食品與飼料中致病微生物檢測技術(shù)及展望

武俠均

（唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北 唐山 063000）

影響人類食品和動物飼料產(chǎn)品質(zhì)量安全的因素有很多，其中致病微生物污染是最重要因素之一。致病微生物就是能夠?qū)е氯祟惡蛣游锛膊〉奈⑸?，其可直接影響人類食品和動物飼料產(chǎn)品的質(zhì)量與安全，進而危害人類和動物健康，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成重大損失，甚至引發(fā)公共安全事件。因此，飼料和食品中致病微生物的檢測技術(shù)很早就成為了人類研究的重要課題之一。

飼料和食品中致病微生物的檢測是在微生物鑒定學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門應(yīng)用技術(shù)。隨著微生物學(xué)研究的不斷深入和新技術(shù)的應(yīng)用，致病微生物檢測技術(shù)也得到了很好的發(fā)展。目前，在我國現(xiàn)行有效的飼料和食品檢測標(biāo)準(zhǔn)中，傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代技術(shù)同時存在，但傳統(tǒng)方法占據(jù)主導(dǎo)地位，所有標(biāo)準(zhǔn)的仲裁方法都是采用的傳統(tǒng)經(jīng)典方法?，F(xiàn)代技術(shù)多在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中出現(xiàn)，尤其在出入境標(biāo)準(zhǔn)中較多，盡顯其開放、快速、高效的行業(yè)特點，但陽性樣品的最終鑒定仍然要依賴傳統(tǒng)的鑒定方法。本文對現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)進行了分類歸納和總結(jié)，并提出了一些技術(shù)上的問題和思考，以期能夠?qū)︼暳虾褪称焚|(zhì)量安全檢測工作，以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制修訂工作有所裨益。

1 常見致病微生物及其危害

目前，飼料和食品質(zhì)量安全監(jiān)測中常見的致病微生物主要是腸道微生物，例如沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、霉菌等。

1.1 致病微生物的危害 飼料和食品中的致病微生物主要是引起腸道反應(yīng)和中毒癥狀，影響畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類生活，甚至危及動物和人類健康。以沙門氏菌為例，鼠傷寒沙門氏菌病在世界公共衛(wèi)生學(xué)上是一類危害極大的人畜共患??；沙門氏菌屬腸桿菌科，感染后可導(dǎo)致人和動物中毒，引起胃腸炎、傷寒和副傷寒、敗血癥等，嚴(yán)重時可以造成人和動物死亡（蔣培紅，2007）。有資料顯示，沙門氏菌污染是美國食品中毒死亡的主要因素之一。全美每年報道約4萬人被感染致病，而實際患病人數(shù)可能超過報道人數(shù)的20倍（許多輕癥患者因未就醫(yī)，而未被統(tǒng)計）；據(jù)不完全統(tǒng)計，每年約有上千人死于沙門氏菌急性感染。

2.2 霉菌毒素的危害 許多微生物在生長和繁殖過程中會產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)，其中以霉菌毒素最為常見，而且危害最大。這類微生物主要包括曲霉菌屬、青霉菌屬和鐮刀菌屬等，其產(chǎn)生的毒素以黃曲霉毒素、嘔吐毒素、赭曲霉菌毒素、雪腐鐮刀菌烯酮、玉米赤霉烯酮較為多見。以黃曲霉毒素為例，黃曲霉毒素是由黃曲霉菌、寄生曲霉菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，是一類二氫呋喃香豆素衍生物，主要有B1、B2、G1、G2，以及兩種動物代謝產(chǎn)物M1、M2。黃曲霉毒素被世衛(wèi)組織界定為一類致癌物質(zhì)，其毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，其毒害作用主要是對人類及動物的肝臟造成傷害，可引發(fā)肝炎、肝硬化、肝壞死等（馬建等，2012）。黃曲霉毒素B1也是飼料和食品污染中最為常見的毒素之一，其毒性和致癌作用也最強。據(jù)報道，20世紀(jì)60年代發(fā)生在英國的大量火雞突發(fā)性死亡事件，是由于使用了被黃曲霉毒素污染的花生粕造成的?；ㄉ陀衩鬃褜嵤亲钊菀妆稽S曲霉毒素污染的飼料和食品加工原料。

