啤酒基熒光碳點(diǎn)的綠色合成及其在Fe3+檢測(cè)和細(xì)胞成像中的應(yīng)用

胡金雙，楊 熙，劉舒芹，楊升宏*

（1．齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）化學(xué)與化工學(xué)院 山東省分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353；2．廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東 廣州 510070）

三價(jià)鐵離子（Fe3+）作為氧和電子的運(yùn)輸載體，與眾多生理活動(dòng)息息相關(guān)，不僅是氧化還原酶的輔助因子，同時(shí)還承擔(dān)著轉(zhuǎn)運(yùn)血紅蛋白的角色［1］。Fe3+缺乏時(shí)會(huì)引起貧血、神經(jīng)損傷、免疫力下降等問(wèn)題［2］；而Fe3+濃度過(guò)高則會(huì)催化產(chǎn)生大量活性氧，降低細(xì)胞活力，破壞細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。同時(shí)，機(jī)體內(nèi)Fe3+的濃度水平還與帕金森癥、阿爾茨海默癥等重大疾病息息相關(guān)［3］。因此，環(huán)境樣品中Fe3+的準(zhǔn)確分析和細(xì)胞內(nèi)Fe3+的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)于維護(hù)人體正常生理機(jī)能至關(guān)重要。Fe3+的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法等［4］，這些方法雖然都能實(shí)現(xiàn)Fe3+的準(zhǔn)確測(cè)定，但大多需要復(fù)雜的專業(yè)操作過(guò)程、昂貴的大型設(shè)備，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Fe3+的動(dòng)態(tài)監(jiān)控。熒光分析法具有靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，不僅能夠滿足水體中Fe3+的準(zhǔn)確分析，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Fe3+含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有更為廣泛的應(yīng)用前景［5］。

熒光碳點(diǎn)（Carbon dots，CDs）作為碳納米材料家族中一種新興的環(huán)境友好型納米材料，具有光穩(wěn)定性優(yōu)異、水溶性好、易于表面功能化、低毒性和生物相容性良好等優(yōu)勢(shì)［6］，適用于作為熒光探針構(gòu)建分析方法，以實(shí)現(xiàn)Fe3+的檢測(cè)。熒光碳點(diǎn)合成的原料來(lái)源廣泛，既可以是檸檬酸［7］等各種化學(xué)品，也可以是大蒜［8］、蜂蜜［9］甚至蝦殼［10］等綠色天然原料。天然物質(zhì)用于碳點(diǎn)制備具有成本低、污染小等優(yōu)勢(shì)，但在合成過(guò)程中大多仍需要使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿進(jìn)行碳化［11］。因此，碳點(diǎn)綠色合成路線的開(kāi)發(fā)和Fe3+熒光分析方法的構(gòu)建具有重要意義。

啤酒是含有碳水化合物的飲品，主要以小麥麥芽和大麥麥芽為原料，啤酒中含有多種氨基酸、維生素、低分子糖、無(wú)機(jī)鹽和各種酶［12］，這些營(yíng)養(yǎng)素易被人體吸收和利用。啤酒中的低分子糖和氨基酸也很容易被消化和吸收，從而在體內(nèi)產(chǎn)生大量的熱能，因此啤酒也被稱為“液體面包”［13］。2012年，Chattopadhyay等［14］基于聚乙二醇在微波輻射下可產(chǎn)生焦糖化CDs，分析了不同含糖食品中的碳納米粒子，發(fā)現(xiàn)含碳水化合物的食物可以作為原料用于CDs的合成。除此之外，Tan等［15］的研究證明啤酒對(duì)小鼠無(wú)明顯的急性毒性?；诖?，啤酒可直接作為一種綠色原料用于CDs的合成?？紤]到啤酒的成分，其豐富的活性位點(diǎn)為產(chǎn)物在傳感領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能。

