海參多糖提取分離及純化的研究概述

于 雙，李雙雙，2，宋志遠，3，4，桑 雪，3，5，李 瑩，3，4，范馨茹，3，5，趙前程，3，4，5

（1. 大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連116023；2. 大連鑫玉龍海洋生物種業(yè)科技股份有限公司，遼寧大連116222；3. 大連市特色海洋功效成分開發(fā)與高值化利用重點實驗室，遼寧大連 116023；4. 遼寧省水產(chǎn)品分析檢驗及加工技術科技服務中心，遼寧 大連 116023；5. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034）

海參不僅是傳統(tǒng)的海洋食品，也是寶貴的藥用資源，全球已知的海參品種達1 000 余種，其中，可食用海參有40 多種[1]。海參不僅蛋白質(zhì)含量豐富，而且富含多糖成分，占海參體壁干質(zhì)量的6%以上[2]。海參多糖有抗凝血、抗腫瘤、增強免疫力、降血脂、抗病毒等生物學活性，具有很高的藥用價值[3]。目前，各種各樣的海參多糖被提取、分離和純化出來，而提取、分離和純化方法對海參多糖的提取率、組成結構及生物學活性具有一定影響?？偨Y對比了現(xiàn)有海參多糖提取、分離和純化方法，旨在為海參多糖的開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應用提供理論支持。

1 海參多糖的提取方法

1.1 酶解法

酶解法是海參多糖提取最常用的方法，蛋白酶能水解肽鍵，使多糖與蛋白質(zhì)有效分離，且不破壞多糖的結構[4]。海參多糖的酶解主要采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等，尤以木瓜蛋白酶應用較為廣泛。酶解法可以采用單一酶進行酶解，也可以采用多種酶聯(lián)合進行酶解。

單一酶法主要采用木瓜蛋白酶，從海地瓜（Acaudina molpadioides）、白乳參（Holothuria fuscogilva）、黑海參（Holothuri atra）[5]、海瓜參（Cucumaria syracusana）[6]、刺參（Stichopus japonicas）[7]、北大西洋瓜參（Cucumaria frondosa）[8]、黃參（Stichopus naso）、沙參（Holothuria floridana）、大烏爪參（Holothuria tubulosa）[9]、菲律賓刺參（Hearsonothuria graeffei）[10]、糙刺參（Stichopus horrens）、綠刺參（Stichopus chloronotus）[11]、白底輻肛參（Actinopyga mauritiana） 和仿刺參（Apostichopus japonicus）[12]等海參中提取了多糖，多糖提取率介于3.19%～11.40%。

采用中性蛋白酶提取了海地瓜[13]和刺參[14]的多糖，多糖提取率為3.24%～13.80%，與木瓜蛋白酶酶解提取結果相近；為了提高多糖提取率，酶法也可以與超聲輔助法結合使用，先采用超聲波處理后再采用中性蛋白酶法處理，提取了刺參性腺多糖，提取率為6.09%，明顯高于酶法（4.35%） 和超聲法（5.47%）[15]，而且減少了酶的用量。采用胃蛋白酶提取了海地瓜[16]多糖，提取率僅為1.65%，明顯低于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。

雙酶法主要采用胃蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合酶解，提取了刺參[17]多糖，提取率為1.46%；采用木瓜蛋白酶和復合蛋白酶，提取了仿刺參卵粗多糖，提取率為8.76%[18]。

1.2 堿法與酶解法聯(lián)合使用

堿可以有效水解蛋白質(zhì)中的肽鍵，使多糖與蛋白質(zhì)有效分離，如采用氫氧化鉀提取刺參多糖，提取率為7.96%[19]，也提取了玉足海參（Holothuria lcucospilota） 多糖[20]。但堿溶液容易破壞多糖結構，為避免多糖降解[21]，堿法常和酶法結合使用，一般不單獨使用。從刺參[22]、東海烏參（Acaudina leucoprocta）[23]、黑乳參（Holothuria nobilis）[24]、東海烏參[25]、刺參、綠刺參和海地瓜[26]中提取多糖，多糖提取率為2.51%～8.29%。

