青貯蘆葦益生菌添加劑配方的篩選

熊志達(dá)， 周鑫鑫， 楊書(shū)敏， 王金碩， 肖運(yùn)才， 石德時(shí)

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070）

蘆葦屬多年生根莖型的高大禾本科植物，廣泛分布于濕地生態(tài)系統(tǒng)，蘆葦根莖發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)旺盛，再生速度快，具有極強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境的能力，我國(guó)現(xiàn)有14個(gè)蘆葦?shù)闹鳟a(chǎn)區(qū)，蘆葦面積可達(dá)130萬(wàn)公頃以上（朱作華，2017；李建國(guó)，2004）。春夏兩季蘆葦?shù)臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有很高的粗蛋白質(zhì)含量。鮮嫩的莖葉對(duì)于反芻動(dòng)物具有較好的適口性，因此春夏兩季的蘆葦可作為反芻動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)青綠飼料（項(xiàng)迪平，2021）。

蘆葦中有較高的纖維素含量，生長(zhǎng)期蘆葦中中性洗滌纖維（NDF）含量可達(dá)到71.96%~72.81%DM，酸性洗滌纖維（ADF）含量約為37.94%~39.50% DM（康翠翠，2016），每年僅有少部分的蘆葦用于反芻動(dòng)物飼喂，部分蘆葦用在造紙、編席和制作掃帚等經(jīng)濟(jì)用途中，大部分蘆葦則被廢棄。因此，開(kāi)展對(duì)蘆葦保鮮和體外降解纖維素含量的研究，對(duì)于合理開(kāi)發(fā)利用蘆葦資源，緩解決我國(guó)反芻動(dòng)物飼料缺口問(wèn)題和發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。

根據(jù)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)飼料缺口亟待解決的現(xiàn)狀，以及蘆葦作為青貯飼料利用的可行性，本研究利用從水牛瘤胃中篩選出來(lái)的兩株產(chǎn)纖維素酶的益生菌：副地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）SN-6和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）D1，與其他適宜飼料青貯的益生菌復(fù)配，期望通過(guò)乳酸菌保存蘆葦中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，產(chǎn)纖維素酶的益生菌可以有效地降低蘆葦中的纖維素含量，從而達(dá)到蘆葦保鮮和體外降解部分纖維素的目的，并根據(jù)青貯發(fā)酵的結(jié)果，獲得最適宜蘆葦青貯的益生菌添加劑配方。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 蘆葦：收割處于生長(zhǎng)前期距離根部40 cm以上的全株蘆葦。菌株：副地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）SN-6（本研究團(tuán)隊(duì)從水牛瘤胃中分離得到，菌粉活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）D1（本研究團(tuán)隊(duì)從水牛瘤胃中分離得到，菌粉活菌數(shù)7.0×109CFU/g）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）LB101（購(gòu)于微康益生菌蘇州股份有限公司，菌粉活菌數(shù)為1×1010CFU/g）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LP194（購(gòu)于微康益生菌蘇州股份有限公司，菌粉活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g）、象草發(fā)酵劑[采購(gòu)于華大瑞爾科技有限公司，內(nèi)含有乳酸片球菌 （Pediococcus lactis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TL和 酵 母 菌（Yeast）等益生菌，菌粉活菌數(shù)為1.0×109CFU/g）]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同生長(zhǎng)階段蘆葦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化2020年6月5日~8月27日間，不定期收割處于生長(zhǎng)期各階段的蘆葦，通過(guò)檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)成分，確定最佳的蘆葦收割時(shí)間。將樣品65℃烘干后，檢測(cè)生長(zhǎng)期不同階段蘆葦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化。

1.2.2 蘆葦青貯試驗(yàn) 收割處于生長(zhǎng)前期的蘆葦（2021.06.04），將其粉碎至1~3 cm長(zhǎng)。蘆葦鮮樣中含水量為（65±0.52）%，額外添加水（4±0.50）%，使總水量控制在70.0%左右。此外，菌添加總量設(shè)置為3×109CFU/kg，按照表1菌劑添加量，將菌劑添加入蘆葦中，并根據(jù)蘆葦鮮重額外添加2%糖蜜拌勻，每個(gè)密封袋中填裝1 kg蘆葦，用真空打包機(jī)將密封袋抽至真空形成完全封閉的空間，各組設(shè)置3個(gè)平行處理，同一菌添加劑組放入同一個(gè)帶蓋的密封桶中。在桶上記錄日期與菌添加情況，放置陰涼處青貯20 d后，開(kāi)桶檢測(cè)各組青貯樣品的發(fā)酵品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