2 致病微生物檢測技術(shù)現(xiàn)狀

目前，飼料和食品中致病微生物檢測技術(shù)分為傳統(tǒng)檢測技術(shù)和現(xiàn)代快速檢測技術(shù)兩大類。但無論是動物飼料，還是人類食品的檢測，國家標(biāo)準(zhǔn)和仲裁標(biāo)準(zhǔn)主要以傳統(tǒng)技術(shù)為主，現(xiàn)代技術(shù)應(yīng)用較少，目前主要出現(xiàn)在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)中。從現(xiàn)有的飼料和食品中致病微生物檢測技術(shù)來看，致病微生物的檢測大致分為兩大步驟，一是增菌與分離培養(yǎng)，二是分類鑒別與鑒定。

2.1 傳統(tǒng)檢測技術(shù)及其應(yīng)用 傳統(tǒng)檢測技術(shù)是在細(xì)胞形態(tài)學(xué)和習(xí)性水平上，通過觀察微生物的細(xì)胞與菌落的形態(tài)、大小，及其生理特性、生化反應(yīng)等特征對其進行微生物學(xué)分類鑒別的方法。現(xiàn)階段，在我國現(xiàn)行有效的飼料致病微生物檢測國家標(biāo)準(zhǔn)中飼料中霉菌總數(shù)、大腸菌群、細(xì)菌總數(shù)、志賀氏菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等檢測標(biāo)準(zhǔn)均采用的是傳統(tǒng)技術(shù)；現(xiàn)行有效的36個“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789）》”中大多采用的也是傳統(tǒng)方法。

2.1.1 傳統(tǒng)經(jīng)典檢測方法 經(jīng)典的檢測方法其過程包括增菌和預(yù)增菌、分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生理/生化鑒別、血清學(xué)鑒別五個步驟。增菌和預(yù)增菌是使飼料或食品中的目標(biāo)菌和因為貯存或加工而受傷的目標(biāo)菌復(fù)壯和增殖的過程。分離培養(yǎng)是將待分離的目標(biāo)菌通過一定的方式接種在適當(dāng)?shù)钠桨迮囵B(yǎng)基上，使其細(xì)胞(或孢子)盡量分散，并長成一個個純種的單個菌落的過程。形態(tài)學(xué)觀察是通過肉眼觀察目標(biāo)菌落的大小、形狀、光澤度、顏色和透明度等特性，或通過顯微鏡和染色技術(shù)觀察細(xì)菌的大小、形狀等特性，對其進行形態(tài)學(xué)鑒別。生理/生化鑒別是根據(jù)微生物對營養(yǎng)需要的不同，及其代謝產(chǎn)物的一些特定化學(xué)反應(yīng)，通過觀察其生長狀況、化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物，以及化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化和現(xiàn)象，對其進行分類鑒定。血清學(xué)鑒別是根據(jù)微生物免疫學(xué)抗原/抗體特異性反應(yīng)，對其進行分類、細(xì)分鑒定。經(jīng)典方法的鑒定指標(biāo)見表1。

表1 經(jīng)典方法鑒定指標(biāo)

2.1.2 傳統(tǒng)快速檢測系統(tǒng) 傳統(tǒng)的經(jīng)典方法最繁瑣的工作是在生化鑒定和血清學(xué)鑒定環(huán)節(jié)。為了解決這個問題，市場上出現(xiàn)了許多簡單、快速、標(biāo)準(zhǔn)化的快速檢測產(chǎn)品。例如細(xì)菌用API系統(tǒng)、Enterotube系統(tǒng)和Biolog自動化或半自動化快速檢測系統(tǒng)等。

API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)其代表產(chǎn)品為法國公司生產(chǎn)的API鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)能鑒定700多種微生物；Enterotube快速鑒定系統(tǒng)（腸管系統(tǒng)）是由美國Roche公司生產(chǎn)的一類產(chǎn)品，與API鑒定系統(tǒng)類似;Biolog快速鑒定系統(tǒng)是由生化反應(yīng)部分、檢測設(shè)備和計算機系統(tǒng)組成，可鑒定1140余種微生物，幾乎囊括了目前已知的所有人類致病菌，該系統(tǒng)由美國安普科技中心生產(chǎn);全自動微生物分析系統(tǒng)(AMS)包括生化反應(yīng)及微生物檢測系統(tǒng)和計算機分析系統(tǒng)，是一種運用概率最大近似模型技術(shù)對檢測數(shù)據(jù)進行分析的致病菌分類鑒定技術(shù)；Vitek-AMS自動微生物檢測系統(tǒng)是法國生物梅里埃集團公司生產(chǎn)的，目前是最先進、自動化程度最高的生物鑒定系統(tǒng)之一（周慶德，2005）。

