復(fù)合微生物制劑對(duì)大豆中胰蛋白酶抑制因子發(fā)酵處理的參數(shù)優(yōu)化研究

林大彪，楊 斌

（長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130022）

胰蛋白酶抑制因子（KTI）是大豆及其副產(chǎn)物中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，在各品種大豆中的平均含量約為17.7 mg/g（程慧等，2020），該物質(zhì)能與糜蛋白酶和胰蛋白酶結(jié)合形成復(fù)合物，使兩種消化酶失活（周天驕等，2015）。在經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖中，大豆與豆粕中KTI過高會(huì)導(dǎo)致飼料中蛋白消化利用率顯著下降，破壞營養(yǎng)物質(zhì)的氮平衡，引起動(dòng)物腹瀉，進(jìn)而抑制動(dòng)物生長（姜雷，2019）。同時(shí)，過量食用KTI濃度高的食物會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物胰腺細(xì)胞腫大，增加體內(nèi)自由基產(chǎn)生使胰腺分泌功能紊亂（劉勇杰，2017），嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致胰腺細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷（李德發(fā)，2019；趙琳琳等，2018）。“玉米-豆粕”型日糧是我國單胃動(dòng)物養(yǎng)殖中應(yīng)用最為廣泛的日糧類型，在反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中大豆及其副產(chǎn)物是精料組成的重要原料之一，在飼用抗生素禁止使用且氧化鋅在日糧中用量減少的背景下，由KTI引起的動(dòng)物腹瀉是降低動(dòng)物生產(chǎn)性的主要原因之一。因此，本文以大豆為研究材料，使用微生物制劑對(duì)大豆粉進(jìn)行發(fā)酵處理，觀察其對(duì)大豆發(fā)酵物中KTI含量的影響，通過篩選最優(yōu)發(fā)酵工藝，對(duì)大豆類產(chǎn)品在動(dòng)物飼料生產(chǎn)與養(yǎng)殖中的深入應(yīng)用提出新的見解。

1 材料與方法

1.1 主要研究材料 大豆購自中糧集團(tuán)有限公司，經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，低溫冷風(fēng)烘干，陰涼干燥區(qū)域儲(chǔ)存，測定大豆中KTI含量，剩余樣品待后續(xù)試驗(yàn)使用。微生物制劑主要組成為乳酸菌、酵母菌及枯草芽孢桿菌，購自益加益生物工程科技有限公司，具體微生物含量見表1。

表1 微生物制劑中的微生物含量

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試驗(yàn)儀器 雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)（SZG型，常州市旭宇環(huán)保工程科技有限公司），發(fā)酵裝置（YD-GA-0.25L型，上海有道生工），粉碎機(jī)（40目篩片），勻漿機(jī)（FSH-2A，常州金壇良友儀器有限公司），漩渦混合器（UMV-1，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限有限公司），具塞離心管（濟(jì)南新美康生物技術(shù)有限公司），電子稱（LS30-08MT型，浙江良石智能技術(shù)有限公司），分析天平（上?；ǔ睂?shí)業(yè)有限公司），微孔板酶標(biāo)儀（JC-1086A，青島聚創(chuàng)環(huán)集團(tuán)有限公司）等。

1.2.2 主要檢測試劑KTI檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），KTI標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：9035-81-8），GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。

