刺參腸道組織結(jié)構(gòu)及消化酶活性分析

王涵，王浩娜，趙業(yè)

(煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

刺參Apostichopusjaponicus隸屬于棘皮動(dòng)物門(mén)Echinodermata海參綱Holothuroidea楯手目Aspidochirotida刺參科Stichopodidae仿刺參屬Apostichopus，主要分布在日本、朝鮮、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)沿海，以及中國(guó)山東半島和遼東半島沿海。刺參具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，如腸道和體壁中富含人體必需元素(Fe、Cu、Mn和Zn等)和必需脂肪酸，同時(shí)，體壁中豐富的酸性黏多糖具有增強(qiáng)人體免疫的作用[1-2]，因而備受消費(fèi)者青睞。近年來(lái)，海參養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，截至2020年，中國(guó)海參養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)196 564 t[3]，已成為海水養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分。消化道是刺參食物消化與吸收的主要場(chǎng)所，也是其生長(zhǎng)和發(fā)育的重要基礎(chǔ)，因此,開(kāi)展消化道組織、形態(tài)和功能的研究，對(duì)于探索刺參攝食、消化、吸收和免疫等機(jī)制至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)刺參消化道組織結(jié)構(gòu)和消化酶相關(guān)研究較多，主要集中在消化道的組織學(xué)和組織化學(xué)[4-6]，以及間歇投喂[7]、鹽度脅迫[8]和氨氮脅迫[9]等模式下刺參消化酶活性變化等。

黏液細(xì)胞廣泛存在于水生動(dòng)物的消化道、表皮和呼吸器官中，屬于腺體細(xì)胞[10]。在水生動(dòng)物消化道中，由黏液細(xì)胞分泌產(chǎn)生的以黏蛋白為主的黏液，在維持消化道潤(rùn)滑、促進(jìn)物質(zhì)消化吸收和構(gòu)建腸道上皮保護(hù)屏障等方面具有重要作用，并為數(shù)以?xún)|計(jì)的腸道共生微生物提供寄居場(chǎng)所和部分食物來(lái)源，共同維護(hù)腸道微生態(tài)平衡[11]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于水生動(dòng)物消化道黏液細(xì)胞的研究主要集中在魚(yú)類(lèi)，如對(duì)大鱗副泥鰍Paramisgurnusdabryanus仔稚魚(yú)[12]、豹紋鰓棘鱸Plectropomusleopardus[13]、大口黑鱸Micropterussamoides[14]、小黃魚(yú)Larimichthyspolyactis[15]、建鯉Cyprinuscarpiovar.Jian[16]和半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis[17]等魚(yú)類(lèi)腸道黏液細(xì)胞的類(lèi)型、分布、功能和黏液成分的研究。對(duì)無(wú)脊椎海洋動(dòng)物消化道黏液細(xì)胞的相關(guān)研究主要集中在貝類(lèi)，如對(duì)海灣扇貝Argopectenirradians[18]、文蛤Meretrixmeretrix[19]的消化道黏液細(xì)胞類(lèi)型和分布的研究。然而，有關(guān)刺參消化道黏液細(xì)胞的系統(tǒng)研究目前鮮有報(bào)道。本研究中，以刺參為試驗(yàn)材料，研究了其腸道不同部位(前腸、中腸和后腸)的組織結(jié)構(gòu)、黏液細(xì)胞分布與消化酶活性的變化特征，以期為刺參后續(xù)的飼料開(kāi)發(fā)、生態(tài)養(yǎng)殖和科學(xué)投喂等提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參于2020年5月購(gòu)自山東煙臺(tái)安源水產(chǎn)股份有限公司，個(gè)體體質(zhì)量為(43.58±6.78)g。伊紅(H.E)染色試劑盒及阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫(AB-PAS)染色試劑盒均為北京Solarbio科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 隨機(jī)取10頭刺參，解剖取其前、中、后腸，迅速置于Bouin’s液中固定24 h，然后保存于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中，用于切片觀察；隨機(jī)取8頭刺參，解剖取其前、中、后腸，放入液氮中速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于腸道消化酶活性測(cè)定。

1.2.2 組織學(xué)和組織化學(xué)分析 采用常規(guī)石蠟切片方法，切片厚度為10 μm，用H.E染色，在Zeiss顯微鏡下觀察并拍照。分別取3張腸道不同部位的切片，每張切片隨機(jī)選取8個(gè)視野測(cè)量腸道黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層的厚度，以及黏膜褶皺高度和數(shù)量。

將上述刺參腸道組織切片經(jīng)AB-PAS染色，觀察腸道黏液細(xì)胞的類(lèi)型和分布特征。分別取3張腸道不同部位的切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)黏液細(xì)胞類(lèi)型、分布和數(shù)量進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，以每一視野中100 μm×100 μm范圍內(nèi)黏液細(xì)胞數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)。

