微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化皂苷類化合物機(jī)制的研究進(jìn)展

李 倩，于 丹，國立東，都曉偉

微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化皂苷類化合物機(jī)制的研究進(jìn)展

李 倩，于 丹，國立東，都曉偉*

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

皂苷類化合物是天然藥物中存在的一類重要化學(xué)成分，通過微生物技術(shù)可以將其轉(zhuǎn)化為多種衍生物，常用的微生物主要為細(xì)菌和真菌，轉(zhuǎn)化反應(yīng)以水解脫去糖基為主，來提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的生物利用度和藥理活性。此外，通過羥基化、糖基化、羰基化和酯化等反應(yīng)，能夠降低底物的不良反應(yīng)，改善藥物功效。甾體皂苷的微生物轉(zhuǎn)化主要以皂苷與皂苷元之間的相互轉(zhuǎn)化為主，是實(shí)現(xiàn)某些特殊皂苷類化合物規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑。以人參皂苷、甘草次酸、黃芪皂苷、薯蕷皂苷、知母皂苷等為例，分析并闡述皂苷類化合物的微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化機(jī)制，以期為皂苷類成分生物合成及新藥研究開發(fā)提供參考。

微生物發(fā)酵；三萜皂苷；甾體皂苷；人參皂苷；甘草次酸；黃芪皂苷；薯蕷皂苷；知母皂苷；生物轉(zhuǎn)化；機(jī)制

皂苷類化合物是藥用植物重要的活性成分，廣泛存在于黃芪、黃精、三七、桔梗、人參、甘草、柴胡、知母、靈芝等中藥材中，具有保護(hù)心臟、增強(qiáng)免疫、抗炎、抗病毒等藥理作用。作為高相對分子質(zhì)量的兩親化合物，皂苷由親脂的皂苷元和親水的糖鏈部分組成[1]，根據(jù)苷元結(jié)構(gòu)的不同，其可劃分為三萜皂苷和甾體皂苷，三萜皂苷的苷元由30個碳原子組成，甾體皂苷的苷元由27個碳原子組成。根據(jù)連接糖鏈數(shù)目不同，其分為單糖鏈皂苷、雙糖鏈皂苷及三糖鏈皂苷，也有在糖鏈末端通過酯鍵連接其他基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。由于相對分子質(zhì)量大，膜通透性差，皂苷的體內(nèi)生物利用度低，但可以通過斷掉部分糖鏈等方法轉(zhuǎn)化成小分子化合物來促進(jìn)吸收，亦可通過生物轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以提高藥物的吸收利用，增強(qiáng)藥物的作用[2]。

微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物發(fā)酵藥物，通過微生物產(chǎn)生的酶及酶系產(chǎn)物等催化藥物部分成分發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得新的化合物或其他藥物成分。微生物在發(fā)酵過程中可以利用藥物中多糖、纖維、蛋白質(zhì)等成分獲取養(yǎng)分，藥物中低活性有效成分被轉(zhuǎn)化為高活性有效成分。研究表明，微生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)特異性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、條件溫和、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，且微生物繁殖能力強(qiáng)、生長周期短、適應(yīng)能力好，微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于天然藥物合成及結(jié)構(gòu)修飾，以達(dá)到減毒增效的目的[3]。

1 微生物轉(zhuǎn)化三萜皂苷

三萜皂苷通常是指骨架由30個碳原子組成的萜類化合物，一般是皂苷元與糖類結(jié)合或游離于植物中。三萜皂苷具有廣泛的藥理活性，如抗病毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗過敏等，被應(yīng)用于多種疾病的治療，在人參、甘草、黃芪等藥用植物中含量較高，作為主要成分發(fā)揮藥效。

1.1 人參皂苷

人參皂苷是五加科植物人參C. A. Mey.、西洋參L.、三七(Burk.) F. H. Chen等藥材中的主要活性成分，具有抗衰老、抗炎、抗老年癡呆、抗腫瘤、抗抑郁、抗心肌缺血、抗氧化、增強(qiáng)免疫等生物活性[4]。迄今為止，已報道180多種人參皂苷，并有60多種皂苷結(jié)構(gòu)被確定，包括含量較高的主要人參皂苷和含量極少的稀有人參皂苷。人參皂苷主要包含人參皂苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1等，稀有人參皂苷包含人參皂苷Rh1、Rh2、CK、Rh4、Rk1、Rg3、Rg5、Rk3等。眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，稀有皂苷具有更高的藥用價值，開發(fā)潛力大，因而將主要人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷是多年來研究的熱點(diǎn)[2]。近年來，對人參皂苷微生物轉(zhuǎn)化的報道較多，挖掘出了一定量的發(fā)酵菌株，其轉(zhuǎn)化途徑及發(fā)酵菌種情況見表1和圖1。

