冷藏保存時(shí)間對人少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的影響

汪兆艷，王 倩，楊印祥，屈素清，楊 輝，葉 豆，門倩倩，劉 暢，欒 佐

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligo‐dendrocyte precursor cells,OPC）分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes,OL），用于修復(fù)受損的髓鞘。目前OPC主要應(yīng)用于腦白質(zhì)損傷[1]、脊髓損傷[2]、神經(jīng)退行性病變[3]、缺血性腦卒中[4]、腦出血[5]、多發(fā)性硬化[6]等疾病，臨床應(yīng)用前景值得期待[7]。OPC雖然已經(jīng)應(yīng)用于臨床前研究與疾病治療，但治療效果卻存在差異[8]，主要因?yàn)镺PC制備過程存在一些影響細(xì)胞生物學(xué)特性的因素，進(jìn)而影響臨床治療效果。有研究表明，細(xì)胞來源[9-11]、不同的處理方式[11]、移植細(xì)胞數(shù)量[12-13]、移植時(shí)間窗[14]、移植路徑[15]及受試者個(gè)體差異[16]都會(huì)對治療效果產(chǎn)生影響。在以上因素中，移植前細(xì)胞質(zhì)量對臨床治療效果影響最為直接，而細(xì)胞保存介質(zhì)、保存時(shí)間、保存溫度等因素直接影響移植前細(xì)胞質(zhì)量。然而，關(guān)于OPC在冷藏保存介質(zhì)中保存不同時(shí)間是否會(huì)影響細(xì)胞生物學(xué)特性及冷藏保存后的OPC移植到體內(nèi)是否會(huì)分化為產(chǎn)髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein,MBP）的OL卻鮮有報(bào)道。本研究以人神經(jīng)干細(xì)胞來源的OPC為研究對象，評價(jià)不同冷藏保存時(shí)間對OPC生物學(xué)特性的影響，為OPC的進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化提供可能的參數(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；生物安全柜購自新加坡ESCO公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；低溫低速離心機(jī)購自美國貝克曼庫爾特公司；冷藏運(yùn)輸箱購自上海元廷生物公司；人血白蛋白購自安徽大安生物公司；PDGFR-α-BV421及同型對照IgG均購自美國BD公司；A2B5-PE及同型對照IgM流式抗體均購自德國Miltenyi Biotec公司；Olig2、Galc免疫熒光染色抗體購自德國Miltenyi Biotec公司；山羊抗兔熒光二抗購自美國Jackson Immunoresearch公司；遷移小室Transwell購自美國康寧公司；CCK8（Cell Counting Kit-8）檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司；OPC完全培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室自配。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OPC培養(yǎng)與傳代NSC-9神經(jīng)干細(xì)胞系從12周人胎腦皮質(zhì)分離獲得，在含有表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）的DMEM/F12培養(yǎng)基中擴(kuò)增為神經(jīng)球，每10天用Accutase消化傳代一次。取P10代神經(jīng)球消化成單細(xì)胞并重懸于OPC完全培養(yǎng)基，按照2×104/cm2的密度接種于5 μg/mL層粘連蛋白（laminin，LN）處理的六孔板中，間隔3～4 d半量換液，每5天Accutase消化傳代一次，第三代細(xì)胞用于冷藏實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 OPC冷藏保存第三代OPC，Accutase消化，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)后重懸于含有10 g/L HSA的50 g/L葡萄糖保存介質(zhì)中，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至0.5 mL eppendorf管，細(xì)胞終濃度為4×106/100 mL。