表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過減弱HMGB1/TLR4/NF-κB/NLRP3 途徑改善膿毒癥后急性肝損傷

李 飛，吳傳新，何佳輝，張 杰，劉慧玲，孫 航*

1. 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院病毒性肝炎研究所，重慶 400010

2. 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶 400010

3. 成都市雙流區(qū)婦幼保健院新生兒科，成都 610200

膿毒癥是指宿主對感染產(chǎn)生失控反應并出現(xiàn)危及生命的器官功能障礙的臨床綜合征，是ICU 常見的死亡原因，每年患病人數(shù)高達1 900 萬［1］。膿毒癥可導致各種類型的器官損傷，特別是肝、腦和心臟損傷，而膿毒癥后肝功能障礙是多器官功能障礙和膿毒癥致死的獨立危險因素［2］。有證據(jù)表明，肝功能損傷作為膿毒癥的并發(fā)癥，可直接導致膿毒癥患者病情進展甚至死亡［3］。然而針對膿毒癥后肝功能損傷目前仍沒有較好的治療策略。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）在兒茶素中占比最高（50%～80%），有抗氧化、抗突變和抗感染等特性［4］。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 能有效抑制內毒素誘導的血清高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）的釋放和表達，提高敗血癥模型大鼠的存活率；還可通過抑制外源性HMGB1 在巨噬細胞表面的黏附降低HMGB1 及其標志物IL-6 的聚集，阻斷HMGB1 介導的炎癥反應［5-6］。

HMGB1 是一種高度保守且廣泛表達的非組蛋白染色質結合蛋白，可與特定染色質DNA 結合并參與DNA 重組、基因轉錄調控、細胞分裂和分化，是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的膿毒癥炎癥因子。已有研究證明多種細胞死亡方式如細胞焦亡等參與了宿主的免疫調節(jié)［7］。細胞焦亡主要由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體介導，該炎癥小體在固有免疫細胞識別抗原后被激活［8］，以炎癥小體激活和炎癥級聯(lián)為特征，被認為是減少器官和組織損傷的主要防御機制，然而細胞焦亡過度活化會導致炎癥失控、細胞死亡和多器官損傷。研究表明在膿毒癥中，細胞HMGB1 增加可促進細胞焦亡和凋亡，介導器官損傷［9］。EGCG 參與膿毒癥后急性肝損傷的細胞途徑及膿毒癥后急性肝損傷的發(fā)病機制目前尚不明了。本研究旨在探究EGCG 對膿毒癥后急性肝損傷是否具有保護作用，以及EGCG 的保護作用是否與減弱HMGB1/Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）/NF- B/NLRP3 途徑降低肝細胞焦亡有關。

1 材料和方法

1.1 動物、細胞與試劑 8～10 周齡雄性C57BL/6J小鼠88 只購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004］，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房［實驗動物使用許可證號為SYXK（渝）2018-0003］，自由飲食、飲水，實驗前先在SPF 級動物房適應性飼養(yǎng)小鼠1 周，實驗全過程遵守《實驗動物管理條例》。

