基］-3，3-二甲基丁酸甲酯）、AMB-FUBINACA（3-甲基-2-［1-（4-氟芐基）吲唑-3-甲酰氨基］丁酸甲酯）、5F-ADB（3，3-二甲基-2-［1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰氨基］丁酸甲酯）、MDMB-4en-PINACA（3，3-二甲基-2-［1-（4-戊烯-1-基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基］丁酸甲酯）共10種合成大麻素對(duì)照品固體粉末（純度＞98%，美國(guó)GlpBio公司）。甲酸、甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司），無(wú)水MgSO4、無(wú)水Na2SO4（分析純，沈陽(yáng)國(guó)藥集團(tuán)）?？瞻籽ㄉ蜿?yáng)第四人民醫(yī)院提供）；雄性SD大鼠（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）；案例血液樣本來(lái)自公安機(jī)關(guān)在涉毒案件中取樣。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱量各對(duì)照品固體粉末5 mg，置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，渦旋混勻10 s，配制成0．5 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，以甲醇逐級(jí)稀釋，渦旋混勻，制備質(zhì)量濃度分別為500．0、100．0、50．0、20．0、10．0、5．0、2．0、1．0、0．5、0．2、0．1 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，-20℃冷凍保存，臨用時(shí)放至常溫。

1.4 樣本QuEChERS法處理

準(zhǔn)確量取全血樣本0．5 mL置于15 mL離心試管中，加入1．5 mL乙腈和350 mg無(wú)水MgSO4，渦旋振蕩5 min，以10 000 r/min離心3 min，取上清液過(guò)0．22 μm有機(jī)微孔濾膜，裝瓶后供分析。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

取雄性SD大鼠2只，單只重約230 g，采用腹腔注射5F-ADBICA與MDMB-4en-PINACA混合藥物方式，給藥劑量均為5 μg/kg，給藥1 h后分別內(nèi)眥取血各0．5 mL，按照“1．4”方法處理，待檢測(cè)。

1.6 色譜-質(zhì)譜條件

1.6.1 色譜條件Hypersil GOLDTMVanquish色譜柱（100 mm×2．1 mm，1．9 μm）；流動(dòng)相：0．1%甲酸水（A）和0．1%甲酸乙腈（B），流速為0．30 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為10 μL。梯度洗脫程序：0~9 min，5%B；9~11 min，5%~100%B。

1.6.2 質(zhì)譜條件離子源：采用加熱電噴霧離子源正離子模式（HESI+），離子源溫度：400℃；離子傳輸管溫度：350℃；噴霧電壓：3 500 V；輔助氣：3 000 mL/min，鞘氣：12 000 mL/min；掃描模式：采用全掃描（Full MS）/平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）模式，F(xiàn)ull MS分辨率（R）：70 000，質(zhì)量掃描范圍：m/z150~600；PRM分辨率：17 500，Orbitrap最大容量：2×105，最大注入時(shí)間：100 ms；階梯碰撞能量：20、40、60 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的選擇采用10．0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，比較了甲醇-水、0．1%甲酸水-乙腈、0．1%甲酸水-0．1%甲酸乙腈3種不同流動(dòng)相對(duì)各組分分離效果及色譜峰形的影響。實(shí)驗(yàn)表明，0．1%甲酸水-0．1%甲酸乙腈比其他兩種流動(dòng)相的洗脫分離效果更好，10種目標(biāo)物出峰相對(duì)較快，色譜峰形較好。因目標(biāo)物結(jié)構(gòu)中均含有電負(fù)性基團(tuán)，流動(dòng)相中加入適量甲酸有利于形成［M+H］+分子離子峰，使得離子響應(yīng)強(qiáng)度增加［15］。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置流動(dòng)相流速為0．30 mL/min，在保留時(shí)間（Rt）5．0~9．0 min范圍內(nèi)，10種合成大麻素離子峰的分離效果相對(duì)較好，其PRM色譜圖如圖1所示。

圖1 10種合成大麻素的PRM色譜圖（10．0 ng/mL）Fig．1 PRM chromatogram of 10 synthetic cannabinoids（10．0 ng/mL）the peak numbers of 1-10 denoted were the same as those in Table 1

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇按照“1．6”方法，取10．0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，分別在300、350、400、450、500℃下進(jìn)行平行測(cè)定（n=6），考察離子源溫度對(duì)10種合成大麻素峰面積響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，各目標(biāo)物的響應(yīng)值均明顯增強(qiáng)，并在400℃時(shí)達(dá)到峰值，離子源溫度繼續(xù)升高至500℃時(shí)，響應(yīng)值無(wú)顯著增加。綜合考慮儀器保護(hù)及過(guò)高溫度對(duì)目標(biāo)物穩(wěn)定性的影響，選擇離子源溫度為400℃。設(shè)置階梯碰撞能量（Stepped CE）：20、40、60 eV，對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行碎裂，可獲得不同能量碎裂離子的加合圖譜，碎片離子信息更為豐富。10種合成大麻素的質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

