基于弱鍵誘導的小檗堿-黃酮苷類超分子“結構-構象-形態(tài)-活性”傳導關系探討中藥配伍理論科學內(nèi)涵

劉小靖，李 桐，袁枝花，皮雯敏，郭文博，王志家，雷海民，王鵬龍

基于弱鍵誘導的小檗堿-黃酮苷類超分子“結構-構象-形態(tài)-活性”傳導關系探討中藥配伍理論科學內(nèi)涵

劉小靖，李 桐，袁枝花，皮雯敏，郭文博，王志家，雷海民*，王鵬龍*

北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102

以2種不同的超分子，即黃芩苷-小檗堿（BA-BBR NG）和漢黃芩苷-小檗堿（WOG-BBR NF）為研究對象，利用弱鍵化學從“結構-構象-形態(tài)-活性”相關性探討中藥配伍“驅(qū)邪不傷正”的科學內(nèi)涵?；?個超分子葡萄糖醛酸基團構象（A式和N式）的不同，結合2D-NMR分析和最低能量構象研究，采用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）、場發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM）對超分子進行表征，從宏觀和微觀現(xiàn)象的不同探討這種結構和構象的差異對超分子形態(tài)的影響；同時，通過微量肉湯稀釋法、平板劃線法、細菌形態(tài)觀察及生物膜清除實驗評價超分子活性的差異。BA-BBR NG形態(tài)隨濃度變化，當濃度大于成膠濃度（＞10 mmol/L），其形態(tài)在電鏡中觀察到球形超分子逐步形成“珍珠鏈”狀超分子，而WOG-BBR NF在各濃度下均為非交聯(lián)的剛性納米纖維；BA、WOG的最優(yōu)構型分別為N式和A式，但當它們各自和BBR通過弱鍵作用力自組裝后，最優(yōu)構型則轉(zhuǎn)變成了A式和N式；另外，體外抑菌研究表明2個超分子對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌的抑制作用與小檗堿相比明顯不同，且超分子抑菌活性呈現(xiàn)“選擇性”。中藥超分子物質(zhì)基礎與單體成分相比具有獨特性，單體成分結構和構象的不同，會導致分子間相互作用在弱鍵誘導下形成不同的超分子形態(tài)，進而影響生物活性。

黃芩苷；漢黃芩苷；小檗堿；構象；活性；超分子；弱鍵化學

近年來，中藥復方在煎煮過程中出現(xiàn)的“渾濁”現(xiàn)象以及中藥來源小分子的自組裝形成超分子現(xiàn)象逐漸引起了廣泛地關注，成為國內(nèi)外學者研究的熱點之一，這也為更好地探索中藥復方物質(zhì)基礎和配伍理論提供了一個新的研究方向。黃芩-黃連是臨床上常用的一類具有清熱燥濕功效的經(jīng)典藥對，出自東漢張仲景《傷寒論》，二者相須配伍“增效減毒”，如黃連解毒湯、葛根芩連湯等[1]。當前許多研究表明黃芩中主要有效成分為黃酮類化合物，含量較為豐富的有黃芩苷（baicalin，BA）、漢黃芩苷（wogonoside，WOG）等[2-3]。黃連的主要有效成分為生物堿類，其中最具有代表性的是小檗堿（berberine，BBR）[4-5]。同時，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯呈現(xiàn)復雜多相態(tài)，甚至在煎煮時會出現(xiàn)明顯的自沉淀現(xiàn)象，化學和生物學研究均表明多相態(tài)的成因是藥效成分相互作用的結果，例如該方湯劑的多相態(tài)主要與黃芩中黃酮類成分和黃連中生物堿類成分在弱鍵誘導下相互作用密切相關[6-8]。

