飼糧中添加枯草芽孢代謝物對肉雞生長性能及腸道健康的影響

李文婭， 彭 展， 郭柑彤， 何 濤， 劉揚科， 吳金梅

（1.中農穎泰林州生物科園有限公司，河南 林州 456550；2.河南牧業(yè)經濟學院動物醫(yī)藥學院，河南 鄭州 450046）

抗生素在畜牧養(yǎng)殖中不僅用于治療疾病，而且用于預防，并作為促生長劑廣泛使用，導致耐藥菌及殘留的抗生素通過肉類攝入和處理傳播給人類，食品安全問題成為社會關注的焦點（Tiseo等，2020）。2021年12月農業(yè)農村部頒布《“十四五”全國畜牧獸醫(yī)行業(yè)發(fā)展規(guī)劃》，明確提出加快研發(fā)推廣抗生素替代品的重點任務，因此，開發(fā)新型飼料添加劑替代飼用抗生素成為研究熱點。

抗菌肽（AMPs）是一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽物質，因具有熱穩(wěn)定性高、水溶性好、相對分子質量小且不易產生耐藥性等優(yōu)點逐步成為抗生素替代品的選擇之一。自1980年瑞典科學家G.Boman等在天蠶蛹體內發(fā)現抗菌多肽并命名為天蠶素后，人們相繼從細菌、真菌、動植物乃至人體中均發(fā)現并分離獲得具有抗菌活性的多肽，其中已有70多種抗菌多肽的結構被測定（甄陽光，2018；尚田田等，2013）。目前已知抗菌肽的作用機制與細胞膜的結構和性質密切相關，因AMPs帶正電荷，而細菌細胞膜上的LTA、TA、LPS及LPG帶負電荷，二者以靜電作用相互結合，然后AMPs的疏水端嵌入細菌磷脂雙分子層中，擾亂細菌雙分子層中脂質和蛋白質等組分原有的排列順序，形成“桶板”“地毯”和“環(huán)形孔”等模型的跨膜通道，最終導致細菌胞內物質外漏而死亡（甄陽光，2018；Chan等，2006）。而宿主正常細胞是真核細胞，其主要由鞘磷脂、中性磷脂和膽固醇等不帶電荷的物質組成，而且磷脂雙分子層更加穩(wěn)固，不易形成膜通道，因此不能與帶正電荷的AMPs結合（Findlay等，2010）。這也說明了AMPs作為飼料添加劑的安全性。吳東（2020）等研究表明，在飼糧中添加不同比例的抗菌肽對肉雞的生長性能及腸道菌群等指標都有一定程度的改善。郭森（2016）等研究表明，抗菌肽在飼糧中使用能顯著增加愛拔益加（AA）肉雞的生長性能、改善腸道菌群等。

本試驗中枯草芽孢桿菌代謝物是由枯草芽孢桿菌YT168-6表達的含有37個氨基酸殘基的抗菌肽，故命名為枯草三十七肽?？咕牟粌H結構穩(wěn)定，而且對高溫、酸堿、胃蛋白酶、胰蛋白酶具有良好的抵抗力（Garcia等，2014）。但關于抗菌肽對肉雞腸道健康的報道甚少，因此本試驗在飼糧中添加枯草芽孢代謝物，研究其對肉雞生長性能、腸道組織形態(tài)及盲腸微生物多樣性的影響，從而為指導飼料企業(yè)使用最優(yōu)的無抗方案提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 枯草芽孢代謝物（枯草三十七肽）由中農穎泰林州生物科園有限公司提供?？莶菅挎邨U菌活菌數≥2.0×1010cfu/g，為市場購買。

1.2 試驗設計 選取1日齡體重相近[（37.10±0.10）g]的快大型白羽肉雞612只，隨機分為3個處理組，每組6個重復，每個重復34羽肉雞。對照組（CG）在基礎飼糧中添加200 g/t枯草芽孢桿菌，試驗組1（EG1）、試驗組2（EG2）分別在基礎飼糧中添加150、200 g/t枯草芽孢代謝物（枯草三十七肽）。采用玉米-豆粕型基礎飼糧，其組成參照《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T33-2004）配制，具體原料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 飼養(yǎng)管理 本試驗在遼寧省鞍山市海城市某肉雞養(yǎng)殖小區(qū)進行，采用三層立體籠養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)17只雞。飼養(yǎng)過程中安排專人負責，溫濕度、光照、通風、免疫、消毒等按照試驗場常規(guī)管理進行，藥物預防與治療均按照試驗場要求進行。試驗期間，進行健康觀察，做好記錄，試驗期42 d。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能指標測定 在試驗開始和結束時稱量并記錄各處理組肉雞的體重，統(tǒng)計試驗期內各組肉雞的采食量，計算出欄均重、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料肉比（FCR）及歐洲效益指數（EPI）。