根據(jù)冷藏保存時(shí)間的不同，實(shí)驗(yàn)分為4組，每組三支細(xì)胞懸液。1組：冷藏保存0 h；2組：冷藏保存24 h；3組：冷藏保存48 h；4組：冷藏保存72 h。將準(zhǔn)備好的細(xì)胞置于2～8℃冷藏運(yùn)輸箱內(nèi)保存。為了確保冷藏運(yùn)輸箱內(nèi)溫度穩(wěn)定，在細(xì)胞冷藏保存前對冷藏箱內(nèi)溫度進(jìn)行校驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞活率檢測冷藏保存不同時(shí)間的OPC，重懸于適量體積冷藏保存介質(zhì)中，充分混勻后吸取細(xì)胞懸液10 mL與臺(tái)盼蘭10 mL混合，取10 mL細(xì)胞懸液充入計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)，每組細(xì)胞取樣3次計(jì)數(shù)并取平均值?；罴?xì)胞不著色并保持正常形態(tài)，死亡細(xì)胞藍(lán)染，細(xì)胞活率計(jì)算公式為：細(xì)胞活率（%）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.4 細(xì)胞表型檢測冷藏保存不同時(shí)間的OPC，計(jì)數(shù)后均分至流式管中，每管5×105個(gè)細(xì)胞。流式標(biāo)記方法為：PBS洗滌細(xì)胞，400×g離心5 min，棄上清并混勻細(xì)胞，每管加Fc阻斷劑5 mL，室溫放置10 min，根據(jù)說明書每管分別加熒光標(biāo)記的鼠抗人PDGFR-α、A2B5抗體及對應(yīng)的及同型抗體，4℃孵育30min，PBS洗滌后重懸細(xì)胞；Olig2為兔抗人抗體，一抗室溫孵育2 h，二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌并重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測冷藏保存不同時(shí)間的OPC，重懸于OPC完全培養(yǎng)基中，按照每孔6.0×103密度接種于LN包被的96孔板中，每組5孔。根據(jù)CCK-8試劑使用說明書，每天同一時(shí)間每孔加10 mL CCK8溶液于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度（optical density,OD）。連續(xù)檢測7 d，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.6 細(xì)胞遷移能力檢測冷藏保存不同時(shí)間的OPC，通過Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力，具體操作方法為：8 mm孔徑的Transwell小室，小室上室和下室分別加0.1 mL和0.5 mL包被液置于培養(yǎng)箱中孵育45 min。吸棄包被液，下室內(nèi)加入OPC完全培養(yǎng)基0.5 mL，上室內(nèi)接種重懸于OPC完全培養(yǎng)基的細(xì)胞2×104個(gè)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，取出小室，徹底吸棄上室內(nèi)的液體，用潤濕的無菌棉簽輕柔擦拭上室底面，擦去未遷移的細(xì)胞，將小室浸入4%多聚甲醛，室溫固定10 min，PBS洗3次，DAPI復(fù)染5 min。熒光顯微鏡拍照整個(gè)視野，用Image J軟件計(jì)算DAPI陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 細(xì)胞體外分化能力檢測冷藏保存不同時(shí)間的OPC，重懸于自配OPC分化培養(yǎng)基中，按照1×104/cm2密度接種于多聚L-鳥氨酸氫溴酸鹽（poly-l-orni‐thine hydrobromide,PLO）和LN包被的24孔板，每隔3天半量換液，分化3周，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫固定10 min，PBS清洗細(xì)胞，0.3%Triton X-100室溫破膜10 min，PBS清洗細(xì)胞，3%BSA室溫封閉1 h，吸棄封閉液加Galc抗體（1：100）4℃冰箱過夜，徹底吸棄一抗，PBS清洗細(xì)胞后加熒光標(biāo)記的驢抗兔IgG（1：250），室溫孵育2 h，PBS清洗細(xì)胞，DAPI復(fù)染5 min，熒光顯微鏡下拍照，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。