人正常肝細胞系L02 細胞由重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所提供。

EGCG（純度≥98%，貨號IE0150）購自北京索萊寶科技有限公司，脂多糖（純度≤100%，貨號L4391）購自美國Sigma-Aldrich 公司，HMGB1（純度＞95%，貨號C357）購自蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，Opti-MEMTMⅠ減血清培養(yǎng)基購自美國ThermoFisher Scientific 公司，F(xiàn)BS 購自澳大利亞Life 公司，青霉素-鏈霉素復合溶液購自武漢賽維爾生物科技有限公司，DMEM 購自重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所，caspase 1 一抗購自中國臺灣Arigo 公司，NF-κB p65 一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司，消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、caspase 11、IL-18、IL-1 、HMGB1和TLR4 一抗均購自英國Abcam 公司，NLRP3、 肌動蛋白、組蛋白H3 一抗和山羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司，免疫組織化學染色酶標二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液和4%多聚甲醛溶液均購自上海碧云天生物技術有限公司，細胞核蛋白質提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，TNF- 和IL-6 ELISA 檢測試劑盒均購自北京四正柏生物科技有限公司，HMGB1 ELISA 檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 動物模型的建立與分組 小鼠隨機分為盲腸結扎穿刺術（cecal ligation and puncture，CLP）組、CLP+EGCG 低劑量（4 mg/kg）組、CLP+EGCG高劑量（8 mg/kg）組和假手術組。CLP 手術過程：小鼠禁食、不禁水12 h 后，在無菌條件下予腹腔注射異氟烷（2%～3%）麻醉。備皮、碘伏消毒，沿腹白線中段剪開一長約0.8 cm 的縱行切口，分離皮膚和肌層，探查腹腔并分離盲腸（注意盲腸主要位于小鼠左下腹，避免傷及盲腸及血管）。使用鑷子輕輕擠壓腸內容物使盲腸遠端充盈，使用3-0 手術絲線結扎盲腸遠端，然后使用21 G 針頭在結扎處遠端避開血管穿刺盲腸1 次，造成腸瘺，小心擠出約1 mm 的糞便，最后將盲腸回納，關腹。以假手術組作為對照，假手術組小鼠不予盲腸遠端結扎與穿刺，其他手術操作與CLP 相同。CLP 組與假手術組小鼠術后予37 ℃無菌生理鹽水（5 mL/100 g）皮下注射1 次，CLP+EGCG 低劑量組和CLP+EGCG 高劑量組小鼠術后分別予37 ℃含80 和160 mg/L EGCG 的生理鹽水（5 mL/100 g）皮下注射1 次，隨后使小鼠俯臥于保溫墊上復蘇。待蘇醒后放回SPF 級動物房［室溫（22±2）℃，相對濕度40%～70%，12 h 晝夜交替］繼續(xù)飼養(yǎng)，飲食、飲水同術前。觀察并記錄小鼠術后24 h 一般情況，然后經(jīng)腹腔注射異氟烷（2%～3%）麻醉后經(jīng)心臟采血并處死小鼠，收集全血、分離肝組織進行實驗。

1.3 細胞培養(yǎng)與處理 L02 細胞用含有10% FBS和1%抗生素（青霉素和鏈霉素）的DMEM，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用0.25%胰酶消化后重懸，調整細胞密度并以2.0×106個/孔接種于6 孔板，待細胞貼壁后更換培養(yǎng)基為Opti-MEMTMⅠ減血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后分為4 組：脂多糖組（用400 ng/mL 脂多糖刺激細胞24 h）、脂多糖+HMGB1 組（用400 ng/mL脂多糖刺激細胞10 h后，再加入100 ng/mL HMGB1刺 激14 h）、脂 多 糖+EGCG 組（用100 μg/mL EGCG 預處理細胞2 h，然后用400 ng/mL 脂多糖刺激24 h）、對照組（加入無菌PBS 后培養(yǎng)24 h），每組設8 個復孔。

1.4 小鼠血常規(guī)與肝功能檢測 術后24 h 使用EDTA 抗凝管收集小鼠全血，常溫下1 h 內送往重慶醫(yī)科大學寵物醫(yī)院進行血常規(guī)檢測。使用一次性凝結真空管收集小鼠血液后，先室溫靜置30 min，再 經(jīng)4 ℃ 1 000×g離 心10 min 收 集 血 清，送往重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT） 和 天 冬 氨 酸 轉 氨 酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.5 ELISA 檢測小鼠血清與L02 細胞上清液中炎癥因子HMGB1、IL-6 和TNF-α 水平 術后24 h，使用一次性凝結真空管收集小鼠全血，室溫下靜置30 min 后，4 ℃ 1 000×g離心10 min 收集血清。收集各組L02 細胞培養(yǎng)上清液。嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，檢測小鼠血清與細胞培養(yǎng)上清液中HMGB1、IL-6 和TNF- 水平。