本研究以齊魯工業(yè)大學(xué)自釀啤酒為碳源，利用一步溶劑熱法制備了啤酒基熒光碳點(diǎn)（Q-CDs）。合成的啤酒基熒光碳點(diǎn)表現(xiàn)出發(fā)射波長(zhǎng)隨激發(fā)波長(zhǎng)變化而變化的性質(zhì)，最佳發(fā)射波長(zhǎng)為475 nm，能夠發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。基于Fe3+對(duì)所制備碳點(diǎn)的熒光猝滅作用構(gòu)建了高靈敏度、高特異性的Fe3+分析方法，并成功用于實(shí)際水樣中Fe3+的定量分析。另外，所制備碳點(diǎn)具有良好的生物相容性和發(fā)光特性，可成功用于細(xì)胞成像。本研究為促進(jìn)碳點(diǎn)的綠色合成以及新型分析方法的開(kāi)發(fā)提供了新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三價(jià)鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）購(gòu)自廣州分析測(cè)試中心科力技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；齊魯工業(yè)大學(xué)自釀啤酒購(gòu)自齊魯工業(yè)大學(xué)長(zhǎng)清校區(qū)納博士超市；艾爾啤酒、青島啤酒和嶗山啤酒購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?；其它試劑均為分析純，且使用時(shí)未進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率為18．25 MΩ·cm的超純水。

Tecnai G2 F30透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI）；BI-200SM動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀（美國(guó)Brookhaven）；D8-ADVANCE X射線粉末衍射儀（德國(guó)Bruker）；UV2800s紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；F97 Pro熒光分光光度計(jì)（上海棱光科技有限公司）；NEXUS 670傅里葉變換紅外光譜（美國(guó)Nicolet）；EscaLab Xi+X射線光電子能譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；RT-6100酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Axioscope A 1 POL熒光顯微鏡（德國(guó)ZEISS）。

1.2 碳點(diǎn)的制備

以啤酒作為碳源，經(jīng)水熱處理制備水分散性CDs。將30 mL啤酒直接加入到容量為50 mL的反應(yīng)釜中，放入烘箱，在200℃下高溫高壓反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，將所得產(chǎn)物于12 000 r/min離心處理15 min后，上清液用透析膜（截留分子量：500 D）透析24 h，得到CDs溶液。50℃下真空干燥后得到的粉末即為啤酒基熒光碳點(diǎn)。

1.3 Fe3+的檢測(cè)

室溫下，將0．2 mL的CDs（250 μg·mL-1）溶液加入到2 mL pH 7．4的磷酸鹽緩沖溶液（1 mmol/L）中，依次加入不同濃度的Fe3+，孵育5 min后，以400 nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)量475 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用相似的方法測(cè)定該探針對(duì)Mn2+、Cd2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Hg2+、Fe2+、Cr3+、Ag+、Cu2+、Ni+、Ca2+和Mg2+的選擇性。以自來(lái)水、雨水、泉水為實(shí)際水樣進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)估方法的可靠性。

1.4 細(xì)胞毒性及細(xì)胞成像

將Hela細(xì)胞在37℃及5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至一定密度，將細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞懸濁液濃度為5×104/mL；然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，在新鮮的培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度（0、10、100、200、400、600、800 μg/mL）的Q-CDs與Hela細(xì)胞共同培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL 5%的MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液后，每孔加入150 μL的二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，以使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度。

將Hela細(xì)胞接種于12孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；然后加入200 μg/mL Q-CDs共同孵育10 min后，加入不同濃度（0、15、50 μmol/L）的Fe3+，孵育10 min，使用pH 7．4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次，以熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳點(diǎn)的表征