表1 10種合成大麻素的保留時(shí)間（Rt）、分子式及質(zhì)譜信息Table 1 Retention times，formulas and mass spectrometry parameters of 10 synthetic cannabinoids

2.1.3 QuEChERS法的優(yōu)化參考已有方法［17］，本文QuEChERS法采用乙腈進(jìn)行提取，以硫酸鹽作為脫水劑和鹽析劑，不僅可以脫掉全血中的水分，且能夠增強(qiáng)水相的離子強(qiáng)度，從而增大全血中合成大麻素的分配系數(shù)，提高回收率。選擇無(wú)水Na2SO4、無(wú)水MgSO4兩種無(wú)機(jī)鹽，以回收率為考察目標(biāo)對(duì)相同濃度（10．0 ng/mL）的全血添加樣本進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，等量使用時(shí)無(wú)水MgSO4的回收率相對(duì)較高，且脫水過(guò)程中無(wú)結(jié)塊現(xiàn)象。進(jìn)一步考察了無(wú)水MgSO4用量（200、250、300、350、400、500 mg）對(duì)10種合成大麻素回收率的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)用量超過(guò)350 mg后，目標(biāo)物的回收率不再升高，因此確定無(wú)水MgSO4的用量為350 mg。

2.2 質(zhì)譜碎裂分析

2.2.1 目標(biāo)化合物分類按照化合物的母核結(jié)構(gòu)，本文檢測(cè)的10種合成大麻素可分為兩大類：吲哚酰胺類，如AB-FUBICA、5F-ADBICA、ADB-FUBICA和ADB-BICA等；吲唑酰胺類，如ADBBINACA、ADB-BUTINACA、4F-MDMB-BUTINACA、AMB-FUBINACA、5F-ADB和MDMB-4en-PINACA等。其中吲唑酰胺類合成大麻素是傳統(tǒng)JWH吲哚系列的升級(jí)替代產(chǎn)品［18］，具有比吲哚類合成大麻素更強(qiáng)的精神活性［2］。

2.2.2 碎裂方式分析在HESI+/PRM模式下，10種目標(biāo)物的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子碎裂方式呈以下特點(diǎn)：①分子結(jié)構(gòu)中鏈接部酰胺的C—N鍵均可發(fā)生α斷裂，形成帶側(cè)鏈的吲哚/吲唑酰陽(yáng)離子；②相似結(jié)構(gòu)化合物的碎裂方式相近，特征碎片離子一致；③母核（吲哚/吲唑核）碎片或母核N原子取代基的碎片離子峰特異性明顯；④準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+的豐度值普遍較低。

AB-FUBICA、5F-ADBICA、ADB-FUBICA、ADB-BICA、ADB-BINACA和ADB-BUTINACA 6種化合物的結(jié)構(gòu)相近，均為氨甲酰基吲哚/吲唑酰胺類合成大麻素，即頂部區(qū)域均含有氨甲?；鶊F(tuán)，主要區(qū)別為前4種物質(zhì)的母核為吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)，后2種物質(zhì)的母核為吲唑環(huán)結(jié)構(gòu)，母核中N原子的尾端取代基分別為氟芐基、5F-戊基、芐基和丁基等。6種化合物相近的碎裂方式為：分子結(jié)構(gòu)中酰胺C—N鍵均發(fā)生α斷裂，形成帶側(cè)鏈的吲哚/吲唑酰陽(yáng)離子；當(dāng)母核N原子上的取代基為芐基或氟芐基時(shí)，斷裂產(chǎn)生豐度值最高的芐基或氟芐基陽(yáng)離子；當(dāng)母核N原子上的取代基為5F-戊基、丁基時(shí)，則發(fā)生雜環(huán)與烷烴N—C鍵斷裂并伴隨γH重排，形成吲哚/吲唑核酰陽(yáng)離子m/z144或m/z145特征碎片，該碎片是區(qū)分吲哚與吲唑類合成大麻素的標(biāo)志性碎片；6種化合物頂部區(qū)域均易發(fā)生酰胺C—N鍵斷裂，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子［M+H］+-NH3碎片離子，或氨甲?；w脫裂，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子［M+H］+-CONH3碎片離子。具有代表性的3種物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜碎裂方式分析如圖2A~C所示。

