魚肽和蛋白酶替代部分魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、消化酶及腸道菌群的影響

朱昱錚，申亮，郭冉，荊冰妍，梁倍寧，高佳朋

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000)

凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei又稱南美白對(duì)蝦，在鹽度為0.5～35時(shí)均可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)適宜溫度為22～35 ℃，具有抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)快和肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)[1]。魚粉作為配合飼料中不可或缺的原料，其蛋白質(zhì)、必需氨基酸含量高且易被水產(chǎn)動(dòng)物消化吸收，然而，由于自然條件惡化，導(dǎo)致全球魚粉產(chǎn)量下降，價(jià)格飛漲[2]。因此，尋找魚粉替代品以降低成本，是飼料企業(yè)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)[3]。

魚肽是把低值海雜魚及水產(chǎn)加工副產(chǎn)物經(jīng)過(guò)復(fù)合生物酶解并低溫干燥制備的活性肽產(chǎn)品，其應(yīng)用于幼齡動(dòng)物，容易被消化吸收，適口性好且具有一定的誘食效果，可顯著提高攝食量，降低飼料成本。研究表明，肽類產(chǎn)品具有促進(jìn)魚類生長(zhǎng)的作用[4]，在飼料中添加適量的肽能夠節(jié)省部分魚粉，對(duì)大西洋鮭Salmosalar[5]、鮸狀黃姑魚Nibeamiichthioides[6]和南亞野鯪Labeorohita等[7]的研究表明，肽產(chǎn)品替代部分魚粉是可行的。賈高旺等[8]研究表明，酶解肽替代飼料魚粉比例超過(guò)8%時(shí)，會(huì)降低大菱鲆Scophthalmusmaximus的生長(zhǎng)性能，超過(guò)16%時(shí)嚴(yán)重影響大菱鲆的脂肪吸收代謝機(jī)能。因此，高比例酶解肽替代魚粉會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生影響。

目前，由于植物蛋白價(jià)格低廉、產(chǎn)量高，因此，其已成為魚粉的良好替代品。在植物蛋白飼料中添加酶制劑，可以將大分子蛋白水解成小分子，利于幼魚消化，還可以分解抗?fàn)I養(yǎng)因子[9]。有研究報(bào)道，蛋白酶可顯著改善虹鱒Oncorhynchusmykiss的表觀消化率[10]，也可以降低鯉Cyprinuscarpio飼料系數(shù)，促進(jìn)鯉和青魚Mylopharyngodonpiceus[11-12]的生長(zhǎng)。

腸道菌群是腸道中多種微生物共同作用的結(jié)果，能夠調(diào)節(jié)腸道結(jié)構(gòu)，對(duì)機(jī)體健康發(fā)揮著重要的作用[13]。本試驗(yàn)中，研究了飼料中添加魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、消化酶及腸道菌群產(chǎn)生的影響，探討了魚肽與蛋白酶替代部分魚粉的效果，以期為水產(chǎn)飼料的制備提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

蝦苗購(gòu)自唐山禾豐科技有限公司。魚肽和蛋白酶制劑購(gòu)自秦皇島益爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的配制 魚肽制劑的主要營(yíng)養(yǎng)成分：粗蛋白質(zhì)含量為35%，粗脂肪含量為3%，小肽含量為5%，酸溶蛋白含量為25%。蛋白酶制劑的酶含量為175 mg/kg(60萬(wàn)活力單位)。以含25%的魚粉飼料作為基礎(chǔ)飼料(對(duì)照)，在基礎(chǔ)飼料中，分別添加5%的魚肽和0.3%的蛋白酶替代5%的魚粉(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))作為試驗(yàn)飼料。將原料粉碎過(guò)198 μm孔徑的篩，按配方比例混合，用雙螺桿壓條機(jī)制成1.2 mm直徑的顆粒飼料，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩ｔ~肽分子質(zhì)量分布見表1，飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表1 魚肽的分子質(zhì)量分布Tab.1 Molecular weight distribution of enzymatic peptides

表2 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab.2 Ingredient and proximate nutrient composition of experimental diets (dry mass basis) w/%