2.2 現(xiàn)代快速檢測技術(shù)及其應(yīng)用 近20年來,隨著基因組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、PCR技術(shù)和現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的不斷發(fā)展與應(yīng)用，微生物鑒別研究取得了突破性的進展，致病微生物的檢測技術(shù)也從細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平發(fā)展到分子學(xué)水平?，F(xiàn)代快速檢測技術(shù)是在分子學(xué)水平上應(yīng)用現(xiàn)代科技手段，通過分析微生物細(xì)胞的組成成分、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因序列等遺傳物質(zhì)對其進行分類鑒別的技術(shù)，其檢測過程主要包括增菌和預(yù)增菌（分離）、免疫或分子鑒定兩大步驟。

目前，采用現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的飼料和食品檢測標(biāo)準(zhǔn)很多。為了便于大家了解，本文根據(jù)方法原理將這些技術(shù)分為以下四大類：免疫識別技術(shù)類、核苷酸測定技術(shù)類、核酸雜交技術(shù)類、細(xì)胞成分分析技術(shù)類。

2.2.1 免疫識別技術(shù)類 利用生物抗原-抗體特異性反應(yīng)的原理，使試樣中的目標(biāo)菌抗原與抗體結(jié)合形成抗原與抗體的復(fù)合物，再通過化學(xué)染色技術(shù)或生化反應(yīng)等方式，達到對致病微生物進行分類鑒定的目的。

2.2.1.1 免疫反應(yīng)色譜法 目標(biāo)菌抗原與濾紙或硝酸纖維素濾膜上經(jīng)過標(biāo)記的抗體進行特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，復(fù)合物在毛細(xì)管作用下沿濾膜移動，當(dāng)遇到被固定在濾膜上樣品檢測區(qū)的特異性抗體后被截留集聚下來，形成一條色帶，據(jù)此來判斷是否存在目標(biāo)菌抗原。在免疫反應(yīng)色譜法中常見的抗體標(biāo)記技術(shù)有化學(xué)發(fā)光劑法和膠體金法。DB34/T 816-2008是應(yīng)用免疫色譜技術(shù)制定的檢測飼料中沙門氏菌的地方標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)方法對配合飼料和單一飼料的檢出限達到了25 g飼料中1個沙門氏菌的水平；SN/T 0184.4-2010是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)建立的食品中李斯特氏菌的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，其檢測靈敏度達到1×106CFU/mL。

2.2.1.2 酶聯(lián)免疫法 將目標(biāo)抗原抗體（一抗）包被在固相容器內(nèi)，加入目標(biāo)菌抗原，使之與抗體（一抗）結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物Ⅰ，洗掉未結(jié)合的其他物質(zhì)；加入特異性酶標(biāo)抗體（二抗），使之與抗原復(fù)合物Ⅰ結(jié)合形成新的抗原抗體復(fù)合物Ⅱ，再次洗滌去除其他成分，加入特定反應(yīng)底物與抗原抗體復(fù)合物Ⅱ反應(yīng)生成熒光化合物或有色化合物；然后檢測其熒光強度或吸收度，通過與參照值進行比較，得到檢測結(jié)果。雷風(fēng)等（2005）將抗體固定在硝酸纖維素薄膜上,制定了飼料中沙門氏菌斑點酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,其沙門氏菌最低檢出限為400個/mL；對100份飼料進行方法比對試驗檢測，沙門氏菌陽性檢出率為43%，與常規(guī)方法38%無顯著差異；伍燕華等（2014）以福爾馬林滅活的鼠傷寒沙門氏菌制備抗沙門氏菌多克隆抗體建立了沙門氏菌雙抗ELISA檢測方法，可以檢測五種典型的沙門氏菌；并在其他雜菌存在的情況下，具有較好的靈敏性和特異性；純培養(yǎng)液的最低檢測限為1×104CFU/mL。