1.2.8 細(xì)胞體內(nèi)成髓鞘檢測清潔級Sprague-Dawley(SD)孕鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理號(hào)為：SCXK-2012-0001。出生后第3天的SD大鼠，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，6%氧氣缺氧90 min，建立早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷（white matter injury,WMI）模型。造模后第7天，每只鼠通過立體定位儀經(jīng)側(cè)腦室移植冷藏24 h的OPCs 3×105個(gè)（n=10），移植后12周通過MBP和Stem121免疫熒光雙染色法觀察移植細(xì)胞體內(nèi)成髓鞘能力。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，多組之間進(jìn)行比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活率比較冷藏保存不同時(shí)間OPC，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與冷藏保存0 h比較，冷藏保存24 h、48 h細(xì)胞活率沒有顯著性差異，冷藏保存72 h的OPC雖然細(xì)胞活率超過85%，但與冷藏保存0h組比較，細(xì)胞活率顯著下降（圖1，P<0.01）。

圖1 冷藏保存不同時(shí)間OPC活率比較**P<0.01.

2.2 冷藏保存不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較CCK8法檢測各組細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，與冷藏保存0h比較，冷藏保存24h、48h，細(xì)胞增殖能力沒有明顯變化，冷藏保存72h，OPC增殖能力呈明顯下降趨勢（圖2）。

圖2 冷藏保存不同時(shí)間OPC增殖能力比較

2.3 冷藏保存不同時(shí)間OPC表型比較流式檢測結(jié)果顯示，冷藏保存不同時(shí)間OPC特異性標(biāo)志物PDGF、Olig2、A2B5無明顯變化，各組之間進(jìn)行比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 冷藏保存不同時(shí)間OPC表型的鑒定A：冷藏保存不同時(shí)間OPC表型流式檢測結(jié)果；B：冷藏保存不同時(shí)間OPC表型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.4 冷藏保存不同時(shí)間OPC遷移能力比較Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力，結(jié)果顯示，與冷藏保存0 h比較，冷藏保存24 h OPC遷移能力沒有顯著變化，冷藏保存48 h和冷藏保存72 h，細(xì)胞遷移率下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4，P<0.05）。

圖4 冷藏保存不同時(shí)間OPC遷移能力比較A：冷藏保存不同時(shí)間OPC遷移結(jié)果（DAPI染色，×100）；B：OPC遷移率定量分析（*P<0.05**P<0.01)

2.5 冷藏保存不同時(shí)間OPC分化能力冷藏保存不同時(shí)間的OPC均可分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Galc免疫熒光染色結(jié)果顯示，與冷藏保存0 h比較，冷藏保存24 h Galc陽性率沒有顯著差異（P>0.05），隨著冷藏保存時(shí)間的延長，冷藏保存48 h和冷藏保存72 h OPC分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞比例下降，而冷藏保存72 h OPC分化為Galc陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例下降更為明顯（圖5，P<0.05）。

圖5 冷藏保存不同時(shí)間OPC分化能力的比較A:冷藏保存不同時(shí)間OPC Galc免疫熒光染色結(jié)果（免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，X200）；B:冷藏保存不同時(shí)間OPC Galc免疫熒光染色百分比，*P<0.05.

2.6 冷藏保存24h OPC體內(nèi)成髓鞘能力將冷藏保存24 h的OPC移植到WMI大鼠側(cè)腦室，細(xì)胞移植后3個(gè)月，MBP和Stem121免疫熒光染色結(jié)果顯示，移植細(xì)胞在損傷的白質(zhì)中能夠分化為MBP陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞，證明冷藏保存24 h的OPC在體內(nèi)具有良好的活性和遷移能力并且分化為產(chǎn)MBP的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

圖6 冷藏保存24h OPC MBP和Stem121染色（免疫熒光染色，×200）

3 討論

干細(xì)胞制劑進(jìn)行臨床移植前，必須保存于經(jīng)美國食品藥品管理局（Food and Trug Administration,FDA）批準(zhǔn)可直接輸注于人體的保存介質(zhì)中進(jìn)行移植。在實(shí)驗(yàn)研究過程中，干細(xì)胞制劑制備后很快移植到動(dòng)物體內(nèi)，但在臨床轉(zhuǎn)化過程中很難實(shí)現(xiàn)即刻移植，這是因?yàn)榧?xì)胞制備需要在GMP（Good Man‐ufacturing Practice,GMP）實(shí)驗(yàn)室完成，而細(xì)胞移植需要在經(jīng)國家批準(zhǔn)的醫(yī)院內(nèi)進(jìn)行，因此，干細(xì)胞制劑需要在冷藏介質(zhì)中保存一定時(shí)間才能輸注給患者。雖然目前干細(xì)胞凍存技術(shù)較為成熟[17-18]，但由于細(xì)胞復(fù)蘇活率低、細(xì)胞復(fù)蘇后需要恢復(fù)一定時(shí)間才能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[19-20]、冷凍保護(hù)劑對人體有害[21]、復(fù)蘇細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求高，因此并不適用于干細(xì)胞短期保存。