1.4.2 腸道組織形態(tài)學觀察 在42 d時，從每個重復抽取1只體重相近的肉雞，處死解剖后，剪取3~5 cm的空腸、回腸和盲腸腸段，放入10%中性福爾馬林溶液充分固定后，橫向采集樣品管腔結構約0.5 cm長的組織放入包埋盒中繼續(xù)固定24 h。將固定完全的組織進行脫水透明、浸蠟包埋、切片烤片后，用蘇木精-伊紅（H&E）染色法染色，晾干后的切片置于Motic數字切片掃描儀下進行掃描拼接，生成一張全視野的數字化切片后，使用軟件DSAssistant Lite進行組織學觀察，選擇合適的物鏡倍數采集圖片，再使用軟件Motic Images Plus 3.0分別測量每張圖片中的腸道絨毛高度和隱窩深度，測量時每個樣品選取3個視野，每個視野內至少3個數據，并計算腸絨毛高度與隱窩深度的比值（V/C）。

1.4.3 盲腸微生物指標測定 在42 d時，從每個重復抽取1只體重相近的肉雞，處死后迅速解剖，分離出盲腸，立即在無菌條件下將其內食糜取出放入無菌離心管，液氮保存。

1.4.3.1 DNA提取和16S rRNA測序 將盲腸內容物用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]按照說明書進行總基因組DNA的提取，再用酶標儀進行濃度檢測，用1.8%的瓊脂糖對其完整性進行電泳檢測。用V338F和V806R通用引物對基因組總DNA的16S rRNA的V3~V4區(qū)域進行PCR擴增，擴增產物用1.8%瓊脂凝膠電泳檢測，混勻后用Monarch DNA Gel Extraction（北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司）進行純化回收，使用TruePrepRDNA Library Prep Kit V2（南京諾唯贊生物科技有限公司）進行文庫構建，建好的文庫通過Qseq-400方法進行質檢，質檢合格的文庫用Illumina Novaseq 6000進行測序。

1.4.3.2 測序結果處理及分析 基于Illumina Novaseq測序平臺，構建以雙末端測序的方法對小片段文庫進行測序。通過對Reads拼接過濾，聚類或去噪，豐度分析及物種注釋等操作，從而揭示樣品物種的構成。再進行α多樣性分析、β多樣性分析等，從而挖掘樣品之間的差異。

1.5 數據統(tǒng)計分析 用Excel 2019對試驗數據進行初步整理，采用SPSS 25.0軟件對試驗結果進行方差分析，方差分析用one-way ANOVA進行，組間多重比較用Duncan’s法進行。試驗結果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 各處理對肉雞生長性能的影響 由表2可知，EG1的出欄均重和ADG與CG之間沒有顯著差異（P>0.05）；EG2的出欄均重和ADG顯著高于CG（P<0.05）。3組之間ADFI和FCR差異不顯著（P>0.05）。CG和EG1的EPI無顯著差異（P>0.05），且均顯著低于EG2（P<0.05）。

表2 各處理對肉雞生長性能的影響

2.2 各處理對肉雞腸道組織形態(tài)的影響 由表3可以看出，與CG相比，EG1和EG2的空腸絨毛高度顯著提高（P<0.05），回腸和盲腸的絨毛高度無顯著性差異（P>0.05），空腸、回腸和盲腸的隱窩深度差異不顯著（P>0.05）。EG1的空腸、回腸和盲腸V/C與CG相比，均有不同程度的提高，分別提高了17.01%、9.69%和59.19%（P>0.05）；EG2的空腸V/C顯著高于CG（P<0.05），回腸和盲腸分別提高了18.64%和55.14%（P>0.05）。