1.6 H-E 染色觀察小鼠肝組織學變化 術后24 h，分離小鼠肝組織，使用PBS 洗去血液，用濾紙擦干多余水分，剪下一塊肝組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后經(jīng)脫水、石蠟包埋處理后制作石蠟切片。肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化處理后進行H-E 染色，于顯微鏡下觀察肝組織學變化。其余肝組織放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 蛋白質印跡法檢測小鼠肝組織與L02 細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 和焦亡相關蛋白（GSDMD、caspase 1、caspase 11、IL-1β、IL-18）的表達 每10 mg 肝組織加入約100 μL RIPA 裂解液進行勻漿，然后置于冰上充分裂解并收集總蛋白質。各組細胞棄培養(yǎng)基后用PBS 洗滌，加入RIPA裂解液收集細胞總蛋白質。根據(jù)細胞核蛋白質提取試劑盒說明書提取細胞核蛋白質，使用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。取適量蛋白質進行SDS-PAGE，電轉移至PVDF 膜，使用5%牛血清白蛋白溶液封閉；分別加入HMGB1 一抗（稀釋 比 例 為1 ∶10 000）及TLR4、NF- B p65、NLRP3、GSDMD、caspase 1、caspase 11、IL-18、IL-1 一抗（稀釋比例均為1 ∶1 000）4 ℃ 孵育過夜，用TBST 洗去膜表面未結合的抗體；加入山羊抗兔二抗（稀釋比例為1 ∶10 000）室溫孵育2 h，用TBST 洗膜；均勻滴加ECL 顯影劑，采用化學發(fā)光凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）顯影。

1.8 免疫組織化學染色檢測小鼠肝組織中HMGB1與GSDMD 表達與定位 小鼠肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，采用微波修復法進行抗原修復并冷卻至室溫后，使用PBS 洗片。擦干組織周圍多余液體，滴加適量的內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育15 min，用PBS 洗片；滴加適量山羊血清工作液室溫封閉10 min，傾去血清，勿洗；滴加適量HMGB1、GSDMD 一抗（稀釋比例均為1 ∶50）4 ℃ 孵育過夜，用PBS 洗片；滴加適量的生物素標記山羊抗兔IgG 聚合物室溫孵育15 min，用PBS洗片；滴加適量HRP 標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min 后洗片；滴加適量DAB 顯色液（現(xiàn)配）室溫顯色3 min，用自來水沖洗；最后滴加適量蘇木精染色液室溫染色約30 s。經(jīng)沖洗、返藍、脫水、透明處理后，使用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察HMGB1 與GSDMD 的表達和定位情況。

1.9 統(tǒng)計學處理 48 只小鼠（每組12 只）用于分析4 組小鼠術后生存率，然后根據(jù)各組小鼠生存情況擴充實驗小鼠數(shù)量，并為保證各項實驗樣本量充足及檢驗指標分析結果的均一性，最終確定各組統(tǒng)計樣本量n＝6，因此CLP 組小鼠40 只、CLP+EGCG 低劑量組20 只、CLP+EGCG 高劑量組16 只、假手術組12 只。應用GraphPad Prism 8.2.1 軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni 校正的t檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 各組小鼠術后一般情況 術后24 h，CLP 組小鼠死亡8 只，CLP+EGCG 低劑量組死亡5 只，CLP+EGCG 高劑量組死亡3 只，假手術組小鼠全部存活。CLP 組小鼠術后精神萎靡，喜聚集，背部毛發(fā)臟亂，眼瞼部出現(xiàn)白色膿性分泌物，大便溏??；死亡小鼠腹部膨隆，解剖后可見腹腔充滿黃色滲出液，腸道粘連，盲腸遠端呈白色壞死。CLP+EGCG 低劑量組與CLP+EGCG 高劑量組存活小鼠毛發(fā)臟亂，精神尚可，大便附著于肛周。假手術組小鼠術后蘇醒即基本恢復正常狀態(tài)。

2.2 各組小鼠術后血常規(guī)與肝功能 術后24 h 血常規(guī)和肝功能檢測結果顯示，CLP 組白細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)均低于假手術組（P均＜0.05），血清ALT、AST水平均高于假手術組（P均＜0.01），提示膿毒癥后急性肝損傷模型小鼠構建成功。CLP+EGCG 低劑量組、CLP+EGCG 高劑量組小鼠白細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)等血常規(guī)指標與CLP 組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），但血清ALT、AST 水平均低于CLP 組（P均＜0.01），且CLP+EGCG 高劑量組血清ALT、AST 水平低于CLP+EGCG 低劑量組（P均＜0.05），表明EGCG 能減輕小鼠膿毒癥后急性肝損傷。見表1。

表1 各組小鼠術后24 h 血常規(guī)與肝功能指標Tab 1 Routine blood test and liver function of mice 24 h after operation in each group n＝6, ±s

表1 各組小鼠術后24 h 血常規(guī)與肝功能指標Tab 1 Routine blood test and liver function of mice 24 h after operation in each group n＝6, ±s

The intervention concentrations of low- and high-dose EGCG were 4 and 8 mg/kg, respectively. CLP: Cecal ligation and puncture; EGCG: Epigallocatechin gallate; WBC: White blood cell; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase.*P＜0.05, **P＜0.01 vs sham group; △△P＜0.01 vs CLP group; ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01 vs CLP+EGCG low-dose group.

