維生素C對(duì)龍睛金魚親魚繁殖性能、免疫及后代仔魚質(zhì)量的影響

李鐵梁，邢薇，徐冠玲，馬志宏，姜娜，郁歡歡，羅琳

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068)

金魚是中國(guó)特有的名貴觀賞魚類，具有久遠(yuǎn)的養(yǎng)殖歷史，并因其絢麗的色彩、優(yōu)美的體態(tài)及典雅的游姿深受人們喜愛，享有中國(guó)“國(guó)魚”的美譽(yù)。金魚上市前要通過(guò)多輪的淘汰優(yōu)選，出品率極低[1]，以龍睛金魚Carassiusauratus為例，生產(chǎn)中多數(shù)仔魚因身體或顏色上的畸形、殘缺而被淘汰，能作為成品魚上市的比例不足10%。因此，在人工育苗過(guò)程中提高親魚繁殖性能及仔魚質(zhì)量成為金魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中亟待解決的問題。魚類在繁殖階段需要大量營(yíng)養(yǎng)，該階段營(yíng)養(yǎng)失衡或缺乏會(huì)引起親魚性腺發(fā)育不良，配子質(zhì)量低下，進(jìn)而導(dǎo)致親魚繁殖性能及仔魚質(zhì)量降低[2]。因此，滿足親魚營(yíng)養(yǎng)需求是提升親魚繁殖性能與仔魚質(zhì)量的重要保障。但有關(guān)金魚親魚的營(yíng)養(yǎng)需求研究目前幾乎還是空白。

維生素C(vitamin C，VC)是維持動(dòng)物生長(zhǎng)和正常生理功能所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素[3-4]。近年來(lái)，對(duì)食用魚的研究發(fā)現(xiàn)，VC可通過(guò)促進(jìn)親魚性腺發(fā)育[8]，改善精卵質(zhì)量，進(jìn)而影響親魚的繁殖性能[9-10]和后代仔魚質(zhì)量[9]。目前，有關(guān)VC對(duì)觀賞魚生長(zhǎng)[5]、免疫、抗應(yīng)激反應(yīng)[6]和總色素穩(wěn)定性[7]的研究已有一些報(bào)道，但有關(guān)金魚親魚對(duì)VC營(yíng)養(yǎng)需求的研究鮮見報(bào)道。

本研究中，以龍睛金魚為研究對(duì)象，開展了VC對(duì)龍睛金魚親魚繁殖性能及仔魚質(zhì)量的影響研究，探究VC在龍睛金魚親魚性腺成熟、產(chǎn)卵和仔魚階段的作用，以期為開發(fā)觀賞魚親魚營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚為人工養(yǎng)殖的龍睛金魚親魚，由北京鑫淼觀賞魚養(yǎng)殖中心提供，并在該公司養(yǎng)殖車間進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料制作 試驗(yàn)用魚為當(dāng)年繁殖的3月齡龍睛金魚，初始體質(zhì)量為(6.60±0.12)g，選取體質(zhì)健康、攝食活躍的龍睛金魚作為試驗(yàn)用魚。試驗(yàn)開始時(shí)，隨機(jī)分配供試魚至4個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，共用12個(gè)養(yǎng)殖池(1.5 m×1.5 m×0.6 m)進(jìn)行養(yǎng)殖，投喂試驗(yàn)飼料至7月齡(當(dāng)年12月初)時(shí)，按雌、雄比為1∶2，每個(gè)池隨機(jī)留下10尾雌魚和20尾雄魚越冬培養(yǎng)，待第2年水溫達(dá)到20 ℃、出現(xiàn)雄魚追逐雌魚時(shí)(4月中旬)，開始繁殖試驗(yàn)。

試驗(yàn)飼料以魚粉、豆粕為主要蛋白源，以魚油、豆油為主要脂肪源，VC添加劑為35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的L-抗壞血酸-2-磷酸酯(購(gòu)于河北天寅生物技術(shù)有限公司)，采用內(nèi)添加的方式將L-抗壞血酸-2-磷酸酯添加在飼料原料中，與原料一起過(guò) 245 μm孔徑的篩，用攪拌機(jī)混勻后制成直徑為 2.0 mm的顆粒飼料(膨化飼料)，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)飼料由北京友誼恒遠(yuǎn)科技有限公司加工，以該公司鯽飼料中L-抗壞血酸-2-磷酸酯的添加量0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))作為參考，設(shè)計(jì)試驗(yàn)飼料中L-抗壞血酸-2-磷酸酯的等比添加量分別為0.05%(對(duì)照)0.25%、0.50%和1.00%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，對(duì)應(yīng)各組飼料中VC含量的計(jì)算值分別為0.175、0.875、1.75、3.50 mg/g。試驗(yàn)飼料的組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1和表2。