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 將凡納濱對(duì)蝦苗在水族箱中暫養(yǎng)兩周后進(jìn)行分組，挑選規(guī)格均勻、體質(zhì)健康、體質(zhì)量為(0.32±0.01)g的蝦苗360尾進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)置魚肽組(EP)、蛋白酶組(PR)和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放40尾蝦苗，分別投喂對(duì)應(yīng)3種飼料。試驗(yàn)過(guò)程中，每日早晨檢測(cè)水質(zhì)，水溫保持在28 ℃左右，溶解氧含量為(7.6±0.7)mg/L，氨氮含量為(0.48±0.13)mg/L，pH為8.0～8.6。每天上午替換1/3的新鮮海水，每天8:00、14:00、20:00定時(shí)喂食[14-15]，兩周稱重一次。 養(yǎng)殖試驗(yàn)共進(jìn)行56 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異顯著，則用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

從表3可見：飼料中添加魚肽和蛋白酶，對(duì)凡納濱對(duì)蝦的增重率、終末體質(zhì)量、含肉率和肝體比有顯著性影響(P<0.05)，而對(duì)存活率、飼料系數(shù)和特定生長(zhǎng)率則無(wú)顯著性影響(P>0.05)；與對(duì)照組相比，魚肽、蛋白酶組的終末體質(zhì)量、增重率顯著提高(P<0.05)，存活率和特定生長(zhǎng)率也有所提高，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，飼料系數(shù)有所降低(P>0.05)。

2.2 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分組成的影響

從表4可見：與對(duì)照組相比，魚肽、蛋白酶組全蝦和肌肉中的粗蛋白質(zhì)含量顯著提高(P<0.05)，粗脂肪和灰分含量顯著降低(P<0.05)；兩組肝臟中粗脂肪含量也顯著提高(P<0.05)。

表3 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響Tab.3 Effects of enzymatic peptide and protease on growth performance of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei

表4 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分組成的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.3 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦表觀消化率的影響

從表5可見，魚肽、蛋白酶組的干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且各組間均有顯著性差異(P<0.05)。

表5 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦表觀消化率的影響

2.4 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)和腸道消化酶活性的影響

從表6可見，蛋白酶組血清葡萄糖含量顯著高于其他兩組(P<0.05)，魚肽、蛋白酶組總膽固醇、甘油三酯含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

從表7可見，各組間脂肪酶、胃蛋白酶活性有顯著性差異(P<0.05)，且魚肽、蛋白酶組脂肪酶和胃蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表6 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響

2.5 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

從表8可見，對(duì)蝦腸道中OTU數(shù)量各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)蝦腸道菌群豐度Ace、Chao1指數(shù)各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但Shannon、Simpson指數(shù)各組間有顯著性差異(P<0.05)，其中，魚肽、蛋白酶組Shannon指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，Simpson指數(shù)則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表7 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道消化酶活性的影響

從圖1可見，在門水平上，各組對(duì)蝦腸道中相對(duì)豐度較大的菌門主要有變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、疣微菌門Verrucomicrobia和放線菌門Actinobacteria，在對(duì)照組中分別占比44.75%、47.68%、2.02%和2.64%，在魚肽組中分別占比46.35%、44.03%、3.33%和5.90%，在蛋白酶組中分別占比38.03%、56.37%、2.30%和2.96%。

這就是漢字。因?yàn)橄笮?，所以不似一個(gè)蒼白的名詞體系，更像是美妙的形容詞體系——微妙的直白，精深的地道——只有懂得的中國(guó)人才能咂摸出味。

表8 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道中OTU數(shù)量、菌群豐度和α多樣性指數(shù)的影響

圖1 門水平上菌群相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of bacteria at phylum level

從圖2可見：在綱水平上，對(duì)蝦腸道中相對(duì)豐度較大的菌綱主要有梭菌綱Clostridia、疣微菌綱Verrucomicrobiae、放線菌綱Actinobacteria、γ變形菌綱Gammaproteobacteria、α變形菌綱Alphaproteobacteria和黃桿菌綱Flavobacteria等，在對(duì)照組中占比分別為1.3%、2.02%、2.96%、6.56%、37.82%和45.65%，在魚肽組中占比分別為1.04%、3.30%、6.09%、8.02%、32.29%和49.01%，在蛋白酶組中占比分別為1.47%、1.30%、3.64%、6.87%、36.99%和46.56%。