Group Routine blood test/(L-1, ×109) Liver function/(U·L-1)WBC Neutrophil Lymphocyte Monocyte ALT AST Sham 9.48±1.20 1.27±0.47 7.46±1.01 0.52±0.25 35.83±3.34 107.83±10.79 CLP 0.93±0.56** 0.07±0.06* 0.77±0.44** 0.08±0.08* 350.33±15.85** 474.67±32.42**CLP+EGCG low-dose 1.53±0.67** 0.41±0.48 0.99±0.32** 0.11±0.08 150.50±15.61**△△ 271.67±18.59**△△CLP+EGCG high-dose 2.97±0.57** 0.74±0.24 1.94±0.68** 0.28±0.12 94.17±15.61**△△▲ 181.50±18.22**△△▲▲F value 202.671 15.744 188.637 16.339 504.193 327.823 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各組小鼠血清炎癥因子HMGB1、TNF-α 和IL-6 表達 術后24 h ELISA 檢測結果顯示，CLP 組、CLP+EGCG 低劑量組及CLP+EGCG 高劑量組小鼠血清中HMGB1 表達量分別為（889.77±60.25）、（686.82±74.53）、（479.30±50.43）pg/mL，TNF- 表達量分別為（647.75±55.68）、（377.80±42.25）、（166.74±19.88）pg/mL，IL-6 表 達 量 分 別 為（1 706.37±95.81）、（1 175.61±116.12）、（791.55±85.01）pg/mL，均高于假手術組［HMGB1、TNF- 、IL-6 表 達 量 分 別 為（46.26±4.34）pg/mL、（45.90±0.38）pg/mL、（13.12±1.66）pg/mL］，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。CLP+EGCG低劑量組和CLP+EGCG 高劑量組血清HMGB1、TNF- 和IL-6的表達量均低于CLP組（P均＜0.05），且CLP+EGCG 高劑量組血清中HMGB1、TNF- 和IL-6 的表達量均較CLP+EGCG 低劑量組更低（P均＜0.05）。以上結果提示EGCG 對膿毒癥后急性肝損傷模型小鼠有一定的抗炎作用。

2.4 各組小鼠肝組織學變化 術后24 h肝組織H-E染色（圖1）顯示，假手術組小鼠肝細胞形態(tài)、結構正常，中央靜脈結構完整，肝小葉結構清楚，無異常表現(xiàn)；CLP 組小鼠肝組織病理切片可見肝細胞腫脹，呈現(xiàn)多發(fā)灶狀壞死，部分區(qū)域可見中央靜脈周圍多個局灶壞死融合成片，考慮膿毒癥引起的炎性壞死；CLP+EGCG 低劑量組及CLP+EGCG 高劑量組小鼠肝組織損傷較CLP 組明顯減輕。

2.5 各組小鼠術后肝組織中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關蛋白的表達情況 蛋白質印跡法檢測結果（圖2、表2）顯示，術后24 h，CLP 組、CLP+EGCG 低劑量組及CLP+EGCG 高劑量組小鼠肝組織細胞核中NF- B p65 的表達量及肝組織中HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD、caspase 1、caspase 11、IL-1 和IL-18 的表達量均高于假手術組（P均＜0.01）；CLP+EGCG 低劑量組和CLP+EGCG 高劑量組上述蛋白質的表達量均低于CLP 組（P均＜0.05），且CLP+EGCG 高劑量組中上述蛋白質的表達量均較CLP+EGCG 低劑量組更低（P均＜0.05）。以上結果提示EGCG對膿毒癥后急性肝損傷的保護作用可能與通過減弱HMGB1/TLR4/NF- B/NLRP3途徑降低肝細胞焦亡有關。

表2 各組小鼠肝組織中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關蛋白的表達情況Tab 2 Expression of HMGB1, TLR4, NF-κB p65, NLRP3 and pyroptosis-related proteins of mouse liver tissues in each group n＝6, ±s