表1 試驗(yàn)飼料的組成成分Tab.1 Ingredient of the experimental diets w/%

表2 試驗(yàn)飼料的一般營(yíng)養(yǎng)成分

1.2.2 親魚管理 親魚池保持水深為30～50 cm，越冬時(shí)維持在80 cm，采用循環(huán)水、充氣養(yǎng)殖，每24 h換水量為池水體的1/10。溶解氧保持在6 mg/L以上，氨氮質(zhì)量濃度<0.2 mg/L，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度<0.05 mg/L。養(yǎng)殖車間頂部采用透明陽(yáng)光板，日照充足。高溫季節(jié)每天飽食投喂3次，每周停食1 d，越冬時(shí)停止投喂。養(yǎng)殖過(guò)程中，每半月抽樣檢測(cè)魚病及健康狀況。

1.2.3 受精卵和出膜4 d內(nèi)仔魚培育 親魚培育期結(jié)束后，為了同步試驗(yàn)條件，挑選具備催產(chǎn)條件的試驗(yàn)魚(雌魚，手握感覺腹部后端柔軟，生殖孔發(fā)紅且有外翻跡象，腹棱(線)較平整；雄魚，手觸感覺鰓蓋追星明顯，生殖孔發(fā)紅且輕觸有少量濃稠精液流出)，注射復(fù)方鮭促性腺釋放激素類似物(購(gòu)于寧波第二激素廠)，從胸鰭基部注射，雌魚注劑量為2 U/100 g，雄魚注射劑量為1 U/100 g；24 h后人工擠卵，并測(cè)定每尾產(chǎn)卵親魚的產(chǎn)卵量。采用半干法進(jìn)行人工授精，受精卵采用靜水培育，將一定數(shù)量的受精卵黏附在白色瓷片上，置于凈水容器中，晝夜水溫保持在19～24 ℃，pH 7.5，溶解氧>6 mg/L，光照充足。4～5 d仔魚出膜后適當(dāng)充氣，光照度控制在500 lx之內(nèi)，每24 h換水1/3。

1.2.4 樣品采集與處理 人工授精前，從每個(gè)平行隨機(jī)取3尾雌、雄親魚稱重，并采集部分精、卵，從尾靜脈采集親魚血液，制備血清后于-20 ℃下保存，用于非特異免疫指標(biāo)和激素指標(biāo)的測(cè)定；采血后的親魚解剖取其性腺組織稱重，并取其腦組織，各組織樣品均用液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。雄魚精液置于4 ℃下保存，用于測(cè)定雄魚精子活力和密度。

1.2.5 仔魚質(zhì)量評(píng)價(jià) 將一定數(shù)量的受精卵黏附在白色瓷片上，靜水培養(yǎng)，用來(lái)統(tǒng)計(jì)受精率、發(fā)眼率、出膜率和仔魚4 d時(shí)的成活率。

1.2.6 指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算

1)精子活力。取4 ℃下保存的各試驗(yàn)組精子樣品，快速用養(yǎng)殖池水稀釋20倍后，滴加在精子分析儀上，利用精子分析系統(tǒng)MX 7.5檢測(cè)精子存活率和精子密度。

2)繁殖性能及仔魚質(zhì)量(kg)。相關(guān)計(jì)算公式為

相對(duì)懷卵量=可擠出成熟卵數(shù)量/魚體質(zhì)量，

受精率=受精卵數(shù)量/總卵數(shù)×100%，

發(fā)眼率=發(fā)眼卵數(shù)量/受精卵數(shù)量×100%，

出膜率=出膜仔魚數(shù)量/發(fā)眼卵數(shù)量×100%，

4 d仔魚成活率=96 h時(shí)仔魚數(shù)量/出膜魚

數(shù)量×100%。

3)血清中雌二醇(Estradiol，E2)和睪酮(Testosterone，T)水平，采用北京北方生物技術(shù)研究所有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)血清中E2和T水平,具體測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書。

4)非特異免疫指標(biāo)水平。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LZM)活力及丙二醛(MDA)含量；采用浙江維益生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)補(bǔ)體C3水平。