從圖3可見：在屬水平上，對(duì)蝦腸道中相對(duì)豐度較大的菌屬有未分類紅桿菌屬Rhodobacteraceae_unclassified、未分類黃桿菌屬Flavobacteriaceae_unclassified、Hoppeia屬、黃桿菌屬Flavobacteriaceae、去甲基醌菌屬Demequina、黏著桿菌屬Tenaci-baculum、鹽蕨屬Haloferula、希瓦氏菌屬Shewanella、弧菌屬Vibrio、魯杰氏菌屬Ruegeria、玫瑰桿菌屬Roseobacter、濟(jì)州島古名菌屬Tamlana、海球菌屬Halioglobus、未分類海仙菌屬Halieaceae_unclassified、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、 Marinilabiaceae_uncultured菌屬等。

圖2 綱水平上菌群相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria at class level

圖3 屬水平上菌群相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria at genus level

3 討論

3.1 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及體成分的影響

姜柯君[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中適量添加小肽，可以改善星斑川鰈Platichthvsstellatus幼魚的蛋白質(zhì)吸收率。Drew等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加蛋白酶，可以提高虹鱒的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。與此相似，本試驗(yàn)中，將魚肽和蛋白酶分別添加到飼料中并降低魚粉的添加量，蝦的干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著提高，雖然各組間飼料系數(shù)、特定生長(zhǎng)率無(wú)顯著性差異，但魚肽、蛋白酶組的飼料系數(shù)低于對(duì)照組。由此可知，飼料中添加魚肽和蛋白酶能提高飼料的利用率。Teshima等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小肽產(chǎn)品可以顯著促進(jìn)蝦幼體的生長(zhǎng)，Zambonino等[18]也認(rèn)為，添加小肽不僅可以促進(jìn)蝦苗生長(zhǎng)，還能夠降低飼料成本。與上述研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)中，魚肽組的增重率最高。

本試驗(yàn)中，魚肽和蛋白酶替代魚粉時(shí)，顯著降低了對(duì)蝦肌肉粗脂肪的含量，顯著提高了粗蛋白質(zhì)的含量，這與張改改等[19]對(duì)大口黑鱸Micropterussalmoides的試驗(yàn)結(jié)果相符，這對(duì)于高蛋白食品的凡納濱對(duì)蝦來(lái)說(shuō)較有益處。由對(duì)蝦肝胰臟脂肪含量檢測(cè)結(jié)果推測(cè)，替代魚粉組的對(duì)蝦肝胰臟脂肪含量增加，可能會(huì)影響蝦體本身對(duì)脂肪的吸收代謝，最后導(dǎo)致蝦體脂肪含量降低，肝胰腺脂肪含量升高。

3.2 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)和腸道消化酶的影響

葡萄糖含量能反映凡納濱對(duì)蝦對(duì)餌料營(yíng)養(yǎng)適宜度及肝臟機(jī)能情況[20-22]。本試驗(yàn)中，魚肽組血清葡萄糖含量較低，說(shuō)明葡萄糖合成代謝的影響小于葡萄糖分解代謝，以加速糖的使用并降低體內(nèi)葡萄糖含量。總膽固醇是機(jī)體重要的脂質(zhì)代謝組成部分，其含量受高低密度脂蛋白的調(diào)控，含量高表示肝臟細(xì)胞出現(xiàn)障礙，脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂[23]。甘油三酯反映脂肪代謝的能力，其水平升高表示機(jī)體肝臟積累了更多的脂肪，導(dǎo)致脂肪肝和肝肥大[24-25]。若體內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)輸受阻，血漿中的甘油三酯水平也會(huì)升高。本試驗(yàn)中，魚肽、蛋白酶組的總膽固醇和甘油三酯含量均顯著低于對(duì)照組，表明魚肽和蛋白酶的添加可以提高機(jī)體脂質(zhì)代謝的能力，降低血脂。