表3 各處理對肉雞腸道組織形態(tài)的影響

2.3 各處理對肉雞盲腸微生物組成及多樣性的影響

2.3.1 門水平 從圖1可以看出，42 d肉雞盲腸微生物門水平相對豐度前10位的微生物，以厚壁菌門（Firmicutes）為主，其次分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、變 形 菌 門（Proteobacteria）、藍 藻 菌 門（Cyanobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、放線菌門 （Actinobacteria）等，均以Firmicutes和Bacteroidetes為優(yōu)勢菌門，占總數的80%以上。

圖1 42 d肉雞門水平上前10位盲腸微生物相對豐度柱形圖

2.3.2 科水平 由圖2可以看出，42 d肉雞盲腸微生物科水平相對豐度前15位的微生物，包含了瘤胃球菌科 （Ruminococcaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、理 研 菌 科（Rikenellaceae）、苜蓿 科（Christensenellaceae）、乳 酸 細 菌 科（Lactobacillaceae）、 梭 菌 目 （Clostridiales_vadinBB60_group）、未分類嗜氣性胃腺桿菌目（uncultured_bacterium_o_Gastranaerophilales）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和擬桿菌科（Bacteroidaceae）等。與CG相比，EG1和EG2的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae相對豐度均明顯增加，且EG1和EG2的盲腸微生物在科水平上的分布更相似。

圖2 42 d肉雞科水平上前15位盲腸微生物相對豐度柱形圖

2.3.3 屬水平 從圖3可以看出，42 d肉雞盲腸微生物屬水平相對豐度前25位的微生物，其中主要是瘤胃球菌科（Ruminococcaceae_UCG-014）、鞘脂單胞菌屬（Subdoligranulum）、未分類毛螺菌科 （uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae）、擬桿菌屬（Alistipes）、苜蓿科（Christensenellaceae_R-7_group）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等，占群落總數的85%以上。與CG相比，EG1的Ruminococcaceae_UCG -014、Subdoligranulum、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和Eubacterium coprostanoligenes group的相對豐度增加，Alistipes和uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae相對豐 度 降 低，EG2的Subdoligranulum、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和Eubacterium coprostanoligenes group相對豐度增加，Lactobacillus和Faecalibacterium相 對 豐 度 降 低。EG1和EG2對 比 得 出，EG1中Ruminococcaceae_UCG-014，Christensenellaceae_R-7_group和Lactobacillus相對豐度高于EG2，而Subdoligranulum和Alistipes的相對豐度相反。

圖3 42 d肉雞屬水平上前30位盲腸微生物相對豐度柱形圖

2.3.4 α多樣性 由表4可以看出，三個處理組42 d肉 雞 盲 腸 微 生 物 的ACE、Chao1、Simpson、Shannon指數統(tǒng)計數據，展示了CG和EG的α多樣性結果。其中，前兩個指標衡量物種豐度，后兩個指標衡量物種多樣性（Grice等，2009）。結果顯示，各組肉雞的ACE、Chao1指數差異不顯著（P>0.05），說明三組物種豐度差異不顯著，三組的Shannon指數差異不顯著（P>0.05），而EG1的Simpson指數顯著高于CG（P<0.05），EG2與其他兩組無顯著性差異（P>0.05），說明EG1的物種多樣性顯著高于CG，而EG2與CG物種多樣性差異不顯著。

表4 各處理的42 d肉雞盲腸微生物α多樣性分析

2.3.5 β多樣性 圖4是42 d肉雞盲腸微生物的PCoA聚類圈分析圖，屬于β多樣性指標之一，用來研究樣本群落組成的相似性或相異性（Wang等，2012）。從圖中可以看出，三個處理組的微生物群落有部分相似，且EG1和EG2的物種組成和群落結構相似度更高。

圖4 樣品PCoA聚類圈分析圖

3 討論

3.1 枯草三十七肽對肉雞生長性能的影響 生長性能是畜禽養(yǎng)殖中重要的指標之一，不僅與經濟價值有密切關系，而且是相關添加劑是否能替代抗生素的評價指標。歐洲效益指數（EPI）是一個綜合評價生長性能的指標，跟肉雞體重、成活率、料肉比及出欄日齡均有聯系，指數越大，說明盈利越高。研究表明，抗菌肽有提高動物生長性能的作用。孫全友（2014）等研究表明，飼糧中添加200 g/t抗菌肽能顯著降低肉雞料肉比，顯著提高體重。苗旭（2020）等試驗結果也表明，飼糧中添加抗菌肽能提高肉雞生長性能，降低腹瀉率。本試驗結果顯示，飼糧中添加枯草三十七肽能顯著提高出欄均重、ADG和EPI，提高肉雞生長性能，與上述報道結果一致。