在有機化合物分子中，構象是指由C-C單鍵旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生的原子或基團在空間排列的無數(shù)特定的形象。分子的構象不僅能改變化合物的物理和化學性質(zhì)，還會在一定程度上影響其活性[9]。Ren等[10]研究發(fā)現(xiàn)某類含有阿拉伯糖基的齊墩果烷型三萜皂苷，其活性會因阿拉伯糖基構象的變化而完全喪失活性。楊仕平等[11]研究魚藤酮晶體結構和活性的關系，發(fā)現(xiàn)其生物活性會隨著環(huán)II和III構象的不同而有所不同。構型和構象對分子相互作用的影響研究主要集中于DNA、蛋白以及多糖類等大分子，少有報道將天然小分子化合物分子構象與超分子形成機制相聯(lián)系。超分子屬于超分子化學的研究范疇，是指基本結構單元在弱鍵（氫鍵作用力、靜電引力、π-π堆積等）的驅(qū)動下，自發(fā)的聚集形成納米尺度的有序聚集態(tài)結構的過程[12-15]，且此過程往往是可逆和可調(diào)控的。在前期本課題組利用等溫滴定量熱儀、核磁以及質(zhì)譜等技術解析BBR和BA或WOG的具體結合比例均是1∶1，并對二者分別形成類球形納米水凝膠（nanogel，NG）和納米纖維（nanofiber， NF）的機制進行研究，并發(fā)現(xiàn)這2個超分子形態(tài)的不同與WOG中8位甲氧基的存在有一定關系，結構的差異導致水煎煮過程中分子間相互作用力存在明顯差異[16]；在此基礎上，本實驗進一步探討黃芩苷-小檗堿（BA-BBR NG）和漢黃芩苷-小檗堿（WOG-BBR NF）超分子濃度、葡萄糖醛酸構象的不同導致的微觀形態(tài)差異，并利用條件致病菌（大腸桿菌）、致病菌（金黃色葡萄球菌）和益生菌（屎腸球菌）模型，更加全面地探討超分子形態(tài)的改變對抑菌活性的影響，借此揭示中藥復方物質(zhì)基礎存在“化學結構-分子構象-超分子形態(tài)-生物活性”間的關系，以期更深入地探索中藥配伍“驅(qū)邪不傷正”的科學內(nèi)涵。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MS105 Semi-Micro十萬分之一電子天平（瑞士MettlerToledo公司）；C-MAG-HS4磁力攪拌器（德國 IKA有限公司）；FRESCO21臺式微量離心機（美國熱電科技儀器有限公司）；真空冷凍干燥機（德國 Christ公司）；Hitachi SU-8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國IKA有限公司）；JOEL JEM-2100F透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Leica TCSSP8型激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）；YXQ-LS-75SII型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；LRH-250型恒溫生化培養(yǎng)箱（廣州瑞明儀器有限公司）；Multiskan GO型多功能酶標儀（芬蘭熱電科技儀器有限公司）。

1.2 材料

鹽酸小檗堿（BBR，成都普瑞法科技有限公司公司，質(zhì)量分數(shù)＞98%）；BA（北京伊諾凱科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)＞98%）；WOG（北京伊諾凱科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)＞98%）；二甲基亞砜（DMSO）、氫氧化鈉（北京化工廠）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 制備超分子

稱取適量BA和WOG，將二者分別調(diào)制為pH 7.0的水溶液，在80 ℃下與BBR鹽酸鹽水溶液以1∶1（0.1 mmol/L）的比例混合，加熱攪拌1 h，離心（9000 r/min）10 min，沉積物水洗3次，收集得到BA-BBR NG、WOG-BBR NF，凍干，備用。

2.2 超分子和細菌形態(tài)表征

利用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）、場發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM）對樣品及其干預治療后的細菌進行形態(tài)學分析。

2.3 微量肉湯稀釋法

觀察各樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和屎腸球菌的體外抑菌作用。將干燥后的樣品溶于二甲基亞砜和營養(yǎng)液（1∶1）中，配制成濃度為10 μmol/mL的待測液備用，利用24孔板，第1孔加入200 μL樣品溶液，再用營養(yǎng)培養(yǎng)基連續(xù)稀釋，使各樣品的濃度梯度為1.0、0.75、0.5、0.25、0.375、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05及0.025 μmol/mL（DMSO濃度低于5%），終體積為1 mL。每孔加50 μL（2×106CFU/mL）細菌培養(yǎng)物，搖勻。同時以BBR為陽性對照，營養(yǎng)培養(yǎng)基為溶劑對照。然后將24孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16 h，采用酶標儀在600 nm波長下測定菌懸液的吸光度（）值。所有實驗重復3次，根據(jù)公式計算樣品對細菌的抑制率。