表1 各組菌添加量

1.2.3 蘆葦青貯樣品品質(zhì)測(cè)定 氨態(tài)氮的含量按照T/NAIA 001—2020的方法測(cè)定。乙酸、丙酸、丁酸的含量按照GB/T 22145—2008的方法測(cè)定。pH與總酸的含量按照GB/T 12456-2008（3）的方法測(cè)定。乳酸的含量按照GB/T 5009.157—2016的方法測(cè)定。粗蛋白質(zhì)的含量按照GB/T 6432—2018的方法測(cè)定。干物質(zhì)的含量按照GB/T 6435—2014的方法測(cè)定。粗灰分的含量按照GB/T 6438—2007的方法測(cè)定。中性及酸性洗滌纖維的含量按照GB/T 20806—2006的方法測(cè)定。毒素的含量使用黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)卡、嘔吐毒素快速檢測(cè)卡、玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)卡測(cè)定，檢測(cè)卡均購(gòu)于武漢觀銳生物科技有限公司。

1.3 青貯飼料的品質(zhì)評(píng)定

1.3.1 感官評(píng)定 青貯飼料的氣味、色澤和結(jié)構(gòu)按照德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)（DLG）評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分（張養(yǎng)東，2016），將青貯得分分為1級(jí)優(yōu)良（16~20分）、2級(jí)尚好（10~15分）、3級(jí)中等（5~9分）、4級(jí)腐?。?~4分）四個(gè)等級(jí)。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)評(píng)定 青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)按照弗氏評(píng)分法（德國(guó)科學(xué)家Flieg在1938年提出的評(píng)定方法）進(jìn)行評(píng)定（英華，2010）。按照得分情況將青貯蘆葦分成優(yōu)（81~100分）、良（61~80分）、可（41~60分）、中（21~40分）和劣（0~20分）五個(gè)等級(jí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 處于生長(zhǎng)期不同階段的蘆葦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化根據(jù)圖1可知，在蘆葦生長(zhǎng)過(guò)程中，隨著蘆葦老化，水分不斷降低（2020.07.17所測(cè)蘆葦樣本水分含量達(dá)到71.92%，可能與當(dāng)時(shí)雨水較多有關(guān)）；灰分先升高后降低；粗蛋白質(zhì)先升高后降低，最高可達(dá)15.68%。綜合生長(zhǎng)期蘆葦水分和蛋白質(zhì)含量變化，結(jié)合實(shí)地觀察蘆葦生長(zhǎng)情況，得出6~7月份是收割蘆葦進(jìn)行青貯發(fā)酵的最佳時(shí)期。

圖1 2020年6月5日-2020年8月27日蘆葦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化

2.2 蘆葦青貯試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 蘆葦鮮樣營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 表2為處于生長(zhǎng)前期蘆葦樣品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，此時(shí)的蘆葦鮮樣中有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，粗蛋白質(zhì)含量為15.38%；纖維素含量較高，NDF約為71.0%，ADF含量約為40.09%。

表2 青貯前蘆葦樣品營(yíng)養(yǎng)成分

2.2.2 蘆葦青貯感官評(píng)價(jià) 在為期20 d蘆葦青貯試驗(yàn)結(jié)束后，將所有桶中的青貯袋取出并打開(kāi)。發(fā)現(xiàn)打開(kāi)的青貯袋內(nèi)散發(fā)著蘆葦青貯后特有的酸香味；青貯后的蘆葦松散不干燥，濕潤(rùn)不黏手，用力擠壓青貯蘆葦僅有少量液體從指縫間滲出；除了Ctrl組發(fā)酵后莖葉結(jié)構(gòu)保存得較差外，益生菌添加劑各組的莖葉結(jié)構(gòu)保存均為良好（表3）。青貯后的蘆葦飼料較新鮮蘆葦略有變色，呈黃綠色，烘干后呈淡褐色。