2.2.1.3 免疫磁珠法 免疫磁珠技術(shù)是丹麥學(xué)者1977年提出的，利用外層包裹著單克隆抗體（McAb）的磁性微珠（直徑1～2 μm）與溶液中相應(yīng)的生物大分子進行特異性結(jié)合，用磁鐵收集磁珠，把目標(biāo)大分子或細(xì)菌（蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA）從樣品中快速分離出來，然后再利用生化和血清學(xué)反應(yīng)、熒光技術(shù)或生物發(fā)光技術(shù)進行鑒別分類。SN/T 1059.5-2006用包被了大腸桿菌（E.coli）O157抗體的免疫磁珠分離富集目標(biāo)菌，通過選擇性培養(yǎng)和生化反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化判定目標(biāo)菌的存在。王壯等（2014）將空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽抗體包被在磁性微珠上，制成的免疫磁珠排除了非空腸彎曲菌（包括其他彎曲菌）的干擾，對空腸彎曲菌具有較好的特異性；2 mg免疫磁珠在1mL濃度為2.5×103CFU/mL的空腸彎曲菌菌液中富集并培養(yǎng)出100～300 CFU的目標(biāo)菌落，具有較好的敏感性。寇曉晶等（2019）利用免疫磁珠富集技術(shù)和ATP發(fā)光技術(shù)相結(jié)合建立的快速檢測3種常見食源性致病菌金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的新方法，在明顯縮短預(yù)增菌時間的情況下，利用免疫磁珠的富集作用，取得了與傳統(tǒng)增菌方式相同的檢測結(jié)果。

2.2.1.4 量子點免疫熒光法 量子點又稱納米晶，是由Ⅱ-Ⅵ族元素制成的納米級微粒，其粒徑為1～10 nm。由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成了具有分子特性的分立能級結(jié)構(gòu)，受到激發(fā)后可發(fā)射熒光。

量子點免疫熒光法是一種量子點免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（QD-IHC），又稱量子點免疫熒光細(xì)胞化學(xué)，是根據(jù)抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，用量子點標(biāo)記特異性抗體作為探針，檢測微生物細(xì)胞中抗原性物質(zhì)的一種新技術(shù)。量子點免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)主要有直接法和間接法，間接法因二抗的放大作用而具有更高的敏感性。薛峰和張睿（2013）利用量子點熒光標(biāo)記技術(shù)將目標(biāo)菌特異性抗體制成量子點標(biāo)記抗體，增菌液用免疫磁珠富集目標(biāo)菌株，富集的目標(biāo)菌磁珠與量子點標(biāo)記抗體進行特異性抗原抗體反應(yīng)而結(jié)合在一起；在紫外光激發(fā)下通過熒光顯微鏡觀察結(jié)合物表面的熒光，以判定是否存在目標(biāo)菌；并制定了出口食品中空腸彎曲菌檢測的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。劉曉紅等（2011）將熒光量子點標(biāo)記在炭疽芽孢桿菌抗原上，建立了利用熒光量子點標(biāo)記-免疫分析技術(shù)測定炭疽芽孢桿菌的方法；運用該方法檢測炭疽芽孢桿菌，在1.0×102～1.0×106CFU/mL有良好的線性關(guān)系，而且與同屬其他桿菌混合檢測，具有良好的特異性。Wu和謝冰（2014）利用山羊抗大腸桿菌抗體和兔抗山羊抗體的特異性結(jié)合的特性，對大腸桿菌進行量子點標(biāo)記，建立了用熒光量子點標(biāo)記抗體作為探針檢測化學(xué)藥物中的大腸桿菌的方法；該方法對鹽酸氯米帕明藥物中大腸桿菌的檢測有良好的特異性和回收率,而且檢測用時不到4 h。

2.2.1.5 垂直膜過濾法 本方法是通過垂直過濾的方式，使試樣通過包被有目標(biāo)菌抗體的濾膜，其中的目標(biāo)菌抗原與濾膜上的特異性抗體結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物，通過酶偶合反應(yīng)將抗原抗體復(fù)合物顯色，達到定性鑒別的目的。SN/T 1059.6-2016是將沙門氏菌抗體包被到濾膜上，用于富集檢測食品中沙門氏菌的食品進出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。曹春梅等（2005）利用針對含有O9抗原沙門氏菌的單抗3-47-0和膠體金標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，以微孔濾膜作載體，建立了一種用于臨床醫(yī)學(xué)檢測含有O9抗原沙門氏菌的斑點金滲濾方法；該方法適用于目前已知的含有O9抗原的所有沙門氏菌的檢測，且不受其他沙門氏菌、腸桿菌科和常見革蘭氏陽性菌的干擾，特異性較強；腸炎沙門氏菌的檢測限為6×104CFU/斑點，且用時不到10 min。