抑制率＝1－(樣品－溶劑)/(空白菌－溶劑)

2.4 平板劃線法

再次通過平板劃線法測定各樣品的抑菌活性，將上述各樣品不同濃度下獲得的菌液用滅菌后的接菌種環(huán)分區(qū)劃線接種于營養(yǎng)瓊脂板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，觀察菌落數(shù)。

2.5 清除生物膜

于48孔板內(nèi)加入用培養(yǎng)基（含1%葡萄糖）稀釋10倍后的菌懸液，每孔500 μL，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用注射器輕輕吸除培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液（PBS）洗滌1次后，加入含BBR以及BA-BBR NG、WOG-BBR NF的培養(yǎng)基，使?jié)舛葹?.05 μmol/mL，同時以培養(yǎng)基為空白，繼續(xù)在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。藥物干預結束后，用注射器輕輕吸除液體培養(yǎng)基，PBS清洗3次，再用等量體積分數(shù)2.5%戊二醛固定4 h后，PBS清洗3次，然后用梯度濃度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）分別洗脫，每次脫水10 min，充分干燥后，在SEM下觀察各樣品對生物膜的清除情況。

按照上述方法在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)生物膜，藥物干預后，PBS清洗3次，再加入吖啶橙（強熒光生物膜生物量指示劑），LSCM避光拍照。

2.6 細菌形態(tài)觀察

于24孔板中用營養(yǎng)培養(yǎng)基稀釋BBR、BA-BBR NG及WOG-BBR NF，至終濃度為0.025 μmol/mL，加入等量菌液，搖勻，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 8 h后，收集菌懸液在3000 r/min下離心10 min，收集細菌。PBS清洗3次，加入體積分數(shù)為2.5%的戊二醛固定4 h，然后用梯度濃度為30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇水溶液和乙醇洗脫，每次10 min，再用乙醇溶解細菌樣品，取3 μL滴在硅片上，干燥后噴金，并用FESEM進行檢測分析。

3 結果

3.1 超分子“結構-構象-弱鍵-形態(tài)”表征

3.1.1 超分子的形態(tài)表征 根據(jù)試管倒置法的結果（圖1-A），BA-BBR NG的宏觀形態(tài)是水凝膠，而WOG-BBR NF則表現(xiàn)為黃色沉淀；同時如FESEM圖像（圖1-B）所示，可以很清楚地看到，BA-BBR NG的視野中充滿了大量水凝膠經(jīng)典的交聯(lián)和纏繞結構，這與前期在低濃度下觀察的球形顆粒狀超分子形態(tài)顯著不同[16]；并且首次發(fā)現(xiàn)當BA-BBR NG濃度大于成膠濃度（＞10 mmol/L），其形態(tài)在電鏡中觀察到球形超分子逐步形成“珍珠鏈”狀超分子，分子相互交疊，形成含有球形、線形及交聯(lián)狀等各類形態(tài)超分子的“過渡態(tài)”（圖1-C），具體的組裝過程如圖1-D所示；同時在WOG-BBR NF的FESEM圖中（圖1-B），只能觀察到直徑為百納米級、長度為微米級的非交聯(lián)的剛性納米纖維，未發(fā)現(xiàn)其微觀形態(tài)隨濃度變化。