表3 青貯蘆葦?shù)母泄僭u(píng)價(jià)

2.2.3 蘆葦青貯品質(zhì)評(píng)價(jià) 由表4可知，各組的pH均屬于優(yōu)良發(fā)酵的水平（pH=3.8~4.2）。菌添加劑各組TA含量極顯著高于Ctrl組（P<0.01），XS64組TA含量最高，達(dá)到5.84 g/kg DM，其LA含量也顯著高于其他組（P<0.05），達(dá)到3.22 g/kg DM。BA含量是飼料青貯過(guò)程中是否發(fā)生腐敗的重要標(biāo)志之一，優(yōu)質(zhì)的青貯發(fā)酵飼料中，BA的含量應(yīng)小于1% DM并無(wú)限接近于0，Ctrl組中BA含量為0.14% DM，復(fù)合益生菌添加劑各組BA含量均小于0.10% DM。AN的含量標(biāo)志著飼料青貯過(guò)程中發(fā)生腐敗的程度，青貯飼料中AN含量越低則說(shuō)明飼料中蛋白質(zhì)腐敗程度越低。此次青貯試驗(yàn)中各組AN含量均小于0.1% DM。

表4 青貯蘆葦?shù)钠焚|(zhì)

2.2.4 蘆葦青貯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)評(píng)價(jià) 由表5可知，XS64組青貯后DM含量高于其他組，可達(dá)到35.88% DM（P<0.05）。XS55的CP含 量 為12.35% DM，XS64的CP含量為12.60% DM，XSD的CP含 量 為12.67% DM，BZSD的CP含 量 為12.73% DM，Ctrl的CP含量為13.83% DM，表明通過(guò)青貯可有效地保存蘆葦中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

表5 青貯蘆葦?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

此外，添加降解纖維素分解菌（SN-6、D1）可以有效地降低蘆葦中NDF含量。其中XS64降低NDF含量最多，較Ctrl組降低了4.74%（P<0.01）。其他添加產(chǎn)纖維素降解酶益生菌的各組NDF含量較Ctrl組均有下降的趨勢(shì)：XS55組NDF含 量 較Ctrl組 降 低2.93%（P<0.05）；XSD組NDF含量較Ctrl組降低約為2.83%（P<0.05）；BZSD組NDF含量較Ctrl組降低約為1.79%（P<0.05）。各組均無(wú)顯著降低ADF的效果。

2.2.5 青貯蘆葦?shù)陌l(fā)酵品質(zhì) 根據(jù)表6可知，XS55組LA/TA的含量最高，為56.26%；XS65中LA/TA含量為55.22%；XSD組LA/TA為52.57%；BZSD組LA/TA為45.22%；而直接青貯Ctrl組中LA/TA含量?jī)H為7.07%。XS55組BA/TA含量為0.04%；XS64組BA/TA含量為0.40%；XSD組BA/TA含量為0.10%；BZSD組BA/TA含量為0.11%；Ctrl組中BA/TA含量最高，為15.29%。

表6 青貯蘆葦?shù)陌l(fā)酵品質(zhì) %

AN/TN這一指標(biāo)可評(píng)價(jià)青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，該值<5.0%，青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)為優(yōu)，5%~10%為良好，10%~15%為中等，>15%為差，除了Ctrl組外其他各組的AN/TN含量均小于10%，結(jié)合實(shí)際觀察，各組腐敗程度均較低，發(fā)酵情況均屬于“良好”。Ctrl組與各益生菌添加劑組之間AN/TN含量有顯著差異性，為13.62%（P<0.05）。

2.2.6 蘆葦青貯毒素含量 表7為蘆葦青貯樣品的三種飼料毒素的檢測(cè)結(jié)果，由于蘆葦飼料國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未制定，因此使用玉米、麩皮和豆粕的毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（DON≤1.0 mg/kg；AFB1≤20.0 μg/kg；ZEN≤400.0 μg/kg）來(lái)評(píng)價(jià)蘆葦青貯樣品是否毒素含量超標(biāo)。經(jīng)試驗(yàn)檢測(cè)，各組檢測(cè)結(jié)果均達(dá)到常規(guī)飼料的毒素驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

