超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定血液和尿液中10種2C系列苯乙胺類衍生物

李錦昌，何洪源，張?jiān)品?，王瑞?

（1．中國(guó)人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院，北京 100038；2．公安部物證鑒定中心，北京 100038）

苯乙胺類衍生物是一類重要的精神活性物質(zhì)，是在苯乙胺的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出的具有致幻或致幻和興奮雙重作用的物質(zhì)，根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為兩大類。其中一類是2C系列苯乙胺類衍生物（即二甲氧基苯乙胺衍生物），又稱2C系列化合物，最早在20世紀(jì)70年代由Alexander Shulgin合成，其苯乙胺苯環(huán)的2和5位有2個(gè)甲氧基取代，4位有1個(gè)取代基［1］。術(shù)語(yǔ)“2C”，表示所合成的致幻劑苯乙胺類衍生物的苯環(huán)和胺基之間的2個(gè)碳原子［2］。最早出現(xiàn)的2C系列衍生物為2C-B，之后出現(xiàn)了2C-C、2C-I和2C-T-2、2C-T-7等，2010年出現(xiàn)了稱為NBOMe的新型2C系列化合物［3］。2C系列化合物能產(chǎn)生與麥角二乙酰胺類似的強(qiáng)致幻效果，已有多種2C系列化合物被多個(gè)國(guó)家管制，在我國(guó)目前被管制的有13種［4］。

國(guó)外有關(guān)2C系列苯乙胺類衍生物的相關(guān)文獻(xiàn)較多，包括檢驗(yàn)方法及體內(nèi)外代謝研究，常用的前處理技術(shù)主要有液-液萃取（LLE）［5-6］和固相萃?。⊿PE）［7-8］，分析方法以氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）［9-10］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［11-13］為主。體外代謝以肝微粒體［14-16］和人肝細(xì)胞［17-18］進(jìn)行研究，體內(nèi)代謝多在小鼠和大鼠體內(nèi)進(jìn)行［15，19-20］，通過(guò)體內(nèi)外的研究并結(jié)合實(shí)際案件檢材進(jìn)行確證［21］。隨著2C系列化合物的更新?lián)Q代，近年來(lái)報(bào)道的多為NBOMe化合物［12-13，22-23］。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究很少，主要集中在體外樣品［24］，或單個(gè)2C類物質(zhì)的檢測(cè)方法［25］。本文以我國(guó)管制的10種2C系列化合物為研究對(duì)象，建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，用于檢測(cè)血液和尿液中常見(jiàn)的10種2C系列化 合 物，包 括2C-H、2C-D、2C-P、2C-T-2、2C-T-4、2C-T-7、25D-NBOMe、25CNBOMe、25B-NBOMe和25I-NBOMe（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）。該方法簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高，重復(fù)性好，能快速檢測(cè)血液和尿液中的2C系列化合物，滿足目前的案件檢驗(yàn)需求。

圖1 10種2C系列化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig．1 Chemical structures of 10 2C-series phenethylamines

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Acquity UPLC Xevo TQ MS，美國(guó)Waters公司），Masslynx工作站（美國(guó)Waters公司），Milli-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），BP210s電子天平（德國(guó)Sartorius公司），Thermo PRIMO R型高速離心機(jī)（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司），Vortex Genie-2渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司），HGC-12型氮吹儀（美國(guó)PerkinElmer公司），Oasis?PRiME HLB固相萃取柱（150 mg/3 mL，美國(guó)Waters公司）。

10種2C系列化合物標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度：100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司），甲醇、乙腈和甲酸銨（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，其余試劑均為分析純?？瞻籽?、尿液來(lái)自健康的志愿者。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將10種2C系列化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別置于棕色樣品瓶中。分別取10種標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，用甲醇定容至1 mL，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液；將10種單標(biāo)儲(chǔ)備液分別用甲醇稀釋并配制成1 μg/mL、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷凍保存。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)需要用甲醇逐級(jí)稀釋。

1.3 樣品前處理

取0．5 mL空白血液或尿液于15 mL塑料離心管中，加入2 mL甲醇，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，以8 000 r/min離心10 min后取1 mL上清液，過(guò)0．22 μm有機(jī)膜后，待分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2．1 mm，1．7 μm），流動(dòng)相：A為甲醇，B為水（0．1%甲酸），流速：0．4 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2 μL。梯度洗脫程序：0~0．2 min，10%A；0．2~5．0 min，10%~90%A；5．0~6．1 min，90%A；6．1~6．5 min，90%~10%A?？傔\(yùn)行時(shí)間為6．5 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧電離正離子掃描模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)，毛細(xì)管電壓為1．5 kV，脫溶劑氣溫度為400℃，脫溶劑氣流速為900 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。10種化合物的定性離子、定量離子、錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 10種2C系列化合物的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS spectrum parameters for 10 2C-series phenethylamines