如圖2所示，利用LSCM分別在明場和綠場（激發(fā)波長為488 nm）下也觀察到了不同形態(tài)的超分子，顯而易見的是，BBR單體的水溶液經(jīng)干燥后會析出針狀晶體，BA-BBR NG為片層狀的干凝膠，而WOG-BBR NF則分離出絲狀纖維，與此同時，所有超分子體都能產(chǎn)生類似于BBR的綠色熒光，與掃描電鏡的實驗結果保持了一致。宏觀和微觀現(xiàn)象的數(shù)據(jù)初步驗證了本研究的推測，即結構和構象的不同會在一定程度上影響超分子的形態(tài)特征。

3.1.2 超分子“結構-構象-弱鍵”關系研究 在前期工作基礎上，結合已有的ROESY譜圖（圖3-A），能看到BA的H-1′′，5′′與自身H-8相關（交叉點b、c），這說明BA的糖基團與母核相互靠近，超分子單元呈現(xiàn)“U”形，而WOG中H-1′′，5′′與H-6之間有空間相關（交叉點b、c），表明糖基團遠離了母核，從而呈現(xiàn)“I”形。進一步分析8-OCH3取代基的有無導致超分子中黃酮類糖基團構象的不同，即雖然BA和WOG的糖基團均為椅式構象，但前者以A式（alternative form，交替式）構象存在，后者以N式（normal form，正常式）構象存在[17]（圖3-C），故在靜電引力和疏水作用下，BBR和BA或WOG形成超分子的過程中，分別形成親水的糖基團在外側(cè)、疏水的芳環(huán)在內(nèi)側(cè)的“U形”自組裝單元和親水的糖基團在內(nèi)側(cè)、疏水的芳環(huán)在外側(cè)的“I形”自組裝單元（圖3-A）[16]?；谏鲜龇治?，進一步通過Chem 3D的MM2分子力場對BA、WOG以及BA-BBR NG、WOG-BBR NF中糖基的A式和N式構象分別進行了初步的構型優(yōu)化，從而得到最優(yōu)構型的總能量見表1，具體構型見圖3-B。通過能量值發(fā)現(xiàn)，BA、WOG的最優(yōu)構型分別為N式和A式，但當它們和BBR通過弱鍵作用力自組裝后，最優(yōu)構型則轉(zhuǎn)變成了A式和N式；另外，Wang等[18]通過BA-BBR NG和WOG-BBR的NOESY譜圖以及NaBH4還原實驗發(fā)現(xiàn)2個超分子的構象有很大的不同，這也與本實驗的結論相一致，即單體成分的結構和構象不同會導致分子間在弱鍵誘導下相互作用形成不同的超分子形態(tài)。

3.2 游離單體與超分子抑菌活性研究

3.2.1 利用肉湯比濁法測定超分子對3種細菌抑制活性 為更全面地探討“結構-構象-形態(tài)-活性”的相關性，分別用BBR、BA-BBR NG和WOG-BBR NF對條件致病菌（大腸桿菌）、致病菌（金黃色葡萄球菌）以及益生菌（屎腸球菌）進行了體外抗菌活性試驗。另外，由于前期發(fā)現(xiàn)BA和WOG在此抑菌濃度下活性較弱[16]，故未作為對照組設置。由圖4-I-A可知，對于大腸桿菌，WOG-BBR NF在各個濃度下均表現(xiàn)出與BBR相似的抑菌效果；BA-BBR NG的抑菌效果明顯減弱，在最高濃度（1 μmol/mL）時，抑菌強度低于20%。對于金黃色葡萄球菌（圖4-I-B），所有樣品均表現(xiàn)出較好抑菌活性，且呈濃度相關性；值得注意的是，在低濃度（0.025～0.1 μmol/mL）下，較WOG-BBR NF和BBR來說，BA-BBR NG表現(xiàn)出更優(yōu)越的抑菌效果。對于屎腸球菌（圖4-I-C），在濃度（0.2～1 mol/mL）時，BA-BBR NG和WOG-BBR NF的活性要明顯弱于BBR；在較低（0.025～0.15 mol/mL）濃度下，雖然WOG-BBR NF較其他樣品表現(xiàn)出增強的抑制作用，但抑菌強度低于40%?？偟膩碚f，BBR對這3種細菌的抑制沒有選擇性，BA-BBR NG對大腸桿菌和屎腸球菌的抑制作用均顯著降低，但對金黃色葡萄球菌的殺傷力增強，同時WOG-BBR NF對大腸桿菌的作用要優(yōu)于BA-BBR NG；這也說明分子結構和構象的不同，會導致最終超分子形態(tài)的不同，從而使抑菌效果呈現(xiàn)“選擇性”差異。