表7 青貯蘆葦?shù)亩舅睾?/p>

2.3 蘆葦發(fā)酵品質(zhì)評(píng)價(jià) 根據(jù)費(fèi)氏評(píng)分法對(duì)各組蘆葦青貯樣品發(fā)酵品質(zhì)的平均值進(jìn)行評(píng)分與等級(jí)劃分（表8）。其中XS64組評(píng)分最高，為86分，評(píng)價(jià)為“優(yōu)”。同時(shí)，XS55組也具有同樣的優(yōu)秀品質(zhì)，評(píng)分為85，評(píng)價(jià)為“優(yōu)”。此外其他兩個(gè)益生菌添加組XSD組和BZSD組的評(píng)價(jià)均為“良”。Ctrl組品質(zhì)差，乳酸占總酸含量極低，為7.07%，弗氏評(píng)分法的得分最低，為7分，青貯品質(zhì)評(píng)價(jià)為“劣”。

表8 青貯蘆葦?shù)母ナ显u(píng)價(jià)

3 討論

3.1 乳酸菌對(duì)蘆葦青貯的影響 此次蘆葦青貯各處理組pH均在3.80~4.20，以pH值評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（中國(guó)）（劉建新等，1999）對(duì)各組進(jìn)行評(píng)分，XS55組和XS64組等級(jí)為優(yōu)等；Ctrl組和BZSD組青貯等級(jí)為良好。青貯中的有機(jī)酸含量及其構(gòu)成，是反映青貯發(fā)酵品質(zhì)最關(guān)鍵的指標(biāo)。評(píng)價(jià)有機(jī)酸含量的重要指標(biāo)為乳酸、乙酸、丙酸和丁酸（金華平，2013）。其中乳酸含量占比越高則說(shuō)明青貯效果越好。各益生菌添加劑處理組中乳酸含量均極顯著高于Ctrl組。丁酸由多種腐敗菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生，丁酸被牛瘤胃壁吸收，轉(zhuǎn)化為β-羥丁酸并導(dǎo)致奶牛酮病的發(fā)生。Ctrl組丁酸/總酸含量最高，為15.29%，其他復(fù)合益生菌添加劑處理組丁酸/總酸含量均小于1%。因此，添加活性乳酸菌可顯著地提高蘆葦青貯中乳酸的含量，并可以有效抑制腐敗菌的生長(zhǎng)從而降低丁酸的含量。氨態(tài)氮/總氮可反映青貯料中粗蛋白質(zhì)與氨基酸的分解程度，益生菌添加劑各組的氨態(tài)氮/總氮的比值含量極低，均顯著低于Ctrl組（P<0.05）。研究表明，在蘆葦青貯過(guò)程中添加乳酸菌，可有效降低蘆葦?shù)膒H，同時(shí)抑制其他腐敗菌所造成的不良發(fā)酵，蘆葦中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到了較為完整的保存。

3.2 產(chǎn)纖維素降解酶的益生菌對(duì)蘆葦青貯的影響 中性洗滌纖維（NDF）主要是細(xì)胞壁成分，NDF可作為評(píng)估青貯飼料精粗比的一個(gè)重要指標(biāo)。酸性洗滌纖維（ADF）包括纖維素、木質(zhì)素和硅酸鹽等，當(dāng)ADF含量適中時(shí)，能夠有效的促進(jìn)動(dòng)物的消化作用；當(dāng)其含量過(guò)高時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率降低（晁洪雨，2012）。本研究結(jié)果表明，添加產(chǎn)纖維素降解酶益生菌的各組青貯飼料中的NDF含量顯著降低（P<0.05），這可能與D1、SN-6所產(chǎn)生的纖維素酶與漆酶有關(guān)。此外，益生菌添加劑的各組中乳酸含量比Ctrl組含量更高，其原因可能是纖維素被D1和SN-6降解利用后，進(jìn)一步為乳酸菌提供了青貯發(fā)酵的底物葡萄糖。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合益生菌添加劑具有保存蘆葦中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理性狀、提高飼料風(fēng)味、降低pH、抑制腐敗菌生長(zhǎng)、降低蘆葦中NDF含量等作用。