1.5 數(shù)據(jù)處理

圖譜的采集及定性分析采用MassLynx V4．1軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019和Origin 2021軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)10種2C系列化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇電噴霧正離子電離模式（ESI+）進(jìn)行檢測(cè)。按照“1．2”方法分別配制100 ng/mL的10種化合物單標(biāo)溶液，分別注入質(zhì)譜儀中。開(kāi)啟自動(dòng)調(diào)諧功能，采用儀器自動(dòng)優(yōu)化得到10種2C系列化合物的錐孔電壓、碰撞電壓、駐留時(shí)間等參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了ACQUITY UPLC?HSS T3（100 mm×2．1 mm，1．8 μm）、ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2．1 mm，1．7 μm）、ACQUITY UPLC?BEH HILIC（100 mm×2．1 mm，1．7 μm）3種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，ACQUITY UPLC?BEH C18柱和ACQUITY UPLC?HSS T3柱均能夠分離10種2C系列化合物，但C18柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果更好，響應(yīng)值和靈敏度更高，因此選用ACQUITY UPLC?BEH C18柱。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水（0．1%甲酸）、甲醇-水（0．1%甲酸）、乙腈-水（0．1%甲酸，2 mmol/L甲酸銨）、甲醇-水（0．1%甲酸，2 mmol/L甲酸銨）分別為流動(dòng)相時(shí)10種化合物的分離情況。結(jié)果顯示，以甲醇-水（0．1%甲酸）和甲醇-水（0．1%甲酸，2 mmol/L甲酸銨）作為流動(dòng)相均可較好地改善大部分目標(biāo)物的分離效果與色譜峰形，以后者作為流動(dòng)相時(shí)各化合物的保留時(shí)間相對(duì)靠后。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇ACQUITY UPLC?BEH C18柱，流動(dòng)相為甲醇-水（0．1%甲酸）。在優(yōu)化的色譜條件下，10種2C系列化合物的提取離子流圖（XIC）見(jiàn)圖2。

圖2 10種2C系列化合物的提取離子流圖（100 ng/mL）Fig．2 Extracted ion chromatograms of 10 2C-series phenethylamines（100 ng/mL）

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

以回收率和基質(zhì)效應(yīng)為指標(biāo)，比較了沉淀蛋白法（PPT）、液-液萃取法、固相萃取法對(duì)血液、尿液中質(zhì)量濃度為100 ng/mL的10種2C系列化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取效果。

沉淀蛋白法：甲醇沉淀蛋白見(jiàn)“1．3”方法；乙腈沉淀蛋白法：取0．5 mL空白血液、尿液，加入2 mL乙腈于15 mL塑料離心管中，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，以12 000 r/min離心10 min后取1 mL上清液，過(guò)0．22 μm有機(jī)濾膜后待分析。

液-液萃取法：取0．5 mL空白血液、尿液，加入2 mL乙酸乙酯于15 mL塑料離心管中，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，以8 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL尖底玻璃管中，空氣流下吹干，用0．5 mL甲醇定容，過(guò)0．22 μm有機(jī)濾膜后待分析。

固相萃取法：取0．5 mL空白血液、尿液，加入2 mL水稀釋，并置于15 mL塑料離心管中，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，以8 000 r/min離心10 min。Oasis?PRiME HLB固相萃取柱依次經(jīng)3 mL甲醇和3 mL水活化。取離心后的上清液過(guò)HLB柱，用1．5 mL 10%甲醇水溶液淋洗，1．5 mL乙腈-甲醇（9∶1，體積比）混合溶劑洗脫。收集洗脫液，空氣流下?lián)]干，用0．5 mL甲醇定容，過(guò)0．22 μm有機(jī)濾膜后待分析。

不同前處理方法下的基質(zhì)效應(yīng)和回收率如圖3所示。結(jié)果顯示，LLE和SPE的回收率較低，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重。而沉淀蛋白法操作簡(jiǎn)單快速，基質(zhì)干擾小，且回收率高。本實(shí)驗(yàn)還比較了甲醇和乙腈分別作為沉淀蛋白法的有機(jī)溶劑對(duì)于血液、尿液中2C系列化合物的萃取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀蛋白法對(duì)目標(biāo)物的回收率優(yōu)于乙腈沉淀蛋白法。故選擇甲醇沉淀蛋白法進(jìn)行前處理。

圖3 空白血液中10種2C系列化合物在不同前處理?xiàng)l件下的基質(zhì)效應(yīng)（A）和回收率（B）Fig．3 Matrix effects（A）and recoveries（B）of 10 2C-series phenethylamines in blank blood under different preparation conditions