1.3 KTI檢測方法 大豆與大豆發(fā)酵產(chǎn)物中胰蛋白酶抑制因子的檢測方法參考國家市場監(jiān)督管理總局與國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)制定的《GB/T 40368-2021植物代謝產(chǎn)物胰蛋白酶抑制因子測定 酶聯(lián)免疫吸附法》。主要步驟如下：（1）樣品前處理：精確稱取1.00 g左右大豆粉或者大豆發(fā)酵物，置于15 mL具塞離心管中，按照試劑盒要求配制提取物液并對(duì)其進(jìn)行稀釋。（2）測定：樣品經(jīng)過處理，樣品液KTI與微孔板中KTI抗體結(jié)合，清洗為結(jié)合的其他成分，再次與KTI抗體結(jié)合，加入酶標(biāo)底物，在酶標(biāo)儀中使用450 nm波長進(jìn)行吸光度值測定，以便計(jì)算KTI含量。（3）平行試驗(yàn)：對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液進(jìn)行6次平行試驗(yàn)以保證測定結(jié)果準(zhǔn)確性。（4）空白實(shí)驗(yàn)：不稱取樣品，按照上述步驟進(jìn)行操作，以進(jìn)行校準(zhǔn)。（5）陽性質(zhì)控：根據(jù)大豆或大豆發(fā)酵物KTI含量，選擇合適的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。（6）根據(jù)上述步驟所得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸光度變化關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。（7）根據(jù)試劑盒說明，將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算樣品液質(zhì)量濃度（ρ）。（8）樣品中KTI的含量計(jì)算公式如下：

式中：W為KTI含量，g/mg；ρ為KTI的質(zhì)量濃度，ng/mL；V為樣品液體積，mL；a為在處理過程中樣品液稀釋倍數(shù)；m樣品的精確稱樣量，g。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn) 在本研究中，主要考察微生物制劑添加量、發(fā)酵溫度、料水比對(duì)大豆發(fā)酵產(chǎn)物KTI含量的影響。初始發(fā)酵工藝參數(shù)設(shè)定為：按照1 kg大豆粉加入0.2 g微生物制劑的添加量將微生物制劑與大豆粉混勻，料水比控制為1.0:0.8，發(fā)酵溫度為30℃，然后根據(jù)復(fù)合微生物制劑廠家提供的使用說明，將發(fā)酵時(shí)間固定為3 d并置于陰涼、避光條件下。發(fā)酵完畢，將大豆發(fā)酵物取出，低溫烘干后測定KTI含量。

依據(jù)初始發(fā)酵工藝參數(shù)，按照單因素輪換法，保持料水比為1.0:0.8、發(fā)酵溫度30℃，依次考察1 kg大豆中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g微生物制劑對(duì)大豆發(fā)酵物中KTI含量的影響；然后，保持微生物制劑接種量為0.2 g/kg、發(fā)酵溫度為30℃，依次考察料水比為1.0:0.7、1.0:0.8、1.0:0.9、1.0:1.0、1.0:1.1對(duì)大豆發(fā)酵物KTI含量的影響；最后，保持微生物制劑接種量為0.2 g/kg、料水比為1.0:0.8，依次考察發(fā)酵溫度25、30、35、40、45℃對(duì)大豆發(fā)酵物中KTI含量的影響。通過單因素輪換法獲得，3種因素的最優(yōu)參數(shù)所處范圍，然后進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

1.4.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)KTI檢測結(jié)果，篩選各項(xiàng)參數(shù)對(duì)KTI影響的最優(yōu)范圍，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以KTI含量最低為優(yōu)化目標(biāo)獲得最佳工藝參數(shù)。單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)均重復(fù)測定3次，取平均值。

1.4.3 方法學(xué)考察與驗(yàn)證 根據(jù)正交試驗(yàn)所得最佳工藝參數(shù)，進(jìn)行6次平行試驗(yàn)確定大豆發(fā)酵物中KTI含量及其穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)比大豆與大豆發(fā)酵物中其他抗?fàn)I養(yǎng)因子（大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白）含量。大豆球蛋白與β-伴大豆球蛋白使用酶聯(lián)免疫吸附法測定，檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.5統(tǒng)計(jì)與分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行初步整理，再通過SPSS 2021軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和極差分析。使用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)大豆與大豆發(fā)酵物中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量顯著性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值”或“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆原料中KTI含量測定結(jié)果 由表1可知，大豆原料KTI平均含量為16.49 mg/g，并且變異系數(shù)CV值為0.26%，說明本試驗(yàn)中所購的大豆原料KTI指標(biāo)穩(wěn)定、原料一致性較好，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 大豆原料中KTI含量 mg/g

