響應(yīng)面法優(yōu)化飼用屎腸球菌QW256增殖培養(yǎng)條件

郭建軍， 袁 林， 熊大維， 黃國(guó)昌， 曾 靜*， 王振希

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.南昌工程學(xué)院理學(xué)院，江西 南昌 330099）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）屬于乳酸菌中的腸球菌，革蘭氏陽性，需氧或者兼性厭氧菌，菌落呈圓形或者橢圓形，無芽孢和鞭毛，生長(zhǎng)迅速，代謝乳酸，通常定植在動(dòng)物消化道內(nèi)的回腸和結(jié)腸部位，為腸道正常優(yōu)勢(shì)菌群（彭眾等，2018）?；谄渚哂心臀杆帷⒛蜔嵝詮?qiáng)、耐藥性強(qiáng)等優(yōu)良生物學(xué)特性，可在腸道中形成優(yōu)勢(shì)菌群和與腸道表面黏附形成保護(hù)屏障，產(chǎn)生有機(jī)酸降低腸道pH和一些抗菌物質(zhì)抑制有害菌，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，降低腹瀉率與死亡率，以及促進(jìn)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵，抑制有害微生物生長(zhǎng)，作為抗生素的替代品已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中（白天天等，2021），有著良好的飼用前景。

高密度培養(yǎng)核心在于為菌體提供合適的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)條件，獲得較高菌株菌體密度，降低菌株培養(yǎng)成本和縮短生產(chǎn)周期，從而實(shí)現(xiàn)高密度、高產(chǎn)率和高濃度培養(yǎng)（聶黔麗等，2021）。不同屎腸球菌菌株對(duì)其生長(zhǎng)條件存在較大差異，影響其高密培養(yǎng)的因素較多，包括培養(yǎng)基的成分（氮源、碳源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子）和基礎(chǔ)培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度、初始pH、溶氧濃度）等。實(shí)驗(yàn)室前期從健康仔豬腸道內(nèi)分離篩選得到一株產(chǎn)γ氨基丁酸屎腸球菌QW256，根據(jù)兼具益生特性與開發(fā)潛力的屎腸球菌QW256的生長(zhǎng)需求，從增殖培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)條件2個(gè)方面，以活菌數(shù)為響應(yīng)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，Plackett-Burman試驗(yàn)，最陡爬坡試驗(yàn)以及中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法，對(duì)屎腸球菌QW256培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得最優(yōu)的培養(yǎng)基配方和適宜的培養(yǎng)條件，為其工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株資源 屎腸球菌QW256來自江西省環(huán)境微生物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物8 g/L、牛肉膏5 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、吐 溫-80 1 mL/L、MnSO4·H2O 0.058 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.2~6.4。固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，改變碳源、氮源、無機(jī)鹽等，各成分的量隨試驗(yàn)設(shè)計(jì)的變化而不同。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將屎腸球菌QW256甘油保存管于MRS培養(yǎng)基上劃線活化，37℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min培養(yǎng)16 h后獲得種子液。發(fā)酵培養(yǎng)基成分根據(jù)試驗(yàn)方案逐次改變，向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3%的種子液，37℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測(cè)活菌數(shù)。參照國(guó)標(biāo)GB 4789.35—2016按照MRS瓊脂平板傾注法檢測(cè)活菌數(shù)。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：接種量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵初始pH是影響乳酸腸球菌高活菌數(shù)培養(yǎng)的重要因素。取種子液以一定的接種量轉(zhuǎn)接到有300 mL MRS培養(yǎng)基的500 mL藍(lán)口瓶中，一定溫度下于120 r/min培養(yǎng)20 h后測(cè)定發(fā)酵液的活菌數(shù)和pH，依次考察不同接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、不同培養(yǎng)溫度（30、32、35、37、40、42℃）和不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對(duì)菌活菌數(shù)的影響。

發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化：分別以20 g/L葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖漿、玉米淀粉和糖蜜等替代MRS培養(yǎng)基中的碳源，在已優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