2.2.2 核苷酸測定技術(shù)類 利用酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)和DNA限制酶的酶切功能，將目標(biāo)菌的DNA切割成大小、長短不等的核苷酸片段，通過瓊脂糖電泳或其他儀器設(shè)備對其進行基因序列分析測定，然后再通過與陽性樣品或基因圖譜數(shù)據(jù)庫進行比較，從而對致病微生物進行分類鑒定。

2.2.2.1 單菌種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法 樣品經(jīng)過預(yù)增菌和選擇性增菌處理后，其中的目標(biāo)菌抗原在沸水浴條件下，菌體細(xì)胞破裂釋放出基因組DNA，離心使細(xì)胞壁等有形成分沉淀，以上清液為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。GB/T 28642-2012是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)建立的飼料中沙門氏菌快速檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)。 白艷艷等（2008）使用產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特氏菌hlyA基因設(shè)計引物,進行PCR擴增，建立了食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特氏菌PCR檢測方法；該方法的檢測限為1×104CFU/mL，人工添加樣品的檢出限可提高到8 CFU/25 g。

2.2.2.2 多菌種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR法 樣品經(jīng)過預(yù)增菌培養(yǎng)后，增菌液進行沸水浴多目標(biāo)菌DNA提取，根據(jù)多個目標(biāo)菌分別設(shè)計的多對引物，在同一條件下進行DNA擴增；然后用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分離測定。SN/T 1869-2007是利用多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)快速檢測食品中沙門氏菌、志賀氏菌等9種致病菌的出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。蔡亦紅和姚余有（2007）使用腸毒性大腸埃希氏菌的LTB、傷寒沙門氏菌的invA和志賀氏菌ipaH編碼基因設(shè)計出三對不同的引物，建立了3種食源性致病菌多重PCR快速檢測方法；檢測其靈敏度分別為腸毒性大腸埃希氏菌145 pg/mL、傷寒沙門氏菌100 ng/mL、志賀氏菌7 ng/mL。

2.2.2.3 細(xì)菌分子分型MLST法 該方法是在核酸測序的基礎(chǔ)上進行細(xì)菌分型鑒定的分子生物學(xué)分析技術(shù)，目前發(fā)展很快，生物分辨力極高。主要是通過PCR擴增和測序，對450 bp左右的多個管家基因核心片段序列進行分析，比較等位基因的序列類型，從而達到細(xì)菌分類鑒定的目的。所謂管家基因，即所有細(xì)胞中均要穩(wěn)定表達的一類基因，其產(chǎn)物是維持細(xì)胞生命活動所必需的，其基因序列高度保守，且在大多數(shù)情況下持續(xù)表達，又稱看家或持家基因。

SN/T 4525.1-2016是出口食品中沙門氏菌的分子分型MLST測定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)沙門氏菌470 bp的7個管家基因核心片段的核酸序列設(shè)計擴增和測序引物，通過對管家基因片段的擴增和DNA雙向測序，得到完整的等位基因序列，將測序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫進行比對，從而對沙門氏菌進行分子分型鑒定。劉祥等（2015）使用細(xì)菌分子分型MLST技術(shù)對從畜禽新鮮肉類和副產(chǎn)品腸中分離出來的30株艾伯特埃希菌進行分析測定，通過DNASTAR軟件分析和MLST網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)了艾伯特埃希菌菌株。

2.2.2.4 細(xì)菌分子分型SPA基因分型法SPA即葡萄球菌A蛋白，是存在于葡萄球菌細(xì)胞壁的一種表面蛋白，是一種單鏈多肽，具有特異性，絕大多數(shù)金黃色葡萄球菌含有SPA。SPA基因的X區(qū)含有2～15個長度為21～27 bp的重復(fù)序列，由于重復(fù)序列數(shù)目、特征及排列順序不同而具有高度的多態(tài)性，并且具有重復(fù)性好和體內(nèi)外穩(wěn)定的特點。根據(jù)SPA基因序列設(shè)計引物對X區(qū)進行擴增，將擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果與SPA基因分型數(shù)據(jù)庫進行比對分析，從而達到分型鑒定的目的。SN/T 4453-2016進出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)就是根據(jù)金黃色葡萄球菌SPA基因序列的特性，采用SPA基因分型技術(shù)建立的食品中金黃色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型測定的方法標(biāo)準(zhǔn)。李克誠等（2012）采用SPA基因分型技術(shù)對浙江省瑞安地區(qū)采集的100株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的SPA基因分型進行分析測定，通過與數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)瑞安地區(qū)MRSA的SPA分型以t030和t437為主,并發(fā)現(xiàn)了新型菌種t10149。