3.2.2 利用平板劃線法測定超分子對3種細菌生長的抑制活性 采用平板劃線法進一步驗證BA-BBR NG和WOG-BBR NF對不同細菌生長情況的影響。從圖4-II-A中，可以很清楚地看到當樣品濃度為0.100 μmol/mL時，肉眼觀察BBR和WOG-BBR NF培養(yǎng)基在相應區(qū)域內(nèi)生長出的菌落數(shù)較少，而BA-BBR NG對大腸桿菌的抑制作用較弱，能看到大量明顯的菌群。將金黃色葡萄球菌和各樣品共孵育后的菌懸液接種于平板上（圖4-II-B），樣品濃度為0.100 μmol/mL時，BA-BBR NG有少量菌生長，而BBR和WOG-BBR NF能看見大量明顯的菌落。圖4-II-C顯示BA-BBR NG和WOG-BBR NF對屎腸球菌的抑制作用均要弱于BBR，這與微量肉湯稀釋法的實驗數(shù)據(jù)相一致。進一步驗證中藥有效成分的超分子態(tài)與游離態(tài)相比，呈現(xiàn)對致病菌和條件致病菌的抑菌活性選擇性增強，而對益生菌抑制作用選擇性降低，該研究結果為中藥配伍“祛邪不傷正”的科學內(nèi)涵提供了數(shù)據(jù)支持。

3.2.3 超分子選擇性抑制致病菌金黃色葡萄球菌的機制探討 為了進一步觀察超分子的活性差異，以金黃色葡萄球菌為例進行機制上的探討，將BA-BBR NG、WOG-BBR NF分別與共培養(yǎng)，再用FESEM直接觀察。由圖-5可知，正常金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)2 h或6 h后，菌體周圍未見明顯干擾因素，表面平滑，呈現(xiàn)出規(guī)則的球體狀；有趣的是，在給藥2 h后，在低濃度下的BA-BBR NG組細菌周圍觀察到大量納米顆粒，細菌表面有輕微皺縮（圖5-A）；而在WOG-BBRNF組中，能看到細菌被嵌入到納米顆粒中（圖5-A）。此外，在給藥6 h后，觀察到細菌表面已被大量NPs覆蓋，將細菌緊緊包裹且菌體的形態(tài)變化明顯（圖5-B）；然而，與WOG-BBR NF共孵育的細菌依舊呈現(xiàn)為較圓滑的球形，形態(tài)變化不明顯，表面也沒有顯著的損傷（圖5-B），此現(xiàn)象與上述抑菌實驗所證實的活性差異一致。并能清楚地看到經(jīng)BA-BBR NG干預后的細菌，似乎被納米顆粒緊緊“黏附”，從而增加了細菌周圍局部的藥物濃度，擴大了細菌與藥物接觸的面積，也進一步阻斷了細菌氧氣和營養(yǎng)的攝入，進而影響到金黃色葡萄球菌的生命活動，最終導致其死亡；至于WOG-BBR NF，推測是其線狀形態(tài)的束縛限制了更多藥物與球形的的接觸，從而導致組裝體抑菌活性減弱（圖5-C）。根據(jù)上述實驗結果，進一步推測WOG-BBR NF對的抑制能力要好于BA-BBR NG，是由于的菌體呈桿狀，WOG-BBR NF能很好地全方位地將桿菌“嵌入”在藥物中而更好地抑制細菌的生理活動，這也與上述抑菌實驗的趨勢相同；超分子對于益生菌屎腸球菌抑制作用呈現(xiàn)降低趨勢，推測益生菌的生理結構與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌不同有關，上述研究再次表明超分子形態(tài)與其活性密切相關，但深入的生物學機制差異還有待深入研究。