微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷的過程，主要依賴于微生物所產(chǎn)生的一系列酶系產(chǎn)物，如β-葡萄糖苷酶、α--阿拉伯呋喃糖苷酶、α-鼠李糖苷酶等，這些酶主動水解人參皂苷中的糖基，促使人參皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)化。

發(fā)酵過程中的主要作用酶是β-葡萄糖苷酶，但不同微生物來源的β-葡萄糖苷酶對糖苷鍵的水解作用不同，其水解的原因尚不明確。若轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1時，對C-20位糖基選擇性更高，則水解外側(cè)1分子葡萄糖獲得中間產(chǎn)物人參皂苷Rd，如冬蟲夏草菌、錐毛殼菌、伯克霍爾德菌GE17-7、長柄木霉、黑曲霉J7、副干酪乳酪桿菌堅韌亞種等；若對C-3位糖基選擇性更高，則獲得中間產(chǎn)物絞股藍(lán)皂苷ⅩⅤII[17]，如類消化乳桿菌LH4。中間產(chǎn)物人參皂苷Rd的C-20、C-3位仍然存在糖基，因此β-葡萄糖苷酶能繼續(xù)催化其生成不同的產(chǎn)物。對C-3位糖基選擇性更高，則生成人參皂苷F2，如冬蟲夏草菌、裂褶菌、黑曲霉J7等；若對C-20位糖基選擇性更高，則生成產(chǎn)物人參皂苷Rg3，如伯克霍爾德菌GE17-7、長柄木霉、副干酪乳酪桿菌堅韌亞種等。裂褶菌、黑曲霉J7等菌株的β-葡萄糖苷酶可以繼續(xù)水解使人參皂苷F2生成稀有人參皂苷CK。來自副干酪乳酪桿菌堅韌亞種MJM60396的β-葡萄糖苷酶可以繼續(xù)水解人參皂苷Rg3中C-3位的1分子葡萄糖，獲得終產(chǎn)物人參皂苷Rh2[16]。吳秀麗等[9]從人參根際分離并篩選出了1株真菌黑曲霉SRS-69，其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶同樣可以水解人參皂苷Re的C-20位糖基產(chǎn)生人參皂苷Rg2，并可以水解人參皂苷Rg1的C-3位糖基和人參皂苷Rf的C-6位糖基生成人參皂苷Rh[17]。

表1 人參皂苷微生物轉(zhuǎn)化途徑及發(fā)酵菌種

圖1 人參皂苷的微生物轉(zhuǎn)化途徑

發(fā)酵過程中的次要作用酶為α-鼠李糖苷酶和α--阿拉伯呋喃糖苷酶。α-鼠李糖苷酶專注于水解人參皂苷C-6位外側(cè)的鼠李糖基。黑曲霉SRS-69發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷Re、Rg2，其中α-鼠李糖苷酶水解人參皂苷Re和Rg2C-6位的鼠李糖基分別產(chǎn)生人參皂苷Rg1、Rh1[9]；來自茅臺酒曲的水棲纖維微菌Lyp51發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc，產(chǎn)生的α--阿拉伯呋喃糖苷酶作用于人參皂苷Rc C-20位的阿拉伯呋喃糖苷鍵，生成終產(chǎn)物人參皂苷Rd。

1.2 甘草皂苷

甘草皂苷是豆科植物甘草Fisch.中發(fā)揮藥理作用的主要成分，目前分離出甘草皂苷20余種，皂苷結(jié)構(gòu)一般是以3β-羥基齊墩果烷型五環(huán)三萜為苷元，連接2分子葡萄糖醛酸為主構(gòu)型，具有保肝、抗病毒、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗癌、抗哮喘、抗過敏等藥理活性[18-20]。同樣為三萜皂苷，甘草皂苷像人參皂苷一樣，結(jié)構(gòu)中糖鏈的多少直接影響其藥理作用和生理功能，可通過水解反應(yīng)去除部分或全部糖基來提高或改變其藥理作用。微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化主要是以甘草酸和甘草次酸為底物，探究其轉(zhuǎn)化途徑及機(jī)制。