2.2.2.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與離子對反相色譜（PCR-DHLC）法PCR-DHLC分析技術(shù)是將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)和反相離子色譜儀相結(jié)合對DNA核酸片段進行分離檢測的方法。核酸片段分子中帶負(fù)電荷的磷酸根與離子對緩沖溶液TEAA分子中帶正電荷的氨基互相吸引，緩沖溶液TEAA分子中的三乙基與分析柱中C18表面的烷基相互吸引，用乙腈進行梯度洗脫，使大小不同的核苷酸片段分離；通過樣品吸收峰與陽性對照吸收峰比較，從而達到細(xì)菌鑒別的目的。

SN/T 2641-2010出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)就是利用PCR擴增技術(shù)和DNA限制酶切技術(shù)，將目標(biāo)菌DNA切割成大小不等的核苷酸片段，再用DHPLC進行色譜分離，達到了檢測食品中沙門氏菌、志賀氏菌等30多種致病菌的目的。陳茹等（2012）建立的多重PCR-DHPLC檢測方法能在11種分枝桿菌和23種常見菌中準(zhǔn)確鑒別出結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌，并且具有良好的特異性和靈敏度，檢測靈敏度分別為102～103bp和3.6～6.8 fg DNA模板濃度，而且檢測時間縮短至1 d。

2.2.2.6 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增（LAMP）法LAMP法是2000年由日本學(xué)者提出的，其針對目標(biāo)基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，在60～65℃恒溫條件和鏈置換DNA聚合酶作用下，進行核酸擴增，15～60 min內(nèi)可以達到109～1010倍的擴增效果，而且操作簡單、特異性強。在合成DNA時，從脫氧核糖核苷三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+反應(yīng)，產(chǎn)生大量白色焦磷酸鎂沉淀，不需要儀器設(shè)備，肉眼就能判定檢測結(jié)果。

SN/T 2754.4-2011就是利用環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)，根據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的特異靶序列virR基因設(shè)計兩對特殊內(nèi)外引物，特異性的識別靶序列上6個獨立區(qū)域的原理，制定的出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。王福厚等（2011）建立的沙門氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法，DNA恒溫擴增最佳溫度為63℃，對沙門氏菌具有良好的特異性，檢測限為7～8 CFU／mL，時間短且操作簡便。 梅玲玲等（2011）利用其建立的志賀氏菌環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增(LAMP)快速檢測方法，對32株不同來源和血清型的志賀氏菌進行測定，結(jié)果均為陽性，檢測沙門氏菌、大腸桿菌等139株非志賀氏菌株檢測結(jié)果均為陰性；50批食品的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法、實時熒光PCR方法結(jié)果比較差異不顯著；60℃擴增1 h，志賀氏菌的檢出限為200 CFU/mL，增菌培養(yǎng)8 h后提高至20 CFU/mL。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法優(yōu)點：靈敏度高(比傳統(tǒng)的PCR方法高2～5個數(shù)量級)，反應(yīng)時間短(30～60 min就能完成反應(yīng))，不需要特殊的儀器，操作簡單。缺點：操作過程容易形成氣溶膠污染，假陽性問題比較嚴(yán)重，引物設(shè)計要求比較高，有些基因不適合此法擴增。

2.2.3 核酸雜交技術(shù)類 來源不同的雙鏈DNA在體外經(jīng)加熱處理后，解鏈變性為單鏈核苷酸，將它們在適當(dāng)條件下混合在一起，經(jīng)過退火處理，當(dāng)兩條來源不同，并且存在互補或部分互補的堿基序列的單鏈核苷酸相遇時，按照堿基互補配對的原則，就可能復(fù)性形成新的雜合體DNA。通過測定雜合體DNA分子中的雜交百分率，就能判定兩個物種之間親緣關(guān)系的疏密程度，從而達到定性鑒別的目的。

2.2.3.1 實時熒光PCR方法 該方法是在DNA擴增反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著擴增循環(huán)的增加，擴增產(chǎn)物以指數(shù)形式增長，熒光信號不斷增強，利用熒光信號的累積作用實時監(jiān)控整個DNA擴增過程，并根據(jù)測定的擴增產(chǎn)物增長曲線的形狀和熒光強度進行待測菌的判定。