A-倒置試管圖 B-FESEM圖 C-BA-BBR NG在不同濃度下的自組裝形態(tài)圖 D-BA-BBR NG在不同濃度下的自組裝機制圖

A-ROESY譜圖[16] B-BA-BBR NG和WOG-BBR NF超分子單元的空間構象和相關性 C-糖基團的構象；1)-A式 2)-N式

表1 最優(yōu)構型總能值

A-大腸桿菌 B-黃色葡萄球菌 C-屎腸球菌；與BBR組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

圖5 BA-BBR NG、WOG-BBR NF與S. aureus共培養(yǎng)2 h(A) 和6 h (B) 后(無需固定和脫水以防止自組裝破壞)相互作用的SEM圖以及抗菌機制(C)

3.2.4 超分子清除致病菌生物膜評價是臨床上常見的易在醫(yī)學植入材料上形成生物被膜的革蘭陽性菌，這也是其產(chǎn)生耐藥性的原因之一[19]，故為從多方面更好地驗證構象的不同對化合物活性的影響，利用FESEM及LSCM進一步觀察了各樣品對所形成生物膜的清除能力。首先，F(xiàn)ESEM圖像（圖6-A、B）顯示空白組的菌落分布密集，且菌體大小均勻、表面光滑，而經(jīng)過各樣品干預后的生物膜菌落密度均有所下降，其中BA-BBR NG組效果最為顯著，菌量最少，菌體破壞嚴重，形態(tài)的變化也最為明顯，且BBR和WOG- BBR NF對細菌形態(tài)的影響小于BA-BBR NG。與此同時，在LSCM的觀察下，綠色熒光代表細胞膜完整的活菌；結果表明，空白組（圖6-C）的金黃色葡萄球菌在硅片上大量附著，覆蓋整個表面，形成厚重的生物膜；對于給藥組而言，經(jīng)BA-BBR NG干預后的生物膜亮度明顯減弱，說明其密度顯著降低，活菌數(shù)量大幅下降（圖6-C）；BBR也表現(xiàn)出稍弱于BA-BBR NG的生物膜清除能力（圖6-C），相比之下，WOG-BBR NF給藥組的生物膜清除效果不明顯，活菌數(shù)量依舊較多，結果如圖6-C-4所示，這與上述FESEM的分析結果相吻合，證實不同形態(tài)超分子的活性確實存在較大的差異。

4 討論

BA和WOG分別與BBR形成的超分子無論是在物理性質(zhì)、化學性質(zhì)，還是在生物活性方面都有顯著的差異，本研究表明導致超分子形態(tài)差異的原因除了2種黃酮苷類化合物取代基上的不同，還與BA-BBR NG和WOG-BBR NF中糖基構象的差異有關，正是基于這種結構和構象的不同，BBR會在弱鍵作用下形成不同的超分子形態(tài)，進而影響生物活性。目前諸多實驗研究均發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物來源小分子間會發(fā)生相互作用，這些中藥藥效成分主要通過氫鍵、π-π堆積、靜電作用等弱鍵作用力自組裝形成如水凝膠、納米顆粒等超分子，同時具備有別于單體的分布、吸收、代謝等特性[20-24]；如李文等[25]研究發(fā)現(xiàn)甘草蛋白與小檗堿共煎能形成類球形的超分子顆粒，同時還能增強小檗堿的抗菌活性；Huang等[26]研究報道小檗堿和肉桂酸也能通過氫鍵和π-π堆積自主裝形成穩(wěn)定、有序的類球形納米顆粒，并具有良好的生物相容性和緩慢釋藥能力，納米粒會黏附在細菌表面，使局部環(huán)境中藥物濃度增大從而提高小檗堿的抗菌能力；此外，也有實驗研究表明小檗堿和馬兜鈴酸共煎煮時，通過靜電作用和π-π堆積自組裝形成疏水基團在外、親水基團在內(nèi)的線性多相超分子而阻斷馬兜鈴酸的毒性基團，從而降低馬兜鈴酸的急性腎毒性[27]；但經(jīng)文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，甚少有報道研究天然小分子構象的差異在超分子自組裝中扮演的角色，故本研究從這一角度出發(fā)，初步探索了影響中藥超分子形貌的因素之一；同時基于弱鍵化學探究了“化學結構-分子構象-超分子形態(tài)-生物活性”間的相關性，為更深層次研究傳統(tǒng)中藥配伍科學內(nèi)涵提供依據(jù)。