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)（ME）是指基質(zhì)中干擾物會(huì)影響目標(biāo)化合物的離子化效率，使目標(biāo)化合物在分析儀器上的響應(yīng)受到增強(qiáng)或抑制作用。實(shí)驗(yàn)對(duì)目標(biāo)分析物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別測(cè)定了低（1 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（20 ng/mL）濃度下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積（S1），以及空白血液或空白尿液按“1．3”方法前處理后的上清液中分別添加低、中、高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的色譜峰面積（S2），通過(guò)其比值（S2/S1）評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的2C系列化合物質(zhì)控樣本的基質(zhì)效應(yīng)為71．9%~112%，基質(zhì)效應(yīng)在可接受的范圍內(nèi)，滿足檢測(cè)要求。

2.4.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限在空白血液、空白尿液中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度范圍為0．005~50 ng/mL的加標(biāo)樣品，采用“1．3”方法進(jìn)行前處理后上機(jī)檢測(cè)，并以定量離子對(duì)的峰面積（y）和目標(biāo)分析物的添加濃度（x，ng/mL）繪制線性曲線。結(jié)果顯示，血液、尿液中10種2C系列化合物在0．005~50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）為0．995 8~0．999 9。將空白樣品添加低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“1．3”方法進(jìn)行樣品前處理后上機(jī)檢測(cè)，以定量離子對(duì)3倍信噪比（S/N）時(shí)的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度作為檢出限（LOD），以10倍S/N的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度作為定量下限（LOQ）。10種化合物在血液和尿液中的LOD分別為0．01~2 ng/mL和0．002~5 ng/mL，LOQ分別為0．02~5 ng/mL和0．005~10 ng/mL（見(jiàn)表2）。

表2 不同基質(zhì)中10種2C系列化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs for 10 2C-series phenethylamines in different matrixs

2.4.3準(zhǔn)確度與精密度取空白血液和空白尿液，添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為1、5、20 ng/mL的待測(cè)樣品，每個(gè)濃度水平配制3個(gè)平行樣。提取回收率通過(guò)測(cè)定空白血液或空白尿液在前處理之前添加對(duì)應(yīng)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積（S3）與其在前處理之后添加對(duì)應(yīng)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積（S4）的比值（S3/S4）進(jìn)行計(jì)算。日內(nèi)精密度由一天內(nèi)不同時(shí)間下重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次進(jìn)樣檢測(cè)，日間精密度由連續(xù)3天重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果顯示：在1、5、20 ng/mL加標(biāo)水平下，血液中10種化合物的提取回收率為78．8%~94．7%，RSD為0．55%~15%；尿液中的提取回收率為79．8%~99．3%，RSD為0．44%~15%。表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。尿液中10種2C系列化合物的回收率和RSD見(jiàn)表3。

表3 尿液中10種2C系列化合物的回收率和日內(nèi)、日間精密度（n=3）Table 3 Recoveries，intra-day and inter-day precisions of 10 2C-series phenethylamines in urine（n=3）

2.5 方法應(yīng)用

為驗(yàn)證本方法的實(shí)用性，選取兩只雄性小鼠a、b，體重（200±20）g。在控制溫度（22±2）℃和濕度30%~70%的情況下，向小鼠a投喂含0．2 mg/kg 10種目標(biāo)化合物的食物，小鼠b作為空白對(duì)照。2 h后，分別取兩只小鼠血液各0．5 mL、尿液各0．5 mL，按照本方法進(jìn)行檢測(cè)。小鼠a的血液中檢出2C-H、2C-D、2C-P、2C-T-2、2C-T-4、2C-T-7、25D-NBOMe、25C-NBOMe、25BNBOMe、25I-NBOMe，質(zhì) 量 濃 度 分 別 為5．7、3．2、0．4、5．9、3．3、9．9、14．3、10．4、13．9、12．3 ng/mL；尿液中檢出上述化合物的質(zhì)量濃度分別為3．2、3．4、1．3、2．1、3．8、9．7、11．5、8．2、11．6、13．2 ng/mL；小鼠b的血液和尿液中未檢出10種目標(biāo)化合物。結(jié)果表明，該方法可以滿足血液、尿液檢材中10種目標(biāo)化合物的同時(shí)檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)法醫(yī)毒理學(xué)鑒定中常規(guī)的生物樣品血液和尿液，建立了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)生物樣品中10種2C系列化合物的分析方法。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)3種前處理方法的比較，確定采用甲醇沉淀蛋白作為前處理方法，通過(guò)對(duì)液相色譜與質(zhì)譜檢測(cè)條件的優(yōu)化，得到了較低的檢出限和定量下限。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法操作簡(jiǎn)便，取樣量少，靈敏度高，適用于血液、尿液中10種2C系列化合物的同時(shí)快速檢測(cè)。