本研究以齊魯工業(yè)大學(xué)啤酒（QUTB，酒精含量≥5．5%vol，原麥汁濃度13°P）、艾爾啤酒（NB，酒精含量≥3．8%vol，原麥汁濃度11．8°P）、青島啤酒（TB，酒精含量≥4．7%vol，原麥汁濃度12°P）和嶗山啤酒（LB，酒精含量≥4%vol，原麥汁濃度10°P）4種類型的啤酒為碳源合成了熒光碳點(diǎn)。這4種碳點(diǎn)具有類似的光譜性質(zhì)，其熒光光譜如圖1所示。制備的CDs溶液均表現(xiàn)為發(fā)射波長(zhǎng)隨激發(fā)波長(zhǎng)改變而改變的性質(zhì)。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)在280~520 nm范圍變化時(shí)，最大發(fā)射峰的位置從415 nm移至545 nm。以硫酸奎寧為參比（量子產(chǎn)率為54%），測(cè)量了合成CDs的熒光量子產(chǎn)率。結(jié)果表明以QUTB為原料制備的CDs具有最佳熒光性能，量子產(chǎn)率為4．56%，優(yōu)于使用其他啤酒制備的CDs（2．89%、3．16%和2．87%）。推測(cè)基于QUTB合成的CDs的高量子產(chǎn)率歸因于QUTB具有更高的酒精含量和原麥汁濃度。因此，最終選擇基于QUTB合成的CDs（Q-CDs）進(jìn)行進(jìn)一步的表征和應(yīng)用。

圖1 利用不同原料制備的4種CDs的熒光光譜Fig．1 The fluorescence spectra of four kinds CDs by using different raw materials

Q-CDs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜及熒光光譜如圖2A所示。Q-CDs溶液在274 nm處的吸收峰由ππ*電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生［16］。Q-CDs的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為475 nm，可發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，以下實(shí)驗(yàn)均在最佳激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行。使用透射電鏡（TEM）對(duì)合成的Q-CDs的尺寸分布和形貌進(jìn)行了表征。如圖2B所示，Q-CDs為接近球形的單分散性納米顆粒，其尺寸分布相對(duì)較窄（3~7 nm）。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量結(jié)果（圖2C）進(jìn)一步證明了Q-CDs的尺寸及單分散性，其平均直徑為5．6 nm，與透射電鏡的測(cè)量結(jié)果一致。從圖2D中可以看出，Q-CDs的X射線粉末衍射圖（XRD）在2θ=22°處有一個(gè)明顯的碳特征衍射峰，表明Q-CDs具有無(wú)定形碳結(jié)構(gòu)。

利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對(duì)Q-CDs的表面官能團(tuán)進(jìn)行表征。如圖2E所示，O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在3 214．7 cm-1處，2 931．2 cm-1處的吸收峰為飽和C—H鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 671．9 cm-1和1 598．6 cm-1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)C==O和N—H的伸縮振動(dòng)，1 401．9 cm-1處為C—N鍵的伸縮振動(dòng)。通過(guò)X射線光電子能譜（XPS）進(jìn)一步證實(shí)了Q-CDs的表面組成（圖2F），其XPS光譜顯示了C1s（285．3 eV）、N1s（399．3 eV）和O1s（531．4 eV）的3個(gè)典型峰。C1s的高分辨率XPS光譜（圖2G）在284．7、286．4和288．2 eV處有3個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)于C—C、C—N/C—O和C==O基團(tuán)［17］。以上結(jié)果表明，Q-CDs表面含有大量的活性官能團(tuán)。

圖2 Q-CDs的紫外-可見(jiàn)光譜圖與熒光發(fā)射光譜圖（A）、透射電鏡圖（B）、動(dòng)態(tài)光散射圖（C）、X射線粉末衍射圖（D）、傅里葉變換紅外光譜圖（E）以及Q-CDs（F）和C1s（G）的X射線光電子能譜Fig．2 UV-Vis and fluorescence emission spectra（A），TEM spectrum（B），DLS spectrum（C），XRD spectrum（D），F(xiàn)TIR spectrum（E），and XPS spectra of the Q-CDs（F）and C1s（G）