4F-MDMB-BUTINACA、AMB-FUBINACA、5F-ADB和MDMB-4en-PINACA 4種化合物的結(jié)構(gòu)相近，頂部區(qū)域酰胺鍵N原子上的鏈接組均為丁酸甲酯基團(tuán)，母核均為吲唑環(huán)結(jié)構(gòu)。主要區(qū)別在于母核N原子上的尾端取代基分別為4-氟丁基、氟芐基、5-氟丁基和1-戊-4-烯基，該類物質(zhì)的主要碎裂方式與上述吲哚酰胺類物質(zhì)相似。且4種物質(zhì)的頂部區(qū)域均可發(fā)生酯基脫裂，形成準(zhǔn)分子離子［M+H］+-COOCH3碎片離子。代表性物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜碎裂方式分析如圖2D所示。

圖2 4種代表性合成大麻素的MS2質(zhì)譜圖及碎裂方式分析Fig．2 MS2 spectra and fragmentation analysis of 4 typical synthetic cannabinoids

2.3 方法學(xué)建立

2.3.1 工作曲線、檢出限及定量下限采用空白血液添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液方式，制備混標(biāo)質(zhì)量濃度分別為0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、50．0、100．0 ng/mL的系列全血加標(biāo)樣本，按照“1．4”前處理方法和“1．6”儀器條件，由低到高濃度依次測(cè)定。以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，ng/mL），對(duì)應(yīng)的定量離子響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，10種合成大麻素在0．05~100．0 ng/mL或0．20~100．0 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均不小于0．999 0，檢出限（LOD，S/N≥3）為0．01~0．05 ng/mL，定量下限（LOQ，S/N≥10）為0．05~0．20 ng/mL（見(jiàn)表2）。

表2 10種合成大麻素的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，LODs and LOQs of 10 synthetic cannabinoids

2.3.2 加標(biāo)回收率、基質(zhì)效應(yīng)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差采用空白基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液方式，分別制備10種合成大麻素質(zhì)量濃度為0．2、5．0、50．0 ng/mL的空白血液加標(biāo)樣本，每個(gè)濃度平行制備3份。按照“1．4”前處理方法和“1．6”儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以加標(biāo)樣本中各目標(biāo)物定量離子的峰面積為A；空白血液經(jīng)QuEChERS法提取后加標(biāo)樣本中定量離子的峰面積為B；對(duì)應(yīng)濃度混標(biāo)溶液中各目標(biāo)物定量離子的峰面積為C。參照Matuszewski［19］方法進(jìn)行計(jì)算：加標(biāo)回收率=A/C×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。同一濃度全血加標(biāo)樣本當(dāng)日重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間RSD。結(jié)果顯示，10種目標(biāo)物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為92．1%~115%，基質(zhì)效應(yīng)為86．6%~115%；日內(nèi)RSD均不大于8．5%，日間RSD均不大于10%（見(jiàn)表3）。

表3 10種合成大麻素的回收率、基質(zhì)效應(yīng)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries，matrix effects and RSDs of 10 synthetic cannabinoids（n=6）

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用本方法對(duì)注射混合藥物的SD大鼠血液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，給藥1 h后SD大鼠血液中均檢出5F-ADBICA和MDMB-4en-PINACA，2只大鼠血液中5F-ADBICA的平均質(zhì)量濃度為2．13 ng/mL，MDMB-4en-PINACA為1．76 ng/mL。表明所建方法適用于實(shí)際樣品中合成大麻素物質(zhì)的檢驗(yàn)。

2.5 案例應(yīng)用

應(yīng)用本方法對(duì)一起因吸食合成大麻素導(dǎo)致傷害致死案件的嫌疑人血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜峰保留時(shí)間及質(zhì)譜特征比較，確認(rèn)該樣本中檢出MDMB-4en-PINACA。平行2個(gè)樣本，每個(gè)樣本測(cè)定6次，并結(jié)合工作曲線計(jì)算得到MDMB-4en-PINACA的平均質(zhì)量濃度為3．72 ng/mL，測(cè)量值的RSD（n=6）均不大于5．4%。本方法穩(wěn)定、檢測(cè)結(jié)果可靠，檢測(cè)結(jié)果為吸食合成大麻素行為認(rèn)定提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)QuEChERS前處理方法、色譜流動(dòng)相和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了全血中10種新型合成大麻素的超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)方法，對(duì)10種目標(biāo)物的質(zhì)譜信息、碎片離子主要碎裂方式進(jìn)行分析，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。本方法具有操作簡(jiǎn)便快捷、數(shù)據(jù)穩(wěn)定、檢測(cè)靈敏度及回收率高的特點(diǎn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和真實(shí)案例的血液樣本檢測(cè)結(jié)果證明方法可靠，能夠滿足濫用合成大麻素案件檢驗(yàn)鑒定的實(shí)際需要。