1.2.7 雌二醇受體(Erα)、睪酮受體(AR)、PPAR抗氧化受體(PPARγ、PPAR α)和芳香化酶(CYP19a1a)基因表達(dá)水平的測(cè)定 采用Trizol法提取卵巢與精巢組織中的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄酶FastQuant RT Kit (with gDNAase，TIANGEN)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。以18S rRNA為內(nèi)參，采用qRT-PCR檢測(cè)CYP19a1a、Erα、PPARγ、PPARα和AR基因的相對(duì)表達(dá)水平，qRT-PCR的特異性引物設(shè)計(jì)序列見表3，具體操作參照習(xí)丙文等[11]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

表3 RT-PCR引物序列Tab.3 Real-time PCR primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 VC對(duì)親魚繁殖性能及后代仔魚質(zhì)量的影響

從表4可見：各組龍睛金魚親魚的相對(duì)懷卵量有顯著性差異(P<0.05)，其中1.75 mg/g VC添加組的相對(duì)懷卵量最高，且顯著高于3.50、 0.175 mg/g VC添加組；各試驗(yàn)組間精子存活率和受精率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，均為1.75 mg/g VC添加組最高，精子存活率和受精率最高分別為94.65%和91.50%；飼料中VC水平對(duì)親魚的精子密度有顯著性影響(P<0.05)，0.875、1.75 mg/g VC添加組的雄魚精子密度顯著高于其他兩組(P<0.05)。

從表4還可見：飼料中VC水平對(duì)龍睛金魚的發(fā)眼率、出膜率和4 d仔魚成活率存在顯著性影響(P<0.05)；1.75 mg/g VC添加組這3項(xiàng)指標(biāo)均為最高，且顯著高于其他各組(P<0.05)，各試驗(yàn)組4 d仔魚成活率均在80%以上。

從表5可見：雌性親魚血清E2水平隨飼料中VC含量變化發(fā)生顯著性變化(P<0.05)，其中以1.75 mg/g VC添加組E2水平最高，且與 3.50 mg/g VC添加組存在顯著性差異(P<0.05)；各組間雄性親魚血清T水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

從圖1可見：1.75 mg/g VC添加組雌性親魚的ERα表達(dá)量最高，且顯著高于0.175、3.50 mg/g VC添加組(P<0.05)；1.75 mg/g VC添加組雌魚卵巢中CYP19a1a基因表達(dá)量最高，且顯著高于 3.50 mg/g VC添加組(P<0.05)；0.875 mg/g VC添加組雄性親魚精巢中AR表達(dá)量最高，且顯著高于其他VC組(P<0.05)。

2.2 VC對(duì)親魚非特異性免疫能力的影響

從表6可見：飼料中添加VC能顯著增加雌性親魚的血清C3水平(P<0.05)，并降低LZM水平(P<0.05)；飼料中VC添加量對(duì)雄性親魚血清C3、LZM水平無(wú)顯著性影響(P>0.05)。

表4 飼料中VC添加量對(duì)親魚繁殖性能及仔魚質(zhì)量的影響Tab.4 Reproductive performance and larval quality of tested fish fed diets containing different contents of VC

表5 飼料中VC添加量對(duì)親魚血清性激素水平的影響

標(biāo)有不同字母者表示同一指標(biāo)下不同VC水平組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters within same index are significant differences in the different VC level groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.圖1 飼料中VC添加量對(duì)親魚性腺性類固醇激素 ERα、 CYP19 a1 a和 AR基因表達(dá)水平的影響Fig.1 Sex steroid hormone gene expression levels in gonads of tested fish fed diets containing different contents of VC

2.3 VC對(duì)親魚抗氧化性能的影響

從圖2可見：隨著飼料中VC添加量升高，親魚血清SOD水平呈先上升后下降的趨勢(shì)，在1.75 mg/g VC添加組雌魚和雄魚血清SOD活力均達(dá)到最高，且顯著高于其他VC組(P<0.05)，但其他各組間親魚卵巢和精巢中SOD水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)；飼料中VC添加量對(duì)雌魚卵巢MDA水平有顯著性影響(P<0.05)，0.875、1.75 mg/g VC添加組親魚卵巢MDA水平顯著高于0.175 mg/g VC添加組(P<0.05)；飼料中VC添加量對(duì)雌魚血清CAT水平有顯著性影響(P<0.05)，以1.75 mg/g VC添加組的CAT水平最高，且顯著高于其他VC組(P<0.05)。