1.2.1 甘草酸 其是從傳統(tǒng)中藥甘草根部提取出來的一種三萜類化合物，不僅可以作為天然的食品添加劑，還具有抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、抗炎等多種藥理活性[19]，在臨床上應(yīng)用于支氣管炎、肝炎等的治療，同時也用于疾病的輔助治療，如可緩解新型冠狀病毒肺炎患者的炎癥反應(yīng)等。甘草酸雖藥理作用較廣，但其結(jié)構(gòu)中含有2分子葡萄糖醛酸，極性較大，不易透膜，且具有首關(guān)效應(yīng)[20]，導(dǎo)致生物利用度低，故可以通過去除葡萄糖醛酸基團(tuán)來提高其生物利用度，并且不減弱藥理活性。多年以來，人們對甘草酸微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究頗多，發(fā)現(xiàn)了許多轉(zhuǎn)化菌種，但甘草酸的轉(zhuǎn)化途徑比較簡單，基本概括為甘草酸→甘草次酸、甘草酸→單葡萄糖醛酸甘草次酸（glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG）。

用于微生物轉(zhuǎn)化的菌株一般于發(fā)酵過程中產(chǎn)生β--葡萄糖醛酸苷酶，不同來源的β--葡萄糖醛酸苷酶對糖苷鍵的水解作用具有立體選擇性，一部分水解掉甘草酸的1分子葡萄糖醛酸得到單葡萄糖醛酸甘草次酸，另一部分則可以水解2分子葡萄糖醛酸得到甘草次酸。GAMG因只含有1分子葡萄糖醛酸，極性介于甘草酸和甘草次酸之間，具有很好的跨膜運(yùn)輸能力，溶解度較高，生物利用度增大。

研究表明，GAMG的甜度比甘草酸高5倍，可作為牛奶飲品、飲料、湯料等食品的添加劑[21]，增加食品風(fēng)味，也可作為遮蓋其他腥味、苦味等的去苦劑。在藥理作用方面，楊永安[22]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草酸衍生物在抗腫瘤活性上差異較大，β構(gòu)型化合物的活性比α構(gòu)型更弱，二糖結(jié)構(gòu)的化合物活性比單糖化合物的更弱，顯而易見，18α-GAMG具有比甘草酸和甘草次酸更高的抗腫瘤活性，相對安全且不良反應(yīng)較小，特別是對于肝癌有更好的效果，是潛在的抗肝癌新藥成分。微生物轉(zhuǎn)化途徑及發(fā)酵菌株見表2和圖2。

表2 甘草酸微生物轉(zhuǎn)化途徑及發(fā)酵菌株

A～R代表不同發(fā)酵菌株，同圖2

A—R represents different fermentation strains, same as fig. 2

圖2 甘草酸的微生物轉(zhuǎn)化途徑

1.2.2 甘草次酸 其是甘草酸三萜苷元成分，藥理作用包括抗病毒、保肝、抗癌等，可通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生以及調(diào)節(jié)相關(guān)通路來降低炎癥反應(yīng)，主要作用部位在肝臟[35]。對于一些原癌細(xì)胞或能夠引發(fā)惡性腫瘤的病毒均有抑制作用，如艾滋病毒、肝炎病毒等，但甘草次酸具有醛固酮樣活性，易導(dǎo)致低血鉀、高血壓、水腫等不良反應(yīng)，且極性小，高濃度時容易產(chǎn)生毒性，所以對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾來改善溶解性以及減輕不良反應(yīng)[36]。甘草次酸的結(jié)構(gòu)改變是在特定位點(diǎn)進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，如羥基化、羰基化、糖基化、乙酰化、酯化等，羥基化反應(yīng)發(fā)生在C-1、C-6、C-7、C-15、C-24、C-27位，羰基化主要發(fā)生在C-3和C-7位，糖基化主要出現(xiàn)在C-3和C-30位上，乙?；话l(fā)生在C-3位，酯化只發(fā)生在C-7與C-27位之間并成環(huán)。甘草次酸微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及發(fā)酵菌種見表3和圖3。甘草次酸本身無神經(jīng)保護(hù)活性，但當(dāng)C-3位無羰基化時，C-7位羥基化、C-15位羥基化、C-7位和C-15位同時羥基化時，神經(jīng)保護(hù)活性會顯著增強(qiáng)。