SN/T 2425-2010是進出口食品中霍亂弧菌快速檢測和鑒定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)采用熒光探針（Taq Man）技術(shù)，根據(jù)霍亂弧菌溶血素基因、編碼O抗原的rfb基因，分別設(shè)計了三對各自僅在霍亂弧菌的溶血素基因、rfb基因間保守的特異性引物和三條特異性的熒光雙標(biāo)記探針，實現(xiàn)了對食品中霍亂弧菌的檢測和鑒定。張娜娜等（2019）運用其建立的實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，對市場出售的乳酸飲料樣品進行嗜酸乳桿菌檢測，結(jié)果有較好的特異性，絕對靈敏度3 pg，相對靈敏度103CFU/mL。

2.2.3.2 基因芯片法 核酸探針按照有序的行列格式點制在固相支持物上，通過特定溫度下與相應(yīng)樣品進行雜交而用于樣品中核酸種類定性分析。以試樣增菌液提取的DNA作為模板進行多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物與載有目標(biāo)菌核酸探針的基因芯片進行雜交，雜交后用掃描儀對的芯片進行掃描，通過信號值計算結(jié)果進行判定。

SN/T 2651-2010出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)就是利用基因芯片技術(shù)，針對沙門氏菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（O157：H7）5種目標(biāo)菌的保守基因核酸片段設(shè)計引物，實現(xiàn)了檢測肉及肉制品中沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌和大腸桿菌（O157：H7）的目的。祝儒剛等（2012）利用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與基因芯片技術(shù)對肉及肉制品中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等致病菌進行檢測，其建立的基因芯片檢測方法可以同時檢測上述5種致病菌，且具有良好的特異性，檢測限2 pg。陳昱等（2009）應(yīng)用多重PCR和基因芯片技術(shù)對認(rèn)為污染食品樣品中的志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌（O157）進行檢測，同時與傳統(tǒng)方法進行比對，結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致，檢測限為50 CFU/mL，且特異性強，4~5 h內(nèi)可以完成檢測。

2.2.3.3 微滴數(shù)字PCR法 試樣溶液經(jīng)過微滴化處理,形成成千上萬個納升級的微滴反應(yīng)體系，每個反應(yīng)體系或含或不含待測的核酸靶分子；經(jīng)PCR擴增、特異性探針雜交后，逐個對微滴進行檢測，檢測到熒光信號的微滴設(shè)為1，為測到熒光信號的設(shè)為0，根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的個數(shù)與比例就能得到靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度，從而對目標(biāo)菌進行測定。

趙新等（2017）利用其建立的沙門氏菌微滴數(shù)字PCR的快速定量檢測方法與傳統(tǒng)國標(biāo)培養(yǎng)法進行比對試驗，結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致，具有較好的特異性，檢測 限為1×102CFU/mL。董蓮華等（2015）利用其建立的微滴數(shù)字PCR檢測方法，對豬肉、牛肉、雞肉樣品中的大腸桿菌（O157∶H7）進行檢測，O157∶H7基因組DNA反應(yīng)液濃度在4～1.25×105bp/20 μL內(nèi)線性最佳，方法的定量限為4 bp/20 μL，檢出限為3 bp/20 μL，而且具有良好的特異性。

2.2.4 細(xì)胞成分分析技術(shù)類 細(xì)胞成分分析主要是通過現(xiàn)代化學(xué)分析技術(shù)氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜等分析儀器設(shè)備對微生物細(xì)胞表面特征性蛋白質(zhì)進行分析，從而對致病微生物進行鑒別的技術(shù)。

基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）法是細(xì)菌全細(xì)胞的快速檢測技術(shù)，主要依據(jù)細(xì)菌表面特征性蛋白的分子量信息，對細(xì)菌進行分類鑒定。將分離的目標(biāo)菌菌落試樣與適量的基質(zhì)溶液加載在樣品板上，使溶劑揮發(fā)，形成試樣與基質(zhì)的共結(jié)晶，利用激光輻射共結(jié)晶，基質(zhì)分子吸收能量與樣品解吸附，并使樣品電離成離子態(tài)，通過飛行時間檢測器，將不同質(zhì)荷比的離子分開，形成細(xì)菌特異性的質(zhì)譜圖。將待測目標(biāo)菌質(zhì)譜圖在細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中進行查找和比較，從而確定細(xì)菌的種屬，達到微生物鑒定的目的。