圖2 飼料中VC添加量對(duì)親魚血清及性腺中SOD、MDA和CAT水平的影響Fig.2 Levels of SOD, MDA and CAT in serum and gonads of tested fish fed diets containing different contents of VC

表6 飼料中VC添加量對(duì)親魚血清中C3和LZM水平的影響Tab.6 Levels of serums C3 and LZM of tested fish fed diets containing different contents of VC

從表7可見：飼料中VC添加量對(duì)雌魚卵巢PPARγ水平有顯著性影響(P<0.05)，以1.75 mg/g VC添加組卵巢PPARγ表達(dá)水平最高，且顯著高于0.875、3.50 mg/g VC添加組(P<0.05)；飼料中VC水平對(duì)雄性親魚精巢PPARγ水平無(wú)顯著性影響(P>0.05)。

表7 飼料中VC添加量對(duì)親魚性腺 PPARγ表達(dá)水平的影響

3 討論

3.1 VC對(duì)親魚性激素合成的影響

VC被認(rèn)為是卵泡細(xì)胞合成分泌雌激素的一種輔助因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)雌激素的合成與分泌[12]，并影響性腺發(fā)育。雌激素E2可以誘導(dǎo)雌魚性腺發(fā)育，基因CYP19a1a和ERα通過(guò)調(diào)控激素水平參與雌魚卵巢分化。本研究中，經(jīng)過(guò)4個(gè)月的VC營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化后，發(fā)現(xiàn)飼料中VC添加量為1.75 mg/g時(shí)，雌性親魚血清E2水平、CYP19a1a表達(dá)水平、ERα基因表達(dá)水平及相對(duì)懷卵量均高于另外兩組VC含量較低的試驗(yàn)組(0.175、0.875 mg/g)，即基因水平、激素水平和繁殖性能結(jié)果一致，這說(shuō)明飼料中VC含量提高有利于雌魚卵巢發(fā)育，進(jìn)而提高了雌魚的產(chǎn)卵性能。這與對(duì)大西洋鮭Salmosalar親魚的研究結(jié)果一致[13]。當(dāng)飼料中VC添加量提高至3.50 mg/g時(shí)，E2水平、CYP19a1a表達(dá)水平和ERα表達(dá)水平及相對(duì)懷卵量均出現(xiàn)下降。這可能是由于VC含量過(guò)高或營(yíng)養(yǎng)不均衡，通過(guò)“腦—腦垂體—性腺”內(nèi)分泌系統(tǒng)抑制了E2合成，影響到親魚的生殖進(jìn)程。

本研究中，雄魚AR表達(dá)水平隨VC添加量增加呈先升高后降低趨勢(shì)，與雌魚激素相關(guān)基因的變化趨勢(shì)一致。雄魚血清中睪酮T水平隨飼料中VC水平的變化趨勢(shì)與雌魚血清E2的變化趨勢(shì)并不一致。這可能是由于T是E2的底物，E2是在芳香化酶(CPY)的作用下由T轉(zhuǎn)化而來(lái)的[14]，因此，飼料中VC添加量對(duì)T和E2的刺激效果不同。

3.2 VC對(duì)親魚繁殖性能的影響

VC對(duì)魚類繁殖性能的重要影響已被廣泛研究證實(shí)。利用添加VC的飼料連續(xù)投喂遮目魚Chanoschanos3年后，遮目魚親魚的產(chǎn)卵量、孵化率和魚苗成活率均得以提高[15]。對(duì)大菱鲆Scophthalmusmaximus[8]、半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis[9]等的研究均發(fā)現(xiàn)，飼料中添加VC能有效提高親魚的精子密度和卵子受精率。本研究中，飼料中VC添加量為0.175～1.75 mg/g時(shí)，供試親魚的相對(duì)懷卵量、精子存活率和精子密度均隨飼料中VC添加量升高而上升，與上述研究結(jié)果一致。當(dāng)VC添加量提高至3.50 mg/g時(shí)，龍睛金魚相對(duì)懷卵量、精子存活率和精子密度反而下降。這與對(duì)大菱鲆[8]親魚的研究結(jié)果有所差別，在大菱鲆親魚飼料中VC添加量為0.80 mg/g時(shí)，其產(chǎn)卵量與對(duì)照組相比顯著增加，而當(dāng)VC添加量增加到4.80 mg/g時(shí)，大菱鲆親魚的產(chǎn)卵量與0.80 mg/g VC組相比無(wú)顯著性差異，但有升高趨勢(shì)。這種差異可能與魚的種類有關(guān)，不同魚類對(duì)VC的需求、敏感度和耐受能力不同。對(duì)龍睛金魚而言，飼料中添加1.75 mg/g VC可能更有利于提高親魚產(chǎn)卵量。