依據(jù)本試驗(yàn)中AB-PAS組織切片染色結(jié)果和尹苗等[20]對(duì)黏液細(xì)胞的劃分標(biāo)準(zhǔn)，將黏液細(xì)胞劃分為4種類(lèi)型：Ⅰ型黏液細(xì)胞含中性黏多糖，呈紅色(AB陰性，PAS陽(yáng)性)；Ⅱ型黏液細(xì)胞含酸性黏多糖，呈藍(lán)色(AB陽(yáng)性，PAS陰性)；Ⅲ型黏液細(xì)胞包含大量中性黏多糖和少量酸性黏多糖，呈紫紅色(AB陽(yáng)性，PAS陽(yáng)性)；Ⅳ型黏液細(xì)胞包含大量酸性黏多糖和少量中性黏多糖，呈藍(lán)紫色(AB陽(yáng)性，PAS陽(yáng)性)。

1.2.3 消化酶活性測(cè)定 前、中、后腸樣品經(jīng)稱(chēng)重后，按質(zhì)量與體積比為1∶9(g∶mL)加入Tris-HCl緩沖液[21](0.01 mol/L Tris-HCl，其中含0.1 mol/L EDTA-2Na、0.01 mol/L蔗糖、8 g/L NaCl, pH 7.4)勻漿，將制備好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿液在4 ℃下以2 000 r/min離心15 min，取上清液。通過(guò)多功能酶標(biāo)儀(Biotek，Epoch 2)和紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(INESA，L5S)檢測(cè)吸光度。采用南京建成科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定脂肪酶、胰蛋白酶、堿性磷酸酶和淀粉酶活力，采用上海Beyotime生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示,采用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參腸道不同部位的組織結(jié)構(gòu)

刺參腸道組織切片顯示，前、中、后腸組織結(jié)構(gòu)相似，均由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層組成(圖1)。

A、B—前腸；C、D—中腸；E、F—后腸；M—黏膜層；MC—肌肉層；MF—黏膜褶皺；S—漿膜層；SM—黏膜下層。A and B—foregut; C and D—midgut; E and F—hindgut; M—mucosa; MC—muscularis; MF—mucosa fold; S—serosa; SM—submucosa.圖1 刺參腸道組織學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Histological structure of intestinal tract of sea cucumber Apostichopus japonicus

從表1可見(jiàn)：刺參腸道中，黏膜層厚度依次為前腸>中腸>后腸，其中，前腸黏膜層厚度顯著高于中腸和后腸(P<0.05)；黏膜下層厚度依次為后腸>中腸>前腸，且三者均存在顯著性差異(P<0.05)，其中前腸黏膜下層厚度僅為后腸的49.44%；肌層厚度依次為前腸>后腸>中腸，其中前腸肌層厚度顯著高于中腸和后腸(P<0.05)；前、中、后腸漿膜層厚度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

刺參各腸段黏膜層上均散布黏膜褶皺(圖1A、C、E)，前腸黏膜褶皺數(shù)量和高度均高于中腸和后腸，后腸黏膜褶皺數(shù)量和高度最低(表1)。

表1 刺參腸道組織形態(tài)參數(shù)測(cè)量結(jié)果Tab.1 Morphometric parameters of intestinal tract tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 刺參腸道不同部位黏液細(xì)胞類(lèi)型及分布特征

刺參腸道中，前、中、后腸均含Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型4種類(lèi)型的黏液細(xì)胞(圖2)。

從黏液細(xì)胞數(shù)量來(lái)看：從前腸至后腸，黏液細(xì)胞總數(shù)量呈遞減趨勢(shì)，三者間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但各類(lèi)型黏液細(xì)胞數(shù)量有一定差異；Ⅰ型黏液細(xì)胞數(shù)量依次為中腸>前腸>后腸，前腸和中腸Ⅰ型黏液細(xì)胞數(shù)量顯著高于后腸(P<0.05)；Ⅱ型黏液細(xì)胞數(shù)量依次為前腸>中腸>后腸，前腸和中腸Ⅱ型黏液細(xì)胞數(shù)量顯著高于后腸(P<0.05)，后腸Ⅱ型黏液細(xì)胞數(shù)量?jī)H為前腸的44.44%；Ⅲ型和Ⅳ型黏液細(xì)胞數(shù)量依次為前腸>中腸>后腸，三者間存在顯著性差異(P<0.05)(表2)。

從黏液細(xì)胞分布來(lái)看：前、中、后腸中，4種黏液細(xì)胞數(shù)量分布均為Ⅳ型>Ⅲ型>Ⅱ型>Ⅰ型，其中前、中、后腸Ⅳ型黏液細(xì)胞數(shù)量分別占黏液細(xì)胞總數(shù)的42.80%、40.07%和49.00%(表2)。