2.2 Q-CDs的穩(wěn)定性

為了評(píng)估Q-CDs用于分析檢測(cè)的可能性，對(duì)其熒光穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試。首先，測(cè)試了不同pH值對(duì)Q-CDs熒光強(qiáng)度的影響。從圖3A可以看出，Q-CDs的熒光強(qiáng)度在pH 3．0~12．0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，表明Q-CDs的熒光在一定程度上可以耐受酸堿變化。在365 nm紫外燈下對(duì)Q-CDs的光學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。連續(xù)掃描樣品60 min，Q-CDs的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有變化（圖3B）；即使在紫外光連續(xù)照射6 h后，熒光強(qiáng)度下降也不到6%（圖3C），表明Q-CDs具有較好的光學(xué)穩(wěn)定性。最后考察了離子強(qiáng)度對(duì)Q-CDs熒光行為的影響（圖3D）。在鹽濃度高達(dá)0．5 mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，表明Q-CDs在高離子強(qiáng)度條件下仍具有較高的穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明Q-CDs穩(wěn)定性良好，為其進(jìn)一步在分析傳感中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖3 pH值（A）、連續(xù)掃描時(shí)間（B）、紫外燈照射時(shí)間（C）、鹽濃度（D）對(duì)Q-CDs熒光強(qiáng)度的影響Fig．3 Effects of pH value（A），continuous scanning time（B），UV lamp irradiation time（C）and salt concentration（D）on fluorescence intensity of Q-CDs

2.3 Fe3+的檢測(cè)

探究了Q-CDs對(duì)不同濃度Fe3+的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)Q-CDs溶液的熒光強(qiáng)度隨Fe3+濃度的增加逐漸降低（圖4A）。以（I0-I）/I0（I0和I分別為Fe3+不存在和存在情況下Q-CDs的熒光強(qiáng)度）對(duì)Fe3+濃度作圖（圖4B），結(jié)果顯示，在0．3~45 μmol/L范圍內(nèi)，（I0-I）/I0與Fe3+濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0．998 6，以3倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD），得到LOD為91 nmol/L。與其他Fe3+檢測(cè)方法相比（表1），本方法具有較高的靈敏度。

表1 不同熒光檢測(cè)法對(duì)Fe3+檢測(cè)性能的比較Table 1 Comparison of performance of different fluorescence methods for detection of Fe3+

圖4 不同濃度Fe3+存在下Q-CDs的熒光光譜（A）、（I0-I）/I0與Fe3+濃度的關(guān)系圖（B）及Q-CDs對(duì)Fe3+的選擇性測(cè)試（C）Fig．4 Fluorescence spectra of Q-CDs at different Fe3+concentrations（A），diagram of（I0-I）/I0 and Fe3+concentrations（B）and selectivity of Q-CDs to Fe3+（C）inset B：（I0-I）/I0 linear relationship with Fe3+concentration in the range of 0．3-45 μmol/L

進(jìn)一步考察了Q-CDs對(duì)Fe3+的選擇性（圖4C），將各種重金屬離子加入Q-CDs水溶液中，包括Fe3+、Mn2+、Cd2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Hg2+、Fe2+、Cr3+、Ag+、Cu2+、Ni+、Ca2+和Mg2+，離子濃度均為150 μmol/L?？疾炱鋵?duì)（I0-I）/I0的影響。Fe3+能夠使Q-CDs的熒光發(fā)生猝滅，而其他金屬離子僅有少量或無(wú)猝滅效應(yīng)。綜上，Q-CDs熒光傳感探針對(duì)Fe3+有靈敏的響應(yīng)。

XPS和FTIR結(jié)果（圖2）顯示，Q-CDs表面有大量的活性基團(tuán)（如羧基、氨基、羥基等），這些活性基團(tuán)可以與Fe3+進(jìn)行配位螯合，改變Q-CDs表面官能團(tuán)的電子結(jié)構(gòu)。這些配合物通過(guò)有效的光電子或能量轉(zhuǎn)移激發(fā)電子的非輻射重組，并進(jìn)一步導(dǎo)致熒光猝滅［18-20］。因此，推測(cè)Fe3+使Q-CDs熒光猝滅是由電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的。