目前尚無關(guān)于OPCs保存條件的相關(guān)研究或指南，不同研究采用的冷藏保存介質(zhì)不盡相同[22]，Wang等[23]采用PBS，Zhang等[24]采用培養(yǎng)基作為細(xì)胞制劑冷藏保存介質(zhì)，但這些保存介質(zhì)只適用于實(shí)驗(yàn)研究，不適合臨床轉(zhuǎn)化。5%葡萄糖注射液是經(jīng)典的藥物溶劑。有研究指出，高糖環(huán)境會(huì)影響干細(xì)胞的活性和增殖能力[25]，但也有研究[26]認(rèn)為，5%葡萄糖注射液在短期內(nèi)可維持干細(xì)胞的活性。在冷藏保存液中加入一定濃度的人血白蛋白對細(xì)胞存活具有保護(hù)作用，然而，保存液中人血白蛋白濃度并不是越高越好，chen等[27]在間充質(zhì)干細(xì)胞冷藏保存實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度的人白蛋白并不利于提高細(xì)胞存活。因此我們在臨床常用的藥物溶媒5%葡萄糖注射液中加入1%人血白蛋白，評價(jià)OPC在此種冷藏保存介質(zhì)中保存不同時(shí)間對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

我們在研究過程中發(fā)現(xiàn)，冷藏保存24 h和冷藏保存0 h的OPC比較，細(xì)胞活率和增殖能力雖然沒有顯著差異，但隨著保存時(shí)間的增加，細(xì)胞活率和增殖能力整體呈下降趨勢。除了細(xì)胞活率和增殖能力，細(xì)胞遷移能力是實(shí)現(xiàn)臨床有效治療非常重要的指標(biāo)[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，人神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脫髓鞘小鼠，僅在注射部位形成髓鞘，髓鞘形成不良的原因主要是移植細(xì)胞遷移能力不足[29]。有文獻(xiàn)報(bào)道，OPCs的遷移和趨化因子受體表達(dá)有關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育的OPCs依賴于CXCR4信號(hào)遷移到白質(zhì)中形成髓鞘[30]，然而目前尚無關(guān)于冷藏保存對OPC遷移能力影響的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與冷藏保存0 h OPC比較，冷藏保存48 h的OPC遷移能力降低，而保存72 h的OPC遷移能力降低更為顯著。有研究表明細(xì)胞遷移能力隨著保存時(shí)間的延長而下降的原因可能與冷藏過程中細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高引起的細(xì)胞損傷有關(guān)[31]。

細(xì)胞分化能力是反映OPCs冷藏保存效果較為客觀的指標(biāo)。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，冷藏保存48h和72h的OPC分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例較冷藏保存0h有顯著差異。然而，移植到體內(nèi)的OPC只有分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞包繞神經(jīng)元軸突才能修復(fù)受損的髓鞘[32,33]，發(fā)揮其生物學(xué)功能。為了驗(yàn)證冷藏保存后的OPCs在體內(nèi)是否能夠形成髓鞘，我們擇優(yōu)選擇冷藏保存24h的OPCs移植到腦白質(zhì)損傷大鼠腦內(nèi)，免疫熒光染色結(jié)果顯示冷藏保存24h的OPCs具有良好的遷移能力并分化為產(chǎn)MBP的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

盡管OPC冷藏保存不同時(shí)間細(xì)胞特異性標(biāo)記沒有發(fā)生變化，并且冷藏保存48h和72h仍能達(dá)到FDA對細(xì)胞移植活率不低于70%的要求，但隨著保存時(shí)間的增加，細(xì)胞體外遷移和分化能力呈下降趨勢。因此，建議OPC制劑在含1%人血白蛋白的5%葡糖糖注射液中冷藏保存24 h內(nèi)使用。

總之，我們在體外實(shí)驗(yàn)初步探索了人少突膠質(zhì)前體細(xì)胞冷藏保存不同時(shí)間對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)冷藏保存24 h的OPCs移植到體內(nèi)能夠形成髓鞘，發(fā)揮生物學(xué)功能。但在實(shí)際臨床轉(zhuǎn)化過程中，干細(xì)胞產(chǎn)品不可避免需要更長距離的運(yùn)輸，因此冷藏保存48 h和72 h的OPCs在體內(nèi)是否具有成髓鞘能力還有待驗(yàn)證。在未來研究中，我們將繼續(xù)探索在保存介質(zhì)中添加具有細(xì)胞保護(hù)作用或能為細(xì)胞提供營養(yǎng)的成分，如復(fù)合氨基酸、維生素等，以此提高細(xì)胞活性，延長保存時(shí)間，為臨床轉(zhuǎn)化提供質(zhì)量合格、安全有效的干細(xì)胞產(chǎn)品。