表2 刺參腸道一個(gè)視野(100 μm×100 μm)中黏液細(xì)胞的數(shù)量及其占比

2.3 刺參腸道不同部位消化酶活性

從表3可見(jiàn)：刺參腸道中，前腸胰蛋白酶活力和淀粉酶活力最高，且顯著高于中腸和后腸(P<0.05)；脂肪酶活力依次為前腸>后腸>中腸，前腸脂肪酶活力顯著高于中腸(P<0.05)；堿性磷酸酶活力依次為前腸>中腸>后腸，前腸和中腸堿性磷酸酶活力顯著高于后腸(P<0.05)。

表3 刺參腸道消化酶活力Tab.3 Relative digestive enzyme activities of intestinal tract of sea cucumber Apostichopus japonicus U/mg prot

3 討論

3.1 刺參腸道組織結(jié)構(gòu)

刺參腸道組織由內(nèi)向外依次為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層[4，22-23]，黏膜層上分布有發(fā)達(dá)的微絨毛和分泌黏液的黏液細(xì)胞，富含各種消化酶，因此，腸道黏膜層是刺參消化吸收的主要部位，腸道黏膜層的厚度直接影響著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散的速度[24-25]。本研究表明，刺參腸道黏膜層厚度在不同部位具有明顯差異，從前腸至后腸依次遞減，且前腸黏膜層厚度顯著高于中腸和后腸，與同屬海參綱的花刺參Stichopusmonotuberculatus[6]、許氏枝柄參Cladolabesschmeltzii[25]和黑海參Holothuriaatra[26]腸道變化趨勢(shì)十分相似。同時(shí)，腸道黏膜層向內(nèi)凸起形成許多黏膜褶皺，表面紋狀緣發(fā)達(dá)，增大了腸道消化吸收面積[27]。研究表明，黏膜褶皺的數(shù)量、厚度和完整性是衡量腸道消化吸收功能的重要指標(biāo)[28]。本試驗(yàn)中，刺參前腸的黏膜褶皺數(shù)量和高度均高于中腸和后腸，后腸黏膜褶皺數(shù)量和高度最低，由此推測(cè)，刺參前腸的消化吸收能力強(qiáng)于中腸和后腸。

A、B—前腸；C、D—中腸；E、F—后腸；Ⅰ～Ⅳ—Ⅰ～Ⅳ型黏液細(xì)胞。A and B—foregut; C and D—midgut; E amd F—hindgut; Ⅰ-Ⅳ—type Ⅰ to type Ⅳ mucous cells.圖2 刺參腸道黏液細(xì)胞分布Fig.2 Distribution of mucous cell in intestinal tract of sea cucumber Apostichopus japonicus

刺參作為雜食性動(dòng)物，其腸道內(nèi)含物主要為各種無(wú)機(jī)微粒、貝殼碎片、棘皮動(dòng)物骨骼殘骸及碎屑顆粒等，為滿(mǎn)足自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，刺參必須增加攝食的時(shí)間和數(shù)量[29-30]。本研究中發(fā)現(xiàn)，刺參腸道不同部位的肌層厚度依次為前腸>后腸>中腸，且前腸肌層厚度顯著高于中腸和后腸。原因可能是：前腸肌層最厚且較發(fā)達(dá)，有助于食物和腸道消化酶進(jìn)行充分接觸，輔助增強(qiáng)消化吸收功能并推動(dòng)食物團(tuán)向中腸移動(dòng)[31]；其次，中腸肌層較前腸變薄，腸道蠕動(dòng)減慢，以增加食物團(tuán)消化吸收的時(shí)間；而后腸肌層再增厚，利于推動(dòng)食物團(tuán)的快速通過(guò)及食物殘?jiān)呐懦鯷15]。