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 微生物制劑接種量對(duì)KTI含量的影響由圖1可知，隨著微生物制劑接種量的增加，KTI在大豆發(fā)酵物中含量呈先降低而后上升的趨勢。在接種量為0.3 g/kg時(shí)，KTI含量最低，為4.23 mg/g。當(dāng)超過0.3 g/kg的接種量時(shí)，KTI濃度緩慢上升，以KTI濃度最低為優(yōu)化目標(biāo)可以認(rèn)為最佳微生物制劑接種量為0.2~0.4 g/kg。

圖1 微生物接種量對(duì)大豆發(fā)酵物中KTI含量的影響

2.2.2 料水比對(duì)KTI含量的影響 由圖2可知，隨著料水比下降，發(fā)酵物中KTI含量越低。當(dāng)料水比為1.0:1.0時(shí)，KTI含量最低，為3.65 mg/g。此后，發(fā)酵物中KTI含量隨著料水比的下降有一定程度上升，因此根據(jù)結(jié)果可認(rèn)為料水比最佳范圍處于1.0:0.9至1.0:1.1。

圖2 料水比對(duì)大豆發(fā)酵物中KTI含量的影響

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)KTI含量的影響 由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的上升，大豆發(fā)酵物中KTI含量先遞減然后再大幅度上升，當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時(shí)，KTI含量最低，為2.23 mg/g。根據(jù)測定結(jié)果可以認(rèn)為，最佳發(fā)酵溫度為30~40℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)大豆發(fā)酵物中KTI含量的影響

2.3 最優(yōu)生產(chǎn)工藝的確定

2.3.1 正交分析結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，本研究將發(fā)酵時(shí)間固定為3 d，然后以微生物制劑接種量、料水比和發(fā)酵溫度為主要考察因素進(jìn)行正交分析。正交分析各項(xiàng)因素與水平依據(jù)單因素結(jié)果設(shè)定（表2）。

表2 正交試驗(yàn)的因素與水平

使用SPSS軟件生成正交分析表（表3），根據(jù)正交試驗(yàn)表按照指定工藝參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵物KTI含量進(jìn)行測定。由方差分析結(jié)果可知（表4），料水比對(duì)發(fā)酵物中KTI含量影響顯著（P<0.05），發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵物中KTI含量影響極顯著（P<0.01）。極差分析表明接種量、料水比、發(fā)酵溫度的R值分別為0.57、0.71、195，R值越大對(duì)KTI含量的影響程度越高，因此可以判定3種因素的重要性排序從高到低依次為發(fā)酵溫度＞料水比＞微生物接種量。以KTI最低為優(yōu)化目標(biāo)，根據(jù)值，可認(rèn)為在發(fā)酵時(shí)間固定為3 d條件下，最佳發(fā)酵參數(shù)為微生物接種量0.3 g/kg、料水比1.0:1.0，發(fā)酵溫度35℃。

表3 正交試驗(yàn)與極差分析結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.3.2 最優(yōu)工藝參數(shù)條件下大豆發(fā)酵物KTI含量測定 根據(jù)上述最佳工藝參數(shù)，連續(xù)進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，所得大豆發(fā)酵物中KTI平均含量約為1.3167mg/g，比大豆原料中KTI含量下降約92.01%（表5），并且該工藝參數(shù)下CV值低于5%，說明在該工藝參數(shù)下，可穩(wěn)定地生產(chǎn)KTI含量較低的發(fā)酵大豆用于飼料生產(chǎn)。

表5 大豆發(fā)酵物中KTI含量 mg/g

2.3.3 大豆與大豆發(fā)酵物中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量大豆與大豆發(fā)酵物中抗?fàn)I養(yǎng)因子中KTI、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白含量差異如表6所示。盡管本研究是以KTI含量最低為優(yōu)化目標(biāo)，但在最佳發(fā)酵工藝參數(shù)下發(fā)酵物中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量分別比大豆下降81.27%和75.07%。