1.3 黃芪皂苷

黃芪皂苷是豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge主要活性成分之一，包括黃芪皂苷I、黃芪皂苷II、黃芪皂苷III、黃芪甲苷等[46]，藥理作用廣泛，如抗病毒、抗哮喘、抗炎、抗纖維化、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能等，黃芪皂苷在黃芪的研究中占有舉足輕重的位置，盡管目前國內(nèi)關(guān)于黃芪微生物發(fā)酵方面的研究并不十分豐富，但均極具代表性，可以通過優(yōu)化皂苷結(jié)構(gòu)而得到新的化合物，從而降低不良反應(yīng)，提高藥理活性。

1.3.1 真菌發(fā)酵 阮鳴[47]使用香菇(Berk.) Pegler、靈芝(Leyss. ex Fr.) Karst、姬松茸Murill和桑黃(L. ex Fr)等不同的藥（食）用真菌發(fā)酵黃芪，發(fā)現(xiàn)均可以將黃芪甲苷轉(zhuǎn)化成異黃芪甲苷。并推測其轉(zhuǎn)化機(jī)制為靈芝菌發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的某種木糖苷酶水解黃芪甲苷的1分子木糖后將其轉(zhuǎn)化成異黃芪甲苷。

劉曉會[48]篩選出了1種能夠從黃芪總皂苷中高效轉(zhuǎn)化出黃芪甲苷的菌株傘枝犁頭霉AS2，在黃芪總皂苷中鑒定出4個可以轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷的化合物，分別為黃芪皂苷I、黃芪皂苷II、異黃芪皂苷I、異黃芪皂苷II，這4個化合物與黃芪甲苷的區(qū)別就是結(jié)構(gòu)上多了1個或2個乙?；?，因此揭示了傘枝犁頭霉中含有黃芪皂苷去乙?；福⑶掖嗣笇Φ孜锏膶Ｒ恍暂^差，繼而驗(yàn)證了4個前體化合物轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷的具體途徑：黃芪皂苷I→（異黃芪皂苷II、黃芪皂苷II）→黃芪甲苷、黃芪皂苷II→黃芪甲苷、異黃芪皂苷I→黃芪皂苷II→黃芪甲苷、異黃芪皂苷II→黃芪皂苷II→黃芪甲苷。黃芪甲苷的抗病毒、抗癌、抗糖尿病、抗心肌損傷等作用使其開發(fā)成為臨床新藥，解決了化學(xué)合成方法較為復(fù)雜且困難的問題。

1.3.2 細(xì)菌發(fā)酵 Wang等[49]從土壤中分離并篩選出了一株芽孢桿菌LG-502sp. LG-502，并推測其對黃芪甲苷的轉(zhuǎn)化途徑為黃芪甲苷→ cyclogaleginoside B→環(huán)黃芪醇，芽孢桿菌中的葡萄糖苷酶和木糖苷酶在此途徑中發(fā)揮了主要作用，由于2種酶存活的最適溫度、最適pH等條件不同，葡萄糖苷酶在芽孢桿菌的培養(yǎng)條件下比木糖苷酶活性更高，所以黃芪甲苷優(yōu)先脫掉1分子葡萄糖，其次脫掉1分子木糖，得到環(huán)黃芪醇。黃芪甲苷結(jié)構(gòu)中含有糖基，極性較大，影響生物利用度，而脫掉2分子糖基后的環(huán)黃芪醇具有良好的膜通透性，并且環(huán)黃芪醇可以激活端粒酶，達(dá)到抗衰老、增強(qiáng)免疫力等功效[50]，在臨床醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛。

表3 甘草次酸微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及發(fā)酵菌株

a～j代表不同發(fā)酵菌株，同圖3

a—j represents different fermentation strains, same as fig. 3

圖3 甘草次酸微生物轉(zhuǎn)化途徑[45]

黃芪皂苷微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化途徑見圖4。

圖4 黃芪皂苷微生物轉(zhuǎn)化途徑

人參、甘草、黃芪的三萜皂苷生物轉(zhuǎn)化中微生物以真菌居多，反應(yīng)機(jī)制以水解反應(yīng)為主，通常發(fā)生在C-3、C-6、C-20位等，脫掉糖基，既能提高生物利用度，也能選擇性增強(qiáng)抗癌、抗病毒、抗炎等藥理活性；除了水解反應(yīng)，還包括去乙?；?、羥基化、糖基化、羰基化、乙?；确磻?yīng)，具體發(fā)生在C-1、C-6、C-7、C-15、C-24、C-27位等，降低底物的不良反應(yīng)，改善功效，有利于藥物的研究和開發(fā)。