1.3 熱水浸提法

熱水浸提法是動植物多糖提取的常用方法，采用80 ℃熱水浸提海地瓜2 h，多糖提取率僅為0.628%[27]；為了提高多糖提取率，將熱水浸提法與超聲-微波法聯(lián)合使用，刺參多糖提取率達12.39%[28]。

2 海參多糖的分離方法

2.1 乙醇沉淀法

海參多糖的分離常采用乙醇沉淀法，用2 倍或3倍體積的乙醇，可將仿刺參[29]、刺參[19]、海地瓜、黑乳參[30]、北極參[31]、花刺參[32]和沙參[33]等多糖分離出來；或采用最終體積分數(shù)為60%以上的乙醇溶液，分離得到白腹海參（Holothuria albiventer） 多糖[34]、梅花參（Thelenota ananas）、花刺參、綠刺參、黑乳參、白腹海參、糙海參（Holothuria scabra）、大烏爪參、球參、北極參（Holothuria impatien） 和葉瓜參多糖[35]；此外，通過分級醇沉可以將硫酸軟骨素、巖藻聚糖硫酸酯和中性多糖有效分離，如采用40%乙醇可以將花刺參（Stichopus herrmanni）[36]、大西洋海參（Holothuria coluber）[37]和白腹海參[38]中的硫酸軟骨素分離出來，50%乙醇溶液可使象牙參、梅花參和糙刺參的中性多糖得到分離[39]。

2.2 季銨鹽沉淀法

季銨鹽是一種乳化劑，能夠與酸性多糖結合形成沉淀，常用于海參酸性多糖的分離，常用的季銨鹽包括氯化十六烷基吡啶（CPC） 和十六烷基三甲基溴化銨（CATB）。采用CPC 分離多糖時，通常CPC溶液最終質(zhì)量分數(shù)為0.5%，沉淀物加入氯化鈉乙醇溶液溶解，再加入乙醇沉淀，使酸性多糖得到分離[40]。綠刺參[38]、地中海瓜參[6]、大烏爪參、沙海參（Holo-thuria arenicola）[41]、白斑海參（Holothuria polii）[42]、仿刺參[40]、北大西洋瓜參[8]、黃參、沙參、大烏爪參[9]和菲律賓刺參[10]，采用CPC 分離海參多糖，提取率為3.00%～8.06%。

采用CATB 分離多糖時，通常采用CTAB 溶液最終濃度為1.0%～1.3%[43]，將沉淀物采用乙醇碘化鈉溶液處理，再經(jīng)乙醇沉淀，將得到了巴塔哥尼亞海參（Hemioedema spectabilis）[43]、葉瓜參[44]、綠刺參和糙刺參[11]酸性多糖，提取率為3.60%～11.92%。

2.3 鹽析法

鹽析也常用于海參多糖的分離，通常采用乙醇與醋酸鉀結合使用，分離了仿刺參、綠刺參、海地瓜[45]和花刺參[36]多糖，提取率為6.4%～8.1%。

3 海參多糖的純化方法

3.1 離子色譜法

海參多糖通常采用陰離子色譜法純化，將多糖按相同離子強度進行初步分離，常用的色譜介質(zhì)包括DEAE- 纖維素（DEAE-Cellulose）[6，30，40]、快流速DEAE-瓊脂糖凝膠（DEAE-Sepharose Fast Flow）[33]、強離子FPA98 樹脂（Strong ion of FPA98 resin）[34，39]和DEAE- 葡聚糖（DEAE-Sephacel）[43]；此外，DEAE 葡聚糖凝膠（DEAE-Sephadex） 和快流速Q(mào) 瓊脂糖凝膠（Q Sepharose Fast Flow）[25，38]也可用于海參多糖的純化。

3.1.1 DEAE-纖維素

DEAE-纖維素廣泛應用于多糖純化，采用此方法，可從地中海瓜參[6]、黃參、沙參及大烏爪參[9]粗多糖中純化得到硫酸軟骨素組分；從黃玉參[30]、黃參、沙參及大烏爪參[9]粗多糖中純化得到巖藻聚糖硫酸酯組分。