3.2 刺參腸道黏液細(xì)胞分布

消化道中的黏液細(xì)胞可以分泌黏液和消化酶，在促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持腸道潤(rùn)滑通暢和抵御病原體侵害中具有重要作用[32]。因此，黏液細(xì)胞的數(shù)量、類(lèi)型及分布特征可間接反映腸道的生理功能。對(duì)魚(yú)類(lèi)黏液細(xì)胞研究表明，在消化道的不同部位，黏液細(xì)胞的種類(lèi)及數(shù)量分布具有明顯差異[14,33]。本研究表明，刺參腸道不同部位的黏液細(xì)胞數(shù)量和類(lèi)型分布亦存在一定的變化趨勢(shì)，從黏液細(xì)胞數(shù)量上看，刺參前腸4種類(lèi)型的細(xì)胞數(shù)量和黏液細(xì)胞總數(shù)量均高于中腸和后腸，推測(cè)刺參前腸具有較強(qiáng)的消化吸收功能，而后腸消化吸收功能較弱，與上述組織結(jié)構(gòu)研究結(jié)果相一致；從黏液細(xì)胞分布類(lèi)型看，刺參腸道各部位均包含4種黏液細(xì)胞類(lèi)型，與對(duì)文蛤的研究結(jié)果一致[19]。同時(shí)，刺參腸道黏液細(xì)胞類(lèi)型均以Ⅲ型和Ⅳ型為主，兩類(lèi)黏液細(xì)胞數(shù)量共占總黏液細(xì)胞數(shù)量比例達(dá)69%以上。研究表明，Ⅰ型和Ⅱ型黏液細(xì)胞為幼稚型，而Ⅲ型和Ⅳ型黏液細(xì)胞為成熟型[34]，提示刺參消化道黏液細(xì)胞以成熟型為主，表明其具有穩(wěn)定成熟的消化能力。本試驗(yàn)中，Ⅲ型黏液細(xì)胞在刺參前腸所占比例最高(32.49%)，高于中腸和后腸(29.30%和30.76%)。由于Ⅲ型黏液細(xì)胞以中性黏蛋白為主，而中性黏蛋白能夠降解大量食物顆粒，可配合堿性磷酸酶將食物轉(zhuǎn)化成食糜[35]，有助于食物的消化和吸收。由此推測(cè)，刺參前腸的黏液細(xì)胞類(lèi)型組成有助于增強(qiáng)對(duì)食物顆粒的消化吸收能力。本試驗(yàn)中，Ⅳ型黏液細(xì)胞在刺參后腸所占比例最高(49.00%)，高于前腸和中腸(42.80%和40.07%)。由于Ⅳ型黏液細(xì)胞以酸性黏蛋白為主，而酸性黏蛋白可包圍并消除許多病原微生物，如硫酸化黏蛋白對(duì)細(xì)菌蛋白酶和糖苷酶的酶降解具有良好的抗性，有助于防止細(xì)菌定植，因此，可以保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免受病原微生物的入侵[36-37]；同時(shí)酸性黏蛋白還可減免食物團(tuán)和殘?jiān)ㄟ^(guò)腸道時(shí)對(duì)腸道造成的機(jī)械損傷，促進(jìn)后腸殘留物的消除[38]。由此推測(cè)，相比前腸和中腸，后腸具有更強(qiáng)的酸性黏蛋白分泌能力，可能在腸道免疫保護(hù)及黏膜免疫方面發(fā)揮重要作用。

3.3 刺參腸道消化酶活性

刺參消化道具有包括胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶在內(nèi)的多種消化酶活性，這表明這些酶在刺參腸道蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和糖類(lèi)消化吸收方面發(fā)揮重要作用[39]。堿性磷酸酶主要存在于魚(yú)類(lèi)前腸上皮細(xì)胞的淺部和紋狀緣上，是一種金屬酶，與腸道脂類(lèi)、葡萄糖、鈣和無(wú)機(jī)磷的吸收存在正相關(guān)性[40]。本研究中發(fā)現(xiàn)，刺參腸道不同部位均具有堿性磷酸酶活性，表明堿性磷酸酶在促進(jìn)刺參腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收方面發(fā)揮重要作用，這與崔龍波等[4]、姜令續(xù)等[41]關(guān)于刺參消化道酶活力的測(cè)定結(jié)果一致。本研究表明，刺參的腸道酶活力主要集中在前腸，中腸酶活力減弱，后腸消化酶活力最弱，這一消化道酶活力趨勢(shì)與眾多魚(yú)類(lèi)研究結(jié)果一致，如大鱗副泥鰍[12]、鱈Merlucciusmerluccius[42]和細(xì)點(diǎn)牙鯛Dentexdentex[43]等。由此推測(cè)，刺參前腸消化吸收能力較強(qiáng)，中腸為過(guò)渡連接，消化能力較弱，后腸消化能力最弱，但后腸分泌酸性黏蛋白的能力較強(qiáng)，這與前述刺參腸道組織結(jié)構(gòu)和黏液細(xì)胞分布特征的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

1)刺參腸道不同部位各組織層厚度、黏膜褶皺高度和數(shù)量具有明顯差異，刺參腸道組織結(jié)構(gòu)與其功能相適應(yīng)，前腸消化吸收能力高于中腸和后腸。

2)刺參腸道黏液細(xì)胞總數(shù)量從前腸至后腸呈遞減趨勢(shì)，腸道黏液細(xì)胞的類(lèi)型、數(shù)量和分布特征與其發(fā)揮的生理功能密切相關(guān)。

3)刺參的腸道消化酶活性主要集中在前腸，中腸消化酶活性減弱，后腸消化酶活性最弱，表明刺參前腸消化吸收能力最強(qiáng)，中腸較弱，后腸消化能力最弱，但后腸分泌酸性黏蛋白的能力較強(qiáng)。