2 微生物轉(zhuǎn)化甾體皂苷

甾體皂苷是以螺甾烷類化合物與糖基結(jié)合的甾體苷類，基本母核由27個碳原子構(gòu)成，并且結(jié)構(gòu)中具有6個環(huán)，為螺甾烷衍生物。較早以前，甾體皂苷已經(jīng)成為激素類以及甾體避孕藥等的原料，后期臨床中開發(fā)出了多種新藥，在治療心絞痛、心肌缺血、糖尿病、心臟病等方面有明顯成效，應(yīng)用甚廣。甾體皂苷多存在于單子葉植物中，雙子葉植物中非常少，在穿山龍、黃精、重樓、知母等藥用植物中常見[51]。

2.1 薯蕷皂苷

甾體皂苷微生物轉(zhuǎn)化中比較典型的代表為薯蕷皂苷。薯蕷皂苷主要存在于薯蕷科植物黃山藥Prain et Burk.、穿龍薯蕷Makino和盾葉薯蕷C. H. Wright中，具有抗癌、降血糖、調(diào)血脂、抗氧化等作用[52]，并且仍然作為合成甾體避孕藥物以及部分激素類藥物的重要原料，但薯蕷皂苷脂溶性較大，生物利用度不高，對薯蕷皂苷進(jìn)行一定的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和修飾，可提高其生物利用度和藥效作用。

2.1.1 真菌發(fā)酵 劉琳[53]發(fā)現(xiàn)盾葉薯蕷中含量較多的甾體皂苷為薯蕷皂苷和盾葉新苷，利用哈茨木霉可將這2種成分轉(zhuǎn)化成薯蕷皂苷元，并且苷元得率較高，轉(zhuǎn)化途徑見圖5。發(fā)酵過程中，哈茨木霉所分泌的纖維素酶可破壞盾葉薯蕷的細(xì)胞壁，使皂苷類成分釋放出來，盾葉新苷在葡萄糖淀粉酶作用下脫掉鼠李糖基，繼而被胞外β-葡萄糖苷酶水解掉葡萄單糖得到延齡草次苷，延齡草次苷進(jìn)入菌體胞內(nèi)，促使哈茨木霉產(chǎn)生胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶，進(jìn)而水解掉延齡草次苷末端的葡萄二糖，最終生成薯蕷皂苷元。如果利用米曲霉CICC 2436[54]轉(zhuǎn)化2種薯蕷皂苷，主要是α--鼠李糖苷酶、β--葡萄糖苷酶以及外切-1,4-β--葡萄糖苷酶發(fā)揮水解作用，并且鼠李糖的水解速度比葡萄糖水解速度快，先水解掉鼠李糖，再從末端逐個水解掉葡萄糖得到薯蕷皂苷元，因此盾葉新苷不能轉(zhuǎn)化成為薯蕷皂苷。Zheng等[55]采用里氏木霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化盾葉薯蕷皂苷為薯蕷皂苷元，而延齡草次苷是中間產(chǎn)物，相關(guān)酶首先水解掉外側(cè)的鼠李糖，再裂解葡萄糖苷鍵，去掉所有糖鏈獲得苷元[56]，此菌轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷元的效率可達(dá)90%。郭夢真[57]篩選出的1株塔賓曲霉，可以將薯蕷皂苷先轉(zhuǎn)化為延齡草次苷，再轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元，并揭示了塔賓曲霉先水解掉外側(cè)鼠李糖，后水解葡萄糖的規(guī)律。薯蕷皂苷元與其他薯蕷皂苷衍生物不同的是，沒有側(cè)鏈或糖鏈，苷元是發(fā)揮藥理作用的中心結(jié)構(gòu)，所以薯蕷皂苷元比其他多側(cè)鏈衍生物的藥效更強(qiáng)一些。