3.1.2 DEAE-瓊脂糖凝膠

DEAE-瓊脂糖凝膠也常用于多糖純化，可直接純化得到東海烏參硫酸多糖[46]，從沙參、菲律賓刺參和美國肉參[47]粗多糖中純化得到硫酸軟骨素組分；從綠刺參[38]、沙參、白斑海參[48]的粗多糖中純化得到巖藻聚糖硫酸酯組分。

3.1.3 強離子FPA98 樹脂

近些年，強離子FPA98 型樹脂也常用于多糖的純化，可以直接從大西洋海參、象牙參、梅花參[49]粗多糖中純化得到巖藻聚糖硫酸酯組分；從大西洋海參[37]和象牙參[45]粗多糖中純化得到硫酸軟骨素組分；從秘魯烏參（Pattalus mollis）[50]和糙刺參[51]粗多糖中得到了巖藻糖基化糖胺聚糖，從東海烏參粗多糖中得到了海參多糖[52]。

3.1.4 葡聚糖纖維素

近些年，葡聚糖纖維素也常用于純化多糖，但需采用DEAE 葡聚糖凝膠進一步純化。采用此方法，可以用于純化大烏爪參、小烏爪參[43]、糙刺參[53]、綠刺參[11]、葉瓜參[44]和糙刺參多糖[53]。

3.2 凝膠色譜法

3.2.1 葡聚糖凝膠

經(jīng)過離子色譜分離純化后，通常需要采用凝膠色譜進一步純化。一般采用葡聚糖凝膠（Sephadex）G-200[40]、G-150 或G-100[30]。例如，經(jīng)DEAE-纖維素純化后，進一步采用葡聚糖凝膠G-200 使刺參多糖得到純化[40]，獲得刺參巖藻聚糖硫酸酯組分和硫酸軟骨素組分[54]。將海地瓜粗多糖采用快流速Q(mào) 瓊脂糖凝膠純化后，采用葡聚糖凝膠G-150 進一步純化，得到巖藻聚糖硫酸酯組分和硫酸軟骨素組分[27]。

經(jīng)DEAE-葡聚糖初步純化多糖后，進一步采用葡聚糖凝膠G-100 可以純化得到巴塔哥尼亞海參[43]、大烏爪參、小烏爪參（Holothuria stellati）[53]、葉瓜參[44]硫酸軟骨素組分和糙刺參[53]巖藻聚糖硫酸酯組分。

3.2.2 聚丙烯酰胺葡聚糖

經(jīng)過陰離子色譜分離純化后，采用聚丙烯酰胺葡聚糖（Sephacryl） S-500、S-400 和S-200[25]可以使多糖得到純化。例如，粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素純化后，進一步采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-500 HR[55]，得到純化的刺參多糖；經(jīng)快流速Q(mào) 瓊脂糖凝膠分離純化后，進一步采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-200，可純化得到東海烏參[13]和刺參巖藻聚糖硫酸酯組分和硫酸軟骨素組分，采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-500 純化得到北大西洋瓜參巖藻聚糖硫酸酯組分[8]。

4 結語

近年來受疫情影響，海參多糖的保健功能已成為全球研究熱點，各種海參多糖相繼被提取出來，對其活性和結構的研究也不斷深入，為海參多糖開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應用奠定了理論基礎。然而，目前海參多糖的提取分離和純化方法還未用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，提取和純化方法有待進一步完善，可以通過開發(fā)適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的海參多糖分離設備，充分結合傳統(tǒng)海參加工工藝，使海參多糖能夠從實驗室科研水平進入產(chǎn)業(yè)規(guī)?；纳a(chǎn)。此外，充分利用海參加工副產(chǎn)物，開發(fā)和利用海參多糖，能夠帶來巨大的收益，實現(xiàn)海參資源的高效利用，提升海參加工附加值和綜合經(jīng)濟效益，促進海參產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。