表2 各組小鼠肝組織中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關蛋白的表達情況Tab 2 Expression of HMGB1, TLR4, NF-κB p65, NLRP3 and pyroptosis-related proteins of mouse liver tissues in each group n＝6, ±s

The intervention concentrations of low- and high-dose EGCG were 4 and 8 mg/kg, respectively. HMGB1: High mobility group protein B1; TLR4: Toll-like receptor 4; NF- B p65: Nuclear factor B p65; NLRP3: Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3; CLP: Cecal ligation and puncture; EGCG: Epigallocatechin gallate; GSDMD: Gasdermin D; caspase: Cysteine aspartic acid specific protease; IL: Interleukin. **P＜0.01 vs sham group; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs CLP group; ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01 vs CLP+EGCG low-dose group.

Group HMGB1 TLR4 NF- B p65 NLRP3 GSDMD Sham 0.036±0.006 0.023±0.006 0.024±0.005 0.099±0.014 0.128±0.006 CLP 1.406±0.090** 1.082±0.054** 0.843±0.070** 0.616±0.015** 0.474±0.022**CLP+EGCG low-dose 1.043±0.040**△△ 0.736±0.029**△△ 0.612±0.030**△ 0.463±0.030**△△ 0.302±0.035**△CLP+EGCG high-dose 0.772±0.072**△△▲0.488±0.034**△△▲▲0.394±0.021**△△▲▲0.335±0.022**△△▲▲ 0.170±0.006**△△▲▲F value 453.477 0.003 385.028 526.913 269.599 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 Group caspase 1 caspase 11 IL-1 IL-18 Sham 0.142±0.015 0.016±0.002 0.101±0.020 0.061±0.007 CLP 0.738±0.032** 0.289±0.007** 1.078±0.089** 0.247±0.016**CLP+EGCG low-dose 0.368±0.023**△△ 0.126±0.005**△△ 0.803±0.020**△△ 0.161±0.008**△△CLP+EGCG high-dose 0.308±0.015**△△▲ 0.091±0.005**△△▲▲ 0.582±0.053**△△▲ 0.104±0.006**△△▲▲F value 625.611 2 439.197 299.078 311.505 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各組小鼠肝組織中HMGB1、GSDMD 表達與定位情況 術后24 h 免疫組織化學染色檢測結果（圖3）顯示，GSDMD 主要表達于肝細胞的細胞質內，而HMGB1在細胞核和細胞質均有表達；CLP組、CLP+EGCG 低劑量組及CLP+EGCG 高劑量組小鼠肝組織中GSDMD的表達量分別為（18.21±1.71）%、（11.14±1.27）%、（6.81±1.31）%，HMGB1 的表達量分別為（25.54±1.02）%、（16.69±1.13）%、（13.62±0.76）%，均 高 于 假 手 術 組［（0.14±0.02）%、（0.16±0.07）%，P均＜0.05］，且CLP+EGCG 高劑量組肝組織中GSDMD 和HMGB1 的表達量均較CLP+EGCG 低劑量組更低（P均＜0.05）。

2.7 L02 細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子HMGB1、TNF- 、IL-6 的表達情況 ELISA 檢測結果顯示，脂多糖組、脂多糖+HMGB1 組及脂多糖+EGCG組L02 細胞培養(yǎng)上清液中HMGB1 的表達量分別為（874.44±96.84）、（1 858.15±67.94）、（540.63±121.78）pg/mL，TNF- 的表達量分別為（233.30±24.95）、（327.24±27.84）、（170.93±15.75）pg/mL，IL-6 的表達量分別為（285.76±29.97）、（413.03±21.37）、（170.68±21.87）pg/mL，均高于對照組［HMGB1、TNF- 、IL-6 表達量分別為（21.92±1.64）pg/mL、（8.96±1.41）pg/mL、（39.12±4.82）pg/mL，P均＜0.01］；脂多糖+HMGB1 組細胞培養(yǎng)上清液中上述炎癥因子的表達水平均高于脂多糖組（P均＜0.05），而脂多糖+EGCG 組細胞培養(yǎng)上清液中上述炎癥因子的表達水平較脂多糖組和脂多糖+HMGB1 組下降（P均＜0.05）。以上結果提示EGCG 有抗炎作用。

2.8 L02 細 胞 中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3及焦亡相關蛋白的表達情況 蛋白質印跡法檢測結果（圖4、表3）顯示，脂多糖組、脂多糖+HMGB1 組 及 脂 多 糖+EGCG 組L02 細 胞 核 中NF- B p65 的表達量及細胞中HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD、caspase 1、caspase 11、IL-1 、IL-18 的表達量均較對照組增加（P均＜0.05），脂多糖+HMGB1 組上述蛋白質的表達量較脂多糖組增加（P均＜0.05），而脂多糖+EGCG 組上述蛋白質的表達量較脂多糖組、脂多糖+HMGB1 組下降（P均＜0.05），提示EGCG 可能通過增強HMGB1/TLR4/NF- B/NLRP3 途徑促進肝細胞焦亡。

表3 各組L02 細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關蛋白的表達情況Tab 3 Expression of HMGB1, TLR4, NF-κB p65, NLRP3 and pyroptosis-related proteins in L02 cells of each group n＝8, ±s

表3 各組L02 細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關蛋白的表達情況Tab 3 Expression of HMGB1, TLR4, NF-κB p65, NLRP3 and pyroptosis-related proteins in L02 cells of each group n＝8, ±s

HMGB1: High mobility group protein B1; TLR4: Toll-like receptor 4; NF- B p65: Nuclear factor B p65; NLRP3:Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3; LPS: Lipopolysaccharide; EGCG: Epigallocatechin gallate;GSDMD: Gasdermin D; caspase: Cysteine aspartic acid specific protease; IL: Interleukin. *P＜0.05, **P＜0.01 vs control group;△P＜0.05, △△P＜0.01 vs LPS group; ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01 vs LPS+HMGB1 group.

Group HMGB1 TLR4 NF- B p65 NLRP3 GSDMD Control 0.052±0.002 0.020±0.001 0.020±0.001 0.016±0.001 0.249±0.026 LPS 0.176±0.007** 0.076±0.003** 0.060±0.001** 0.041±0.004** 0.779±0.022**LPS+HMGB1 0.780±0.020**△△ 0.090±0.002**△△ 0.089±0.002**△△ 0.153±0.009**△△ 1.160±0.042**△△LPS+EGCG 0.138±0.004**△▲▲ 0.044±0.003**△△▲ 0.045±0.001**△△▲▲ 0.024±0.002*△▲▲ 0.514±0.019**△△▲▲F value 3 919.634 1 249.816 2 722.691 1 052.767 1 283.410 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 Group caspase 1 caspase 11 IL-1 IL-18 Control 0.010±0.001 0.051±0.002 0.158±0.011 0.010±0.000 LPS 0.041±0.002** 0.267±0.008** 0.456±0.015** 0.041±0.002**LPS+HMGB1 0.139±0.002**△△ 0.329±0.012**△ 0.605±0.017**△△ 0.139±0.002**△△LPS+EGCG 0.012±0.001*△△▲▲ 0.171±0.007**△△▲▲ 0.334±0.018**△△▲▲ 0.013±0.000**△△▲▲F value 16 251.184 1 569.982 1 061.636 16 152.831 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討 論

膿毒癥可引起多器官功能障礙，肝臟作為一個重要的免疫器官，容易在膿毒癥中發(fā)生損傷。膿毒癥后急性肝損傷與膿毒癥患者的嚴重程度和預后密切相關［3］。CLP 模型被認為是膿毒癥研究的首選模型，其通過模擬人類闌尾穿孔使腸內容物漏入腹腔形成混合菌群感染，導致革蘭陰性菌相關的多菌性膿毒癥，該模型具有壞死組織炎癥來源明確、重復性好、與人類膿毒癥的進展過程相似等特點［9-11］。由于缺乏通用于人類患者的生理監(jiān)測機制，膿毒癥暫無評定標準，常通過實驗組的死亡率來評估膿毒癥的嚴重程度并調整需要的動物數(shù)量。有證據(jù)表明血清IL-6 可能是C57/BL6 及BALB/c 小鼠膿毒癥嚴重程度和死亡的預測指標［10］。本研究術后24 h CLP 組小鼠的死亡率及血常規(guī)、AST、ALT、IL-6水平的檢測結果證實膿毒癥后急性肝損傷模型構建成功。

EGCG 具有強大的生物活性及抗氧化和抗炎效果，可顯著抑制促炎因子TNF- 、IL-1 、IL-6 的表達，本實驗對細胞培養(yǎng)上清液中HMGB1、TNF- 及IL-6的檢測結果也證實EGCG 的抗炎作用顯著。研究表明EGCG 對藥物性肝損傷和脂多糖誘導的急性肝損傷均有較好的保護作用［12-13］，然而有關EGCG 對膿毒癥后急性肝損傷是否有保護作用及可能機制的研究較少。本研究中組織病理學及血清HMGB1、TNF- 、IL-6、ALT、AST 檢測結果表明，EGCG 可減輕膿毒癥所致的急性肝損傷，對膿毒癥后急性肝損傷有保護作用。

研究證實細胞焦亡與膿毒癥后急性肝損傷密切相關，抑制肝細胞焦亡可影響CLP 誘導的膿毒癥后急性肝損傷的嚴重程度［14］。細胞焦亡是由多種病理因素觸發(fā)并由caspase 家族蛋白介導的炎癥性細胞死亡，其特點是細胞膜快速破裂及細胞內促炎物質釋放［15-16］。GSDMD 是細胞焦亡過程中的主要執(zhí)行蛋白，主要表達于細胞質，是caspase 1/4/5/11的底物［17-18］。病原體入侵宿主時，NLRP3 炎癥小體可直接募集caspase 1 前體，激活的caspase 1 特異性裂解GSDMD，而活化的GSDMD 可與細胞膜特異性結合發(fā)揮“打孔”作用，導致IL-1 、IL-18等炎癥因子釋放。caspase 11 可直接識別細菌脂多糖并與之結合，而結合了脂多糖的caspase 11 可發(fā)生水解并直接裂解GSDMD，引發(fā)細胞焦亡［7,19］。本實驗結果顯示，CLP 組小鼠肝組織中焦亡相關蛋白的表達量升高，而在EGCG 干預后焦亡相關蛋白的表達量降低，提示細胞焦亡與膿毒癥后急性肝損傷的發(fā)生密切相關。

HMGB1 在細胞核中參與核轉錄、重組、DNA復制和修復，而在細胞質或細胞外可導致廣泛的炎癥反應和多器官功能障礙；HMGB1 還可與TLR4結合，激活核轉錄因子NF- B，進一步增強炎癥反應［20］。NF- B 是免疫反應和細胞增殖轉化的重要調控轉錄因子，它控制著細胞因子的產(chǎn)生和細胞的存活，還在固有免疫反應的啟動和隨后促炎介質的產(chǎn)生中發(fā)揮著核心作用，而促炎介質的產(chǎn)生與釋放會加重器官損傷［8］。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥常伴有NF- B的激活上調，抑制NF- B激活可減輕膿毒癥實驗動物的炎癥反應，提高其存活率［21］。NF- B 是激活NLRP3 炎癥小體和焦亡的關鍵因子，調節(jié)NLRP3炎癥小體的激活可影響小鼠的細胞焦亡水平，例如在非小細胞肺癌中，重樓皂苷Ⅵ（polyphyllin Ⅵ）通過活性氧/NF- B/NLRP3/GSDMD信號通路誘導caspase 1 介導的細胞焦亡［22］。輔酶Q10 聯(lián)合七葉皂苷可通過HMGB1/TLR4/NF- B p65/NLRP3信號通路抑制NLRP3 炎癥小體的激活和細胞焦亡，預防膿毒癥誘導的急性肺損傷［23］。本實驗結果顯示，使用不同質量濃度的EGCG 調低HMGB1 水平后，小鼠肝組織中TLR4、NF- B p65、NLRP3 及焦亡相關蛋白的表達水平均較CLP 組降低，表明EGCG對膿毒癥后急性肝損傷的保護作用可能與通過減弱HMGB1/TLR4/NF- B/NLRP3途徑降低肝細胞焦亡有關。為了進一步證明這一結論，本實驗進行了體外實驗，利用脂多糖誘導L02 細胞建立膿毒癥后急性肝損傷細胞模型，實驗結果顯示增加HMGB1 水平后細胞中TLR4、NF- B p65、NLRP3 及焦亡相關蛋白的表達量均增加。

綜上所述，EGCG 對膿毒癥后急性肝損傷有保護作用，其作用機制可能與通過減弱HMGB1/TLR4/NF- B/NLRP3途徑減輕肝細胞焦亡有關。這一結論或許可為將來探索膿毒癥后急性肝損傷的治療方法提供新的方向。