利用從穿龍薯蕷中提取分離的少根根霉原變種var.發(fā)酵穿龍薯蕷藥液，可使薯蕷皂苷元含量增加，此菌株能夠高效轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷，且提高薯蕷皂苷元的提取率[58]。一方面菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生的生物酶會使藥液中的細(xì)胞壁破裂，薯蕷皂苷元破壁而出，從而提高了苷元提取率；另一方面菌株發(fā)酵所產(chǎn)生的淀粉酶能夠斷裂糖苷鍵，導(dǎo)致藥材中的薯蕷皂苷脫掉糖鏈，轉(zhuǎn)變成苷元。陳宇[59]從盾葉薯蕷根部篩選出3株菌，均能將薯蕷皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元，分別是米曲霉GIM 3GIM 3、No.2.20140425和泡盛曲霉，它們的轉(zhuǎn)化機(jī)制大體相同，也是通過產(chǎn)生糖苷酶，逐步水解糖鏈得到次級苷以及苷元。經(jīng)篩選及優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)No.2.20140425和泡盛曲霉混合發(fā)酵后的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到71.57%。

吳廣畏[60]發(fā)現(xiàn)真菌雜色云芝(L.) Fr.可以發(fā)酵轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷元，轉(zhuǎn)化途徑見圖6，由細(xì)胞色素P450單加氧酶系催化生成5個產(chǎn)物，首次發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元C-21位甲基可以被羥基化，并且在C-7、C-12、C-15位都可以羥基化，據(jù)推測，5個產(chǎn)物應(yīng)該是由不同的細(xì)胞色素P450氧化酶催化而成。

圖5 薯蕷皂苷的微生物轉(zhuǎn)化途徑

圖6 雜色云芝發(fā)酵轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷元的途徑

有報道利用刺孢小克銀漢霉CGMCC 3.2716的靜息細(xì)胞發(fā)酵轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷元，得到4種代謝物，并推測出了1個中間產(chǎn)物（化合物I）[61]，見圖7，研究發(fā)現(xiàn)該菌會產(chǎn)生不同的細(xì)胞色素P450單加氧酶，一種酶可以只催化C-7位羥基化，一種酶可以催化C-7位或C-11位發(fā)生羥基化，還有一種酶可以催化C-7位或C-12位發(fā)生羥基化，其中的脫氫酶通過中間產(chǎn)物促使C-11位羥基脫氫成酮，但由于反應(yīng)速度過快，只能測到最終產(chǎn)物(25)-spirost-5-ene-3β,7β-diol-11-one。

圖7 刺孢小克銀漢霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷元的途徑

全波等[62]培養(yǎng)米曲霉AS3.951來發(fā)酵轉(zhuǎn)化原薯蕷皂苷。米曲霉既可以先水解原薯蕷皂苷C-3位外側(cè)的一分子鼠李糖基生成26--β-glucopyranosyl(25)-22-hydroxy-5-ene-furostane-3β,26-diol-3--[α-rhamnopyranosyl]-β-glucopyranoside（8-2），并且其他位置不發(fā)生變化；也可以將C-20位羥基還原成雙鍵形成26--β-glucopyranosyl(25)-5,20 (22)-dienefurostane-3β,26-diol-3--[(α-rhamnopyranosyl)- α-rhamnopyranosyl]-β-glucopyranoside（8-3）和26--β-glucopyranosyl(25)-5,20(22)-diene-furostane-3β,26-diol-3--[α-rhamnopyranosyl]-β-glucopyranoside（8-4）；還可以繼續(xù)斷裂C-26位糖鏈形成diosgenin-3--[(α-rhamnopyranosyl)-α-rhamnopyranosyl]-β-glucopyranoside（8-5）和diosgenin-3--[α-rhamnopyranosyl]- β-glucopyranoside（8-6）。崔乃菠等[63]利用酵母菌發(fā)酵菊葉薯蕷，將原薯蕷皂苷轉(zhuǎn)化成薯蕷皂苷，通過工藝優(yōu)化達(dá)到富集薯蕷皂苷的目的，并推測轉(zhuǎn)化途徑見圖8，原薯蕷皂苷屬于呋甾皂苷，薯蕷皂苷屬于螺甾皂苷，呋甾皂苷上的糖鏈比螺甾皂苷的多，且水溶性較高，研究表明，C-26位的糖苷鍵比C-3位的糖苷鍵更容易斷裂，故通常呋甾皂苷水解掉C-26位糖苷鍵轉(zhuǎn)化為螺甾皂苷。酵母菌產(chǎn)生相關(guān)生物酶，使原薯蕷皂苷在發(fā)酵過程中自薯蕷藥材細(xì)胞中破壁而出，同時使薯蕷皂苷更好地擴(kuò)散于提取介質(zhì)中，其中的水解酶使原薯蕷皂苷C-26位上糖鏈斷裂獲得薯蕷皂苷，因此薯蕷皂苷含量有了顯著的提升。