水產(chǎn)動(dòng)物的消化能力和生長(zhǎng)發(fā)育均與消化酶活性有關(guān)，營(yíng)養(yǎng)素的吸收在很大程度上取決于酶的水平[26]。食物的消化和營(yíng)養(yǎng)吸收均在腸道中進(jìn)行，這與腸道消化酶的活性密切相關(guān)[27-28]。胡先勤等[29]認(rèn)為，小肽能提高鯽魚體消化酶活性。與此結(jié)果相似，本試驗(yàn)中魚肽組脂肪酶高于對(duì)照和蛋白酶組。有研究表明，凡納濱對(duì)蝦飼料中添加蛋白酶可提高腸道蛋白酶活性[30]，且對(duì)蝦腸道消化酶活性與對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)間存在相關(guān)性[31]。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，魚肽和蛋白酶組的腸道消化酶(脂肪酶、蛋白酶)活性和試驗(yàn)組的生長(zhǎng)指標(biāo)(增重率、特定生長(zhǎng)率)也呈現(xiàn)了一定的相關(guān)性，魚肽、蛋白酶組均高于對(duì)照組。此外，袁春營(yíng)等[32]對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶和腸道菌群研究發(fā)現(xiàn),腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)微生物菌落對(duì)消化酶活性也存在影響。

3.3 魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響

腸道菌群影響著宿主營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫反應(yīng)和腸黏膜形態(tài)，并以直接接觸、代謝產(chǎn)物等方式與腸道黏膜聯(lián)系在一起，構(gòu)成復(fù)雜的微生物系統(tǒng)[33]。對(duì)蝦腸道寄居著結(jié)構(gòu)復(fù)雜的菌群，能增加宿主的消化效率，這與宿主的健康生長(zhǎng)息息相關(guān)[34]。本試驗(yàn)中，魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群豐度有一定影響，魚肽、蛋白酶組的Shannon指數(shù)顯著高于對(duì)照組，而Simpson指數(shù)則顯著低于對(duì)照組，Shannon指數(shù)越高，表明群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)越小，表明群落多樣性越豐富。這說(shuō)明魚肽和蛋白酶提高了對(duì)蝦腸道菌群多樣性。

Huang等[35]發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦腸道中優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門、擬桿菌門和放線菌門。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組間對(duì)蝦腸道的菌群數(shù)量在門水平上差異較大，其中，魚肽組的變形菌門、放線菌門、疣微菌門相對(duì)豐度高于對(duì)照組，且擬桿菌門也占較大比例。孫振麗等[36]研究表明，對(duì)蝦腸道中擬桿菌門占比較大，與水產(chǎn)養(yǎng)殖的水體有關(guān)。水環(huán)境中最多的菌是變形菌，該結(jié)果也與Stevens等[37]的研究結(jié)果相符。綱水平上，放線菌具有參與新陳代謝、分解許多有機(jī)物和維持腸道平衡等重要功能，放線菌數(shù)量越多，表明腸道健康狀況越好[38-39]。γ變形菌具有的一些特性可以促進(jìn)生物生長(zhǎng)[40]，斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon[41]和羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii[42]不同生長(zhǎng)階段的腸道優(yōu)勢(shì)菌均為γ變形菌綱，其在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量高的水域普遍存在，多樣性及數(shù)量均較大。與此相似，本試驗(yàn)中，魚肽、蛋白酶組的放線菌綱和γ變形菌綱菌群豐度占比大于對(duì)照組。屬水平上，本研究中各組間菌群豐度差異較大，說(shuō)明魚肽和蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦的腸道菌群結(jié)構(gòu)及菌群多樣性產(chǎn)生了一定程度的影響，但仍需要更深層次地研究。

4 結(jié)論

1)在配合飼料中添加魚肽和蛋白酶替代部分魚粉在一定程度上提高了對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，且蝦體蛋白質(zhì)含量升高，粗脂肪含量降低，這對(duì)水產(chǎn)品來(lái)說(shuō)是一個(gè)好的現(xiàn)象，可起到積極的作用，并能降低飼料成本。

2)對(duì)蝦攝食添加魚肽和蛋白酶的飼料后，血糖及甘油三酯和膽固醇的含量顯著降低，反映了蝦體健康和生理狀態(tài)較好，一定程度上可避免高脂血癥帶來(lái)的疾病。

3)飼料中添加魚肽和蛋白酶可顯著提高對(duì)蝦消化酶活性，促進(jìn)機(jī)體對(duì)食物的消化和營(yíng)養(yǎng)吸收。

4)飼料中添加魚肽和蛋白酶，可提高對(duì)蝦腸道菌群豐度，對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)有正面效應(yīng)。

綜上所述，從凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)、消化性能及腸道菌群多樣性等指標(biāo)來(lái)看，魚肽和蛋白酶均可作為新資源替代對(duì)蝦配合飼料中5%的魚粉。