雷西莫特對特應性皮炎模型小鼠的影響

孫 剛，朱曉辰，賀 旭，畢新嶺

海軍軍醫(yī)大學（第二軍醫(yī)大學）第一附屬醫(yī)院皮膚科，上海 200433

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見的炎癥性皮膚病，其特征是反復出現(xiàn)濕疹樣病變和劇烈瘙癢，該病可發(fā)生在所有年齡和種族的人群，對患者及其家庭造成了巨大的心理及經濟負擔［1］。WHO 數(shù)據(jù)顯示，全世界有至少2.3 億人患有AD，兒童AD 患病率為15%～25%［2］。雷西莫特是咪唑喹啉類免疫應答調節(jié)劑，可促進 干擾素和IL-12 的產生、減少IL-4 和IL-5 的生成，從而促進輔助性T 細胞（helper T cell，Th）1 反應和抑制Th2 反應，同時降低健康人、變應性鼻炎及AD 人群的IgE 水平［3］。因此，科研人員嘗試將雷西莫特應用于變應性疾病，目前已有相關動物實驗開展［4］。本研究通過對AD 模型小鼠腹腔注射雷西莫特，觀察其對AD 的治療效果，并探討可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與設備 卡泊三醇搽劑（丹麥利奧制藥有限公司，批號H20150664）。小鼠IgE、IL-4、IL-13 ELISA 檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）。酶標檢測儀（美國Bio-Tek 公司），熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 實驗動物 6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠（SPF級）30 只，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司［實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2018-0013］，飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學（第二軍醫(yī)大學）第一附屬醫(yī)院動物實驗中心［實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2020-0033］。

1.3 動物分組及處理 將30 只小鼠隨機分為空白組、模型組、治療組，每組10 只。模型組及治療組小鼠耳部連續(xù)14 d 涂抹卡泊三醇搽劑（每天2 nmol 卡泊三醇）誘導AD 模型，模型組同時予200 μL PBS 每天腹腔注射、治療組予50 nmol 雷西莫特（溶于200 μL PBS）每天腹腔注射［4］；空白組小鼠不給予任何處理。

1.4 觀察指標

1.4.1 耳部皮損情況 實驗第15 天觀察各組小鼠的耳部皮損紅斑、腫脹及鱗屑情況，同時用游標卡尺測量小鼠耳厚度。

1.4.2 耳部組織病理學檢查 實驗第15 天，經眼眶取血后以頸椎脫臼法處死小鼠，沿耳根部剪下鼠耳。將取下的鼠耳縱向一分為二，一半放入組織固定液中固定并經石蠟包埋后切片，通過H-E 染色觀察真皮炎癥細胞浸潤情況，通過甲苯胺藍染色觀察肥大細胞分布情況；另一半放入-80 ℃冰箱備用。

1.4.3 ELISA 檢測血清IgE、IL-4、IL-13 水平 實驗第15 天，將采集的血液于室溫靜置2 h，4 ℃3 996×g離心15 min，取血清分管凍存于-80 ℃冰箱中備用。按照相關試劑盒說明書進行血清IgE、IL-4、IL-13 檢測。

1.4.4 qPCR 檢測耳部皮損組織中胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、γ 干擾素mRNA 表達 取-80 ℃凍存的小鼠耳部皮損組織，在液氮中剪切及研磨，采用TRIzol 法提取總RNA，使用Nanodrop 2000 超微量分光光度計（美國ThermoFisher Scientific 公司）檢測RNA 濃度及純度。通過反轉錄合成cDNA 第一鏈，以該鏈為模板、GAPDH為內參照進行PCR 擴增。PCR 反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。采用2-Ct 法計算目的基因相對表達量。GAPDH上游引物序列為5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'，下游引物序列為5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3'；TSLP上游引物序列為5'-AGAGAAGCCCTCAATGACCAC-3'，下游引物序列為5'-TGAGGTTTGATTCAGGCAGATGT-3'； 干擾素上游引物序列為5'-CTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG-3'，下游引物序列為5'-TGACCTCAAACTTGGCAATACTC-3'。所有引物均由上海擎熙生物科技有限公司合成。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism 8 軟件進行數(shù)據(jù)分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，任意兩組間資料的比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 各組小鼠耳部皮損大體情況 空白組小鼠耳部皮膚未見異常（圖1A）；模型組小鼠耳部皮膚明顯腫脹發(fā)紅、毛細血管擴張，其上附有細小的鱗屑（圖1B）；與模型組相比，治療組小鼠耳部皮膚紅腫、鱗屑明顯緩解，有輕度毛細血管擴張（圖1C）。模型組小鼠耳厚度為（0.48±0.02）mm，與空白組［（0.19±0.01）mm］相比增厚（P＜0.01）；治療組小鼠耳厚度［（0.35±0.02）mm］較模型組變?。≒＜0.01)。

2.2 各組小鼠耳部組織病理學變化 H-E 染色可見空白組小鼠耳部組織表皮、真皮結構正常，真皮內散在少量組織細胞，未見明顯炎癥細胞浸潤（圖2A）；模型組小鼠表皮角化過度、角化不全，棘層明顯增厚，皮突延長，棘細胞間水腫，真皮全層見大量炎癥細胞浸潤，并可見毛細血管擴張充血（圖2B）；治療組小鼠表皮角化、棘層增厚較模型組明顯緩解，未見棘細胞間水腫，真皮內可見淋巴細胞及組織細胞，淋巴細胞分布數(shù)量減少（圖2C）。甲苯胺藍染色可見空白組小鼠真皮內散在少量肥大細胞（圖3A），模型組真皮內肥大細胞明顯增多（圖3B），治療組小鼠真皮內肥大細胞較模型組明顯減少（圖3C）。