SN/T 3872-2014是利用MALDI-TOF MS技術(shù)制定出口食品中沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌四種致病菌快速檢測的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。王衛(wèi)萍等（2015）利用MALDITOF MS方法對臨床標(biāo)本中分離出來的1061株非重復(fù)細(xì)菌進行測序分析，并與Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的鑒定結(jié)果進行比較，結(jié)果有99.7%的菌株鑒定到屬，95.8%的菌株鑒定到種，只有0.3%的菌株未能給出鑒定結(jié)果。

3 存在的問題與未來展望

目前，傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代技術(shù)在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中同時并存，傳統(tǒng)的鑒別技術(shù)具有不可替代的地位，現(xiàn)代技術(shù)顯示了其簡便、快捷、高效的優(yōu)勢。二者同時存在各自的不足，有待進一步發(fā)展和完善。

3.1 傳統(tǒng)檢測方法的缺點 傳統(tǒng)檢測技術(shù)的缺點是操作繁瑣復(fù)雜、耗時較長、效率低，批量檢測受到限制，不符合現(xiàn)代化大生產(chǎn)和現(xiàn)代生活快節(jié)奏的要求。以沙門氏菌檢測為例，按照傳統(tǒng)國標(biāo)方法檢測，試驗需要準(zhǔn)備13種培養(yǎng)基，并需制成各種平板、斜面、試管等，需要各種試劑30多種，準(zhǔn)備這些試驗材料時間至少要花費2個工作日；試驗過程增菌、分離、生化培養(yǎng)操作時間大約130 h，相當(dāng)于6 d的時間；生化試驗10個，血清學(xué)試驗3個，各種操作、觀察累計也要2個工作日；這樣一個樣品檢測需要至少10 d，并且需要連續(xù)工作才能完成（GB/T 13091-2018）。同時，試驗對檢測人員的素質(zhì)和技術(shù)水平要求很高，需要豐富的實踐經(jīng)驗，普通檢測人員難以勝任。

3.2 現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的問題和思考 現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的最大不足是對陽性結(jié)果不能做出準(zhǔn)確判定，需要用傳統(tǒng)方法進行確認(rèn)，不能滿足快速檢測的需要。免疫識別技術(shù)和核酸測定技術(shù)一般只能進行單個樣品和單個菌株的檢測。適用于生產(chǎn)單一產(chǎn)品企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量控制，但對于檢驗檢測機構(gòu)的多菌種、大批量檢測和快速檢測，明顯不能滿足需要。在目前的現(xiàn)代檢測技術(shù)中，預(yù)增菌和選擇性增菌是致病微生物檢測不可逾越的重要步驟，也是制約檢測時效的關(guān)鍵瓶頸。一般增菌培養(yǎng)時間在18～24 h，甚至48 h或更長。在免疫識別技術(shù)中，抗原-抗體反應(yīng)還有一種捕獲和富集目標(biāo)菌的作用。通過增加稱樣量，擴大試料中致病微生物的數(shù)量,利用免疫磁珠或濾膜技術(shù)捕獲和富集目標(biāo)菌，替代傳統(tǒng)的預(yù)增菌和選擇性增菌過程，突破增菌培養(yǎng)的時間限制還需進一步研究。

3.3 未來展望 利用核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)實現(xiàn)多菌種、大通量檢測，充分利用基因技術(shù)提高傳統(tǒng)微生物鑒別速度和效率，利用免疫捕獲和富集技術(shù)突破現(xiàn)有增菌培養(yǎng)基的時間限制，實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高效的檢測目標(biāo)。 芯片生物傳感器技術(shù)也是飼料和食品中的致病菌檢測研究的方向之一。通過研究和技術(shù)革新，提高生物傳感器的選擇性、生物響應(yīng)的穩(wěn)定性，以及信號檢測器和轉(zhuǎn)換器的使用壽命，并使之與計算機技術(shù)緊密結(jié)合，形成檢測、數(shù)據(jù)采集與處理自動化，進一步提高檢測工作效率?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)微生物鑒定技術(shù)和基因測序技術(shù)有可能突破傳統(tǒng)鑒定方法的束縛，成為今后飼料和食品中致病微生物檢測技術(shù)研究發(fā)展的方向。由于現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的不斷應(yīng)用，為了適應(yīng)新形勢的需要，應(yīng)盡快建立國家細(xì)菌鑒定指紋質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫、分子分型數(shù)據(jù)庫、基因序列圖譜數(shù)據(jù)庫等，以滿足目前新技術(shù)發(fā)展的需要。