為了評(píng)估該方法的實(shí)用性，進(jìn)一步將其應(yīng)用于當(dāng)?shù)刈詠?lái)水、雨水及泉水（取自濟(jì)南市五龍?zhí)?、趵突泉）中Fe3+的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Q-CDs對(duì)所取樣品無(wú)明顯響應(yīng)，即未檢測(cè)出Fe3+。為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，向待測(cè)水樣中加入不同濃度（0．5、5、15 μmol/L）的Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。Fe3+的加標(biāo)回收率為94．6%~106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%。結(jié)果表明，Q-CDs對(duì)實(shí)際環(huán)境水樣中Fe3+的檢測(cè)結(jié)果可靠，可用于實(shí)際水樣中Fe3+的檢測(cè)。

表2 實(shí)際樣品中Fe3+的測(cè)定Table 2 Determination of Fe3+in real water samples

2.4 細(xì)胞毒性與細(xì)胞成像

采用MTT法測(cè)定了不同濃度Q-CDs對(duì)Hela細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)即使Q-CDs為800 μg/mL，細(xì)胞活性仍高達(dá)97．54%（圖5A）。Hela細(xì)胞與Q-CDs（200 μg/mL）共孵育后，仍然表現(xiàn)出很好的細(xì)胞活性（圖5B）。在紫外光（395~415 nm）、藍(lán)光（420~485 nm）、綠光（460~550 nm）的激發(fā)光條件下觀察，細(xì)胞分別發(fā)出藍(lán)色、綠色、紅色熒光（圖5C-E），表明Q-CDs具有良好的生物相容性和較低的毒性，容易進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，并保留其熒光特性，可以用于簡(jiǎn)便的細(xì)胞成像分析。

圖5 不同濃度Q-CDs存在下的細(xì)胞毒性測(cè)試（A），Hela細(xì)胞與200 μg/mL Q-CDs孵育后的明場(chǎng)圖像（B）以及紫外光（C）、藍(lán)光（D）、綠光（E）激發(fā)下孵育后細(xì)胞的熒光圖像Fig．5 Cytotoxicity test in the presence of different concentrations of Q-CDs（A），bright field image of Hela cells incubated with 200 μg/mL Q-CDs（B），fluorescent images of incubated cells under UV（C），blue light（D），green light（E）excitation

基于Q-CDs的細(xì)胞內(nèi)熒光保留和特異性識(shí)別Fe3+的特性，將Q-CDs用于活細(xì)胞內(nèi)Fe3+的成像分析。將Hela細(xì)胞與200 μg/mL Q-CDs共同孵育10 min后，分別加入0、15、50 μmol/L Fe3+孵育10 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入Fe3+后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸減弱，且Fe3+濃度越高，熒光猝滅越嚴(yán)重（圖6）。表明合成的Q-CDs可用于細(xì)胞成像，且能實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)Fe3+的可視化檢測(cè)。

圖6 Hela細(xì)胞與200 μg/mL Q-CDs和0、15、50 μmol/L Fe3+共同孵育后在紫外光激發(fā)下的熒光圖像（A1、B1、C1）；明場(chǎng)圖像（A2、B2、C2）；細(xì)胞熒光圖像與明場(chǎng)圖像合并圖像（A3、B3、C3）Fig．6 Fluorescence images of Hela cells incubated with 200 μg/mL Q-CDs and 0，15，50 μmol/L Fe3+under UV excitation（A1，B1，C1），bright field images（A2，B2，C2），the combination of cell fluorescence images and bright field images（A3，B3，C3）

3 結(jié)論

本文以4種啤酒為前體，無(wú)需額外酸堿輔助，利用溫和的一步溶劑熱法直接合成了具有藍(lán)色熒光的CDs。其中以齊魯工業(yè)大學(xué)啤酒為原料制備的Q-CDs發(fā)光效率最佳，能夠發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，量子產(chǎn)率為4．56%。合成的Q-CDs不僅具有較低的生物毒性，并且對(duì)于Fe3+具有較高的選擇性和較好的響應(yīng)靈敏度，基于此成功建立了Fe3+的熒光分析方法，檢出限可達(dá)91 nmol/L。所建方法成功用于實(shí)際水樣中Fe3+的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意?？紤]到Q-CDs良好的生物相容性，進(jìn)一步將其成功應(yīng)用于多色細(xì)胞成像和細(xì)胞內(nèi)Fe3+的成像分析。