圖6 不同樣品生物膜的SEM圖像(A, B) 和LSCM圖(C)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Exploring scientific connotation of compatibility theory of traditional Chinese medicine based on “structure-conformation-morphology-activity” conduction relationship of berberine-flavonoid supramolecules induced by weak bonds

LIU Xiao-jing, LI Tong, YUAN Zhi-hua, PI Wen-min, GUO Wen-bo, WANG Zhi-jia, LEI Hai-min, WANG Peng-long

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China

In this paper, two different supramolecules, baicalin-berberine (BA-BBR NG) and wogonoside-berberine (WOG-BBR NF), were studied on the basis of previous studies. The scientific connotation of the compatibility of traditional Chinese medicine “expelling the pathogenic factor without harming the healthy” was discussed from the correlation of “structure- conformation-morphology-activity” by weak bond chemistry.Based on the different conformations of two supramolecular glucuronic acid groups (A form and N form), combined with 2D-NMR analysis and minimum energy conformation research, Laser scanning confocal microscope (LSCM) and Field emission scanning electron microscope (FESEM) were used to characterize the supramolecular. The effect of the difference of structure and conformation on the supramolecular morphology was discussed from the difference between macroscopic and microscopic phenomena. At the same time, the difference of supramolecular activity was evaluated by microbroth dilution method, plate marking method, bacterial morphology observation and biofilm scavenging experiment.The morphology of BA-BBR NG varies with the concentration. When the concentration was greater than the gel concentration (> 10 mmol/L), it was observed that the spherical supramolecules gradually form “pearl chain” supramolecules, while WOG-BBR NF was a non-crosslinked rigid nanofiber at all concentrations. The optimal configurations of BA and WOG were N form and A form, respectively, but when they self-assembled with BBR by weak bonding force, the optimal configurations were reversed. In addition,antibacterial studies showed that the inhibitory effects of the two supramolecules on,andwere significantly different from those of berberine, and the supramolecular antibacterial activities were "selective".Compared with monomer components, this study revealed the uniqueness of supramolecular material base of traditional Chinese medicine compatibility. The different structure and conformation of monomer components would lead to the formation of different supramolecular morphology induced by weak bonds, and then affected the biological activity.

baicalin; wogonoside; berberine; conformation; activity; supramolecules; weak bond chemistry

R284

A

0253 - 2670(2022)22 - 7001 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.003

2022-04-25

國家自然科學基金資助項目（82073974）；國家自然科學基金資助項目（82274072）；北京中醫(yī)藥大學重點攻關項目（2020-JYB-ZDGG-044）；北京市自然科學基金面上項目（7202116）；北京市科技新星計劃（Z201100006820026）；中華中醫(yī)藥學會青年人才托舉工程項目（CACM-2018-QNRC2-B08）；中央高校基金科研業(yè)務項目（2022-XJ-KYQD-008）；中央高?；鹂蒲袠I(yè)務項目（BUCM-2019-JCRC002）；國家級高層次青年人才支持計劃

劉小靖（1996—），女，碩士研究生。 Email: liuxiaojing1996@126.com

王鵬龍，男，教授，博士生導師，研究方向為基于弱鍵化學探究中藥物質(zhì)基礎與復方配伍機制。Tel: (010)53912100 E-mail: wpl581@126.com

雷海民，男，研究員，研究方向為中藥先導化合物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)。Tel: (010)53912100 E-mail: hm_lei@126.com

[責任編輯 王文倩]