圖8 原薯蕷皂苷的微生物轉(zhuǎn)化途徑

2.1.2 細(xì)菌發(fā)酵 1株弗吉尼亞鏈霉菌IBL14被報道將薯蕷皂苷元發(fā)酵轉(zhuǎn)化為異壬酮，中間產(chǎn)物為薯蕷酮，研究人員揭示其轉(zhuǎn)化機(jī)制是由菌株發(fā)酵產(chǎn)生的膽固醇氧化酶將苷元催化生成薯蕷酮，薯蕷酮C-25位發(fā)生羥基化得到異壬酮，這是首次發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元C-25位上的叔羥基化反應(yīng)[64]。轉(zhuǎn)化途徑見圖9。

薯蕷皂苷出現(xiàn)了皂苷與皂苷元之間的轉(zhuǎn)化，同樣以糖苷酶水解脫糖為主，進(jìn)一步暴露苷元結(jié)構(gòu)。在這些微生物發(fā)酵過程中，產(chǎn)生了罕見的細(xì)胞色素P450單加氧酶，催化特定位點(diǎn)發(fā)生羥基化。而另一種特殊的膽固醇氧化酶導(dǎo)致羰基化，催化生成新的化合物。

圖9 弗吉尼亞鏈霉菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷元的途徑

2.2 知母皂苷

知母皂苷主要來源于百合科植物知母Bunge，屬于甾體皂苷類，包括知母皂苷I～I(xiàn)V、AI～AIV、BI～BIV等[65]，知母皂苷具有抗腫瘤、抗抑郁、抗阿爾茨海默病、降血壓、降血糖等藥理活性[66]，對于某些知母皂苷，改變構(gòu)型或進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可以增強(qiáng)其原有的藥效或減輕不良反應(yīng)。

Hu等[67]利用釀酒酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化知母皂苷AIII，最終目標(biāo)產(chǎn)物為其立體異構(gòu)體(20,25)-5β-spirostane- 3β-ol-3--β-glucopyranosyl-β-galacopyanoside（10-1），知母皂苷AIII及其立體異構(gòu)體均具有生長抑制作用，轉(zhuǎn)化途徑見圖10。此轉(zhuǎn)化過程中，知母皂苷AIII首先在糖基轉(zhuǎn)移酶催化下C-26位開環(huán)并發(fā)生糖基化反應(yīng)生成知母皂苷BII；其次知母皂苷BII脫水生成知母皂苷BIII；知母皂苷BIII通過加水、環(huán)化、重排3個反應(yīng)生成知母皂苷AIII的立體異構(gòu)體；知母皂苷BII及知母皂苷BIII的C-15位羥基化分別生成15-羥基-知母皂苷BII和15-羥基-知母皂苷BIII。發(fā)酵工藝優(yōu)化有望更高效地生產(chǎn)化合物10-1。

Zhao等[68]利用膠孢炭疽菌轉(zhuǎn)化知母皂苷BII，轉(zhuǎn)化途徑見圖11，通過鑒別其代謝物結(jié)構(gòu)來推斷藥理作用機(jī)制。研究證明，此菌中的糖苷酶可以同時水解C-3位和C-26位葡萄糖得到知母皂苷AI和知母皂苷AIII，并產(chǎn)生了水解產(chǎn)物的C-22位對映異構(gòu)體[(25)-5β-spirostan-3β-yl]2--(β-glucopyranosyl)-β-galactopyranoside（11-1）和25()-22β--spirostane-3β--galactopyranside（11-2），最終異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化量多于原型，這是關(guān)于單一微生物同時裂解C-3位和C-26位糖基的首次報道。

甾體皂苷的微生物轉(zhuǎn)化中，多數(shù)以皂苷與皂苷元之間的相互轉(zhuǎn)化為主，其中在C-3、C-26位通常會發(fā)生水解反應(yīng)，羥基化主要發(fā)生在C-7、C-11、C-12、C-15、C-21、C-25位等，C-20位發(fā)生還原反應(yīng)，C-26位易開環(huán)發(fā)生糖基化反應(yīng)。與三萜皂苷相比，甾體皂苷的微生物轉(zhuǎn)化機(jī)制簡單，涉及到的反應(yīng)類型少，但為特定衍生物的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新方法。