3.3 VC對(duì)親魚健康及后代仔魚質(zhì)量的影響

觀賞魚飼養(yǎng)過(guò)程中常面臨營(yíng)養(yǎng)過(guò)?；騾T乏所引發(fā)的營(yíng)養(yǎng)性應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)激壓力易導(dǎo)致機(jī)體非特性免疫防御系統(tǒng)遭到破壞，外源病菌易感性增加[16]。觀賞魚親魚免疫力低不僅影響自身健康與觀賞性能，同時(shí)可能影響后代仔魚質(zhì)量。本研究表明，飼料中VC添加量對(duì)雌魚血清C3、LZM、血清SOD、CAT及卵巢PPARγ水平均有顯著影響，適宜的VC含量(0.875～1.75 mg/g)能顯著提高龍睛金魚雌魚的非特異免疫能力和抗氧化性能；同時(shí)，仔魚發(fā)眼率、出膜率和仔魚出膜后4 d的成活率對(duì)VC添加量的響應(yīng)變化趨勢(shì)與雌魚非特異免疫力一致。經(jīng)典免疫學(xué)認(rèn)為，母源免疫在免疫防御中發(fā)揮重要作用，雌性親魚免疫力和抵抗力的提高，可由卵子直接傳遞到初生子代，從而提高子代質(zhì)量[17]。因此，推測(cè)飼料中VC可能通過(guò)增強(qiáng)雌性親代免疫力提升后代質(zhì)量。

3.4 龍睛金魚親魚飼料的適宜VC水平

培育健康、優(yōu)質(zhì)的后代仔魚是觀賞魚親魚培育的主要目標(biāo)。親魚在性腺發(fā)育過(guò)程中，尤其是卵子需要積累大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以滿足胚胎和仔魚早期的正常發(fā)育[2-3]。因此，親魚營(yíng)養(yǎng)狀況直接影響親魚繁殖性能及后代仔魚產(chǎn)量[3]。本研究中，VC添加量為0.875 mg/g時(shí)，雖然從相對(duì)懷卵量、精子密度和4 d仔魚成活率方面對(duì)親魚的繁殖性能和后代質(zhì)量有一定促進(jìn)作用，但飼料中VC的含量顯然不能滿足親魚在繁殖期對(duì)VC的需求；而VC添加量為1.75 mg/g時(shí)，對(duì)親魚的繁殖性能有顯著改善。值得注意的是，在飼料中VC添加量增加至3.50 mg/g時(shí)，親魚繁殖性能相比1.75 mg/g VC添加組反而出現(xiàn)下降。綜合考慮，飼料中添加1.75 mg/kg VC更有利于改善龍睛金魚親魚的繁殖性能。

普通金魚飼料VC含量一般在0.140～0.17 mg/g，基本能夠滿足日常營(yíng)養(yǎng)需求，但本研究中發(fā)現(xiàn)，VC添加劑量為0.875～1.75 mg/g時(shí)才能滿足親魚對(duì)VC的需求。對(duì)虹鱒Oncorhynchusmykiss的研究也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，虹鱒生長(zhǎng)發(fā)育所需VC添加量為0.05 mg/g，但親魚繁殖期所需VC添加量為0.40 mg/g[18-19]。這可能是因?yàn)轸~類在親魚階段對(duì)VC需求量更高的原因。

4 結(jié)論

1)飼料中添加VC后，龍睛金魚親魚雌魚血清C3、LZM、SOD、CAT及卵巢PPARγ水平均顯著改善，說(shuō)明飼料中添加適量的VC能提升龍睛金魚親魚的非特異性免疫能力和抗氧化能力。

2)飼料中添加VC后，龍睛金魚雌性親魚相對(duì)懷卵量、雄性親魚精子存活率和精子密度均顯著提高，說(shuō)明飼料中添加適量的VC能改善龍睛金魚親魚的繁殖性能。

3)飼料中添加VC后，龍睛金魚仔魚發(fā)眼率、出膜率和仔魚出膜后4 d成活率顯著提升，說(shuō)明飼料中添加適量的VC能提高龍睛金魚仔魚質(zhì)量。