3.2 枯草三十七肽對肉雞腸道組織形態(tài)的影響腸道形態(tài)可以衡量機體腸道的健康狀況（Csernus等，2020），其絨毛高度直接決定機體對營養(yǎng)物質的吸收能力，隱窩深度反映細胞生成率，隱窩深度增加則提示腸道對于營養(yǎng)物質的吸收能力減弱。絨毛高度/隱窩深度（V/C）則綜合反映了腸道功能狀態(tài)，比值上升，表示黏膜改善，吸收能力增強，動物生長加快（Chamorro等，2019）。張凱瑛（2021）在飼糧中添加300 mg/kg或500 mg/kg抗菌肽，結果顯著提高了42 d肉雞小腸各腸段絨毛高度，顯著降低回腸的隱窩深度，顯著提高了空腸和回腸的V/C。王建（2019）等研究結果顯示，飼糧中添加抗菌肽Api-PR19能顯著提高21 d肉雞的空腸和42 d十二指腸的絨毛高度和V/C。本試驗結果表明，飼糧中添加枯草三十七肽能顯著提高空腸絨毛高度和V/C，對回腸和盲腸的絨毛高度和V/C也有不同程度的提高。這一結果說明飼糧中添加枯草三十七肽在一定程度上改善了肉雞腸道形態(tài)的發(fā)育，從而促進肉雞健康生長。

3.3 枯草三十七肽對肉雞盲腸微生物組成及多樣性的影響 腸道微生物菌群的平衡能夠保證畜禽的健康生長，尤其是畜禽的盲腸內存在大量微生物，與畜禽的免疫、消化吸收等有著密切的聯系。研究表明，益生菌和抗菌肽均可抑制有害菌，增加有益菌數量，改善腸道微生物環(huán)境（易中華等，2005）。白建（2014）等研究表明，抗菌肽降低了盲腸內大腸桿菌的數量，增加了乳酸菌的數量，且與海藻粉存在協(xié)同效應。研究顯示，肉雞門水平的優(yōu)勢菌群是Firmicutes和Bacteroidetes，占微生物群落總數的80%以上，其在能量的產生和代謝中起著重要作用（Pandit等，2018；Oakley等，2014）。在本研究中，試驗組和兩個對照組的肉雞盲腸微生物在門水平上的相對豐度沒有顯著差異，群落的優(yōu)勢菌門是Firmicutes，與報道一致。在本研究中，與對照組相比，試驗組的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae相對豐度明顯升高，二者含有產短鏈脂肪酸（SCFAs）的科，SCFAs抑制腸道致病菌生長繁殖的方式是通過影響腸道酸堿度，從而為肉雞良好的生長性能提供了前提，其中，Ruminococcaceae可能與試驗組肉雞平均日增重的提高有關（Zeng等，2019；Nava等，2011）。試驗組的Blautia相對豐度高于對照組，Blautia能降解不同類型的碳酸化合物，產生乙酸、乳酸等代謝產物，其含量的增加與宿主腸道健康有關（Abaidullah等，2019；Yang等，2016；Liu等，2008）。

腸道微生物多樣性影響動物消化吸收，常用α多樣性和β多樣性表示。其中，α多樣性反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性（Grice等，2009），β多樣性比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度，可通過多種指標反映，PCoA分析是一種非約束性的數據降維分析方法，可用來研究樣本群落組成的相似性或相異性（Gower等，1966）。本試驗結果顯示，飼糧中添加枯草三十七肽能顯著提高盲腸α多樣性的物種多樣性，與朱隨亮（2021）等研究結果一致。

4 結論

飼糧中添加枯草三十七肽可顯著增加肉雞出欄均重、平均日增重和歐洲效益指數，提高腸道絨毛高度和絨隱比，改善盲腸微生物多樣性，增強肉雞的消化吸收能力，從而提高肉雞的生長性能，改善腸道健康。