3 結(jié)語與展望

通過微生物發(fā)酵技術(shù)，可以將皂苷類化合物轉(zhuǎn)化為多種衍生物，為生物活性篩選提供新的結(jié)構(gòu)，同時也是特殊皂苷類化合物擴(kuò)大生產(chǎn)的有效途徑。能夠進(jìn)行皂苷類成分生物轉(zhuǎn)化的微生物種類繁多，包括細(xì)菌和真菌，轉(zhuǎn)化機(jī)制主要有羥基化、糖基化、羰基化、水解和酯化等；與真菌相比，細(xì)菌的相關(guān)報道較少，且轉(zhuǎn)化機(jī)制與真菌類似，而其他類型的微生物如放線菌的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化則更為少見。目前，微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化皂苷類化合物取得了較大的進(jìn)展，但在技術(shù)和方法上仍需著力解決以下幾個方面的問題。首先，菌種的選育是微生物發(fā)酵的前提，大多數(shù)研究所選用的菌種包括3個來源：一是從能夠產(chǎn)生糖苷酶的已知菌種中篩選出轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)良菌種；二是從藥用植物生長環(huán)境中的微生物篩選出具有轉(zhuǎn)化優(yōu)勢的優(yōu)良菌種；三是從植株機(jī)體組織所含有的內(nèi)生菌中篩選優(yōu)良菌種，內(nèi)生菌作為植株中不可或缺的一部分，與植株同生長、共進(jìn)化，在轉(zhuǎn)化藥用植物的有效成分上具有不可比擬的優(yōu)勢。其次，皂苷與微生物發(fā)酵體系的穩(wěn)定性是轉(zhuǎn)化過程的重要方面，擁有穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系，可以擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，提高轉(zhuǎn)化率，節(jié)約生產(chǎn)成本，因此開發(fā)固定化的發(fā)酵體系是解決問題的關(guān)鍵。此外，在優(yōu)良的發(fā)酵菌種和穩(wěn)定的發(fā)酵體系基礎(chǔ)上，產(chǎn)物的分離技術(shù)仍有待提高，根據(jù)特定的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)開發(fā)應(yīng)用合理且降低生產(chǎn)成本的分離手段，將會推進(jìn)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化皂苷類化合物持續(xù)走向工業(yè)化進(jìn)程。

圖10 知母皂苷AIII的微生物轉(zhuǎn)化途徑

圖11 知母皂苷BII微生物轉(zhuǎn)化途徑

微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化皂苷類化合物的機(jī)制還有很大的研究空間，應(yīng)用現(xiàn)代色譜、質(zhì)譜等技術(shù)，深度挖掘皂苷類成分的轉(zhuǎn)化原理，隨著酶工程、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、基因工程等技術(shù)的迅速發(fā)展，可以通過多基因集成的工程菌，實(shí)現(xiàn)皂苷類化合物多步驟的系列轉(zhuǎn)化，為藥物的基礎(chǔ)性研究和新藥研發(fā)提供新思路、新途徑。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on mechanism of transformation of saponins by microbial fermentation

LI Qian, YU Dan, GUO Li-dong, DU Xiao-wei

College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

Saponins are a class of important chemical components in natural medicines. Microbial fermentation technology can convert saponins into various derivatives. The microorganisms that can transform saponins are mainly bacteria and fungi. The hydrolysis reaction is the main method, and the sugar group is removed, which can improve the bioavailability and pharmacological activity of the transformation product. In addition, through reactions such as hydroxylation, glycosylation, carbonylation, and esterification, the side effects of the substrate are reduced, and the drug efficacy is improved. The microbial transformation of steroidal saponins is mainly based on the mutual transformation between saponins and sapogenins, which is an effective way to realize the large-scale production of some special saponins. In this paper, ginsenoside, glycyrrhetinic acid, astragaloside, dioscin, timosaponin and other medicinal materials are used as examples to analyze the microbial transformation mechanism of saponins, in order to provide reference for the biosynthesis of saponins and the development of new drugs.

microbial fermentation; triterpenoid saponins; steroidal saponins; ginsenoside; glycyrrhetinic acid; astragaloside; dioscin; timosaponin; biotransformation; mechanism

R282.15

A

0253 - 2670(2022)22 - 7264 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.031

2022-06-21

國家自然科學(xué)基金資助項目（81872967）

李 倩（1999—），女，碩士研究生。E-mail: LQ18847101179@163.com

都曉偉（1962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與新藥研發(fā)。Tel: (0451)87260824 E-mail: xiaoweidu@hotmail.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]