表6 大豆與大豆發(fā)酵物中抗?fàn)I養(yǎng)因子差異

3 討論

KTI是大豆中含量較高的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，降低豆類產(chǎn)品中KTI是對(duì)于飼料和食品行業(yè)的重要研究內(nèi)容（Bendre等，2019）。飼糧工業(yè)發(fā)展早期依靠加熱對(duì)豆類原料中KTI進(jìn)行處理，但該方法適用性較差（Ascenzi等，2003），溫度不夠易導(dǎo)致胰蛋白酶抑制因子去除不徹底，溫度過熱易破壞飼料中維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分，并且蛋白質(zhì)會(huì)在加熱過程中出現(xiàn)“美拉德反應(yīng)”，導(dǎo)致蛋白消化利用率下降，可能造成幼齡動(dòng)物消化不良進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉的出現(xiàn)（包健等，2015）。乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢菌等微生物可將KTI作為養(yǎng)分用于自身增殖代謝，因此對(duì)各類原料中的KTI均有降解作用（王小明等，2017），但單一微生物發(fā)酵對(duì)KTI降解的作用有限，如枯草芽孢桿菌對(duì)豆類飼料原料發(fā)酵，其中KTI降解率最高僅為63.12%（梁運(yùn)祥等，2010），目前復(fù)合微生物制劑用于豆類產(chǎn)品發(fā)酵應(yīng)用更為廣泛。研究認(rèn)為微生物在增殖過程中存在競爭關(guān)系，當(dāng)競爭過于劇烈會(huì)降低發(fā)酵效果（馬艷娟，2021；彭翔等，2020；吳金男等，2015），這可能是本研究中微生物制劑接種量提升，而KTI含量先降低而后小幅度升高的原因。水分含量適中是合理發(fā)酵的基礎(chǔ)，過高的水分容易使降解KTI必要的物質(zhì)過于分散而導(dǎo)致發(fā)酵效果較差，而水分含量過低容易使空氣進(jìn)入影響微生物增殖（周苗苗等，2015；孫合美等，2014）。而發(fā)酵溫度對(duì)于微生物存活與增殖代謝有重要關(guān)聯(lián)（李春梅等，2022；陳倩倩等，2020；楊曉婷等，2020），微生物在最適溫度下增殖速度最高，對(duì)KTI代謝速率也會(huì)有顯著提升。盡管本研究以降低KTI為目標(biāo)對(duì)發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，但在后續(xù)的檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)復(fù)合微生物制劑對(duì)大豆中大豆球蛋白與β-伴大豆球蛋白抗?fàn)I養(yǎng)因子同樣具有降解作用。研究表明，微生物發(fā)酵是有效降解豆類飼料原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的重要途徑之一（李英英等，2022；姚怡莎等，2015），但目前的研究鮮見有微生物發(fā)酵過程中對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子降解的偏好有明確報(bào)道。盡管在實(shí)際飼料生產(chǎn)中對(duì)大豆進(jìn)行膨化是最為常見的去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的手段，但這種方法僅對(duì)熱敏性抗?fàn)I養(yǎng)因子有較好的作用，微生物降解抗?fàn)I養(yǎng)因子的優(yōu)勢在于對(duì)不同類別的抗?fàn)I養(yǎng)因子均具有降解作用，效率遠(yuǎn)高于膨化處理（花蘊(yùn)等，2020）。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合微生物制劑在發(fā)酵時(shí)間固定為3 d時(shí)，微生物接種量0.3 g/kg，料水比1.0:1.0，發(fā)酵溫度35℃為大豆發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，此時(shí)大豆發(fā)酵物中KTI含量最低，為1.3167 mg/g，并且大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量顯著下降。因此本研究認(rèn)為通過微生物復(fù)合制劑發(fā)酵大豆可以有效減少大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，對(duì)提高畜禽生產(chǎn)和飼料消化利用率有重要作用。