2.3 各組小鼠血清IgE、IL-4、IL-13 水平 ELISA檢測結果（圖4）顯示，與空白組相比，模型組小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13水平均升高（P均＜0.01），說明小鼠AD 模型構建成功。與模型組相比，治療組小鼠血清IgE、IL-4、IL-13 水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

2.4 各組小鼠耳部組織中TSLP、γ 干擾素mRNA表達 qPCR 檢測結果顯示，模型組小鼠耳部組織 中TSLPmRNA 表 達 量（0.97±0.24）較 空 白組（0.34±0.09）升高（P＜0.01），治療組TSLPmRNA 表達量（0.80±0.17）與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組小鼠耳部組織中 干擾素mRNA 表達量（0.81±0.48）與空白組（1.05±0.08）相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但治療組γ 干擾素mRNA 表達量（1.20±0.14）較模型組升高（P＜0.05）。

3 討 論

AD 的病因復雜，包括遺傳、免疫和環(huán)境等因素，其中皮膚屏障功能異常和免疫功能障礙被認為是AD 發(fā)病機制的關鍵。免疫功能障礙相關的發(fā)病機制包括血清IgE 水平升高、Th1/Th2 免疫反應失衡、Th2 細胞因子過表達、表達皮膚淋巴細胞相關抗原的T 細胞增加、表皮炎癥性樹突狀細胞（包括朗格漢斯細胞）中Fc 受體Ⅰ及TSLP 表達增加等［5］?？ú慈寄軌蛘T導小鼠角質形成細胞過表達TSLP，導致AD 樣皮損；在卡泊三醇誘導的AD小鼠模型中可見表皮增生，真皮內嗜酸性粒細胞和肥大細胞等炎癥細胞浸潤，皮損處TSLP、IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-10、IL-8 等Th2 細胞因子表達增加，同時小鼠血清中IgE 水平升高［6］。因此，卡泊三醇誘導的動物模型很好地再現(xiàn)了AD 免疫功能障礙的特征。本實驗即采用卡泊三醇搽劑誘導AD 模型，觀察雷西莫特對AD 小鼠的治療效果及可能的作用機制。

Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）是一種模式識別受體，是固有免疫的重要組成部分，可對入侵的病原體產生防御性炎癥反應［7］。研究表明，雷西莫特作為TLR7/8 激動劑可誘導細胞因子如 干擾素、 干擾素和IL-12表達，從而增加Th1免疫應答，同時抑制Th2 細胞產生IL-4 和IL-5［8］。本研究中，治療組小鼠耳部皮損腫脹、紅斑、鱗屑情況較模型組改善，耳部皮損組織中炎癥細胞浸潤程度減輕，肥大細胞數(shù)量減少，血清IL-4、IL-13水平下降，耳部皮損組織中 干擾素表達增加。結果表明腹腔注射雷西莫特可以通過調節(jié)Th1/Th2 免疫應答反應改善小鼠AD 癥狀。

IgE 在哮喘、變應性鼻炎、AD 等變應性疾病的發(fā)病中起著至關重要的作用，Th2 細胞因子有助于激活B 淋巴細胞促進IgE 產生，而IgE 可促進肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒進而導致過敏反應，兩者可協(xié)同放大皮膚炎癥反應［9］。雷西莫特可直接作用于B 淋巴細胞而抑制IgE 的合成，也可通過促進 干擾素和IL-12 的分泌抑制IgE 的產生［10］。本實驗中，治療組小鼠血清IgE 水平低于模型組，提示腹腔注射雷西莫特可能通過抑制IgE 分泌改善AD 皮損情況。

TSLP 作為一種細胞因子，能夠促進B 淋巴細胞和髓系樹突狀細胞的活化，參與人和小鼠AD 及相關疾病的發(fā)生、發(fā)展。TSLP 通過TNF 受體超家族成員4 配體促使樹突狀細胞產生CC 趨化因子配體17 及22，招募CD4+Th2，還可以刺激肥大細胞和自然殺傷T 細胞活化，從而增加Th2 細胞因子的產生［11］。雷西莫特可下調TNF 受體超家族成員4 配體的表達并促進IL-10、IL-12 的產生，消除TSLP 相關樹突狀細胞參與的Th2 免疫應答，有助于緩解或預防變應性炎癥［12］。本實驗中，治療組小鼠皮損組織中TSLPmRNA 表達量與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示腹腔注射雷西莫特可能不會直接影響TSLP 表達，其機制可能與下調TNF 受體超家族成員4 配體表達有關。

綜上所述，本實驗結果顯示腹腔注射雷西莫特可以改善AD 小鼠的皮炎狀況，作用機制可能與雷西莫特抑制Th2 反應、減少IL-4 和IL-13 分泌，增強Th1反應、增加 干擾素mRNA 表達，同時抑制IgE 的合成有關，但其發(fā)揮作用的具體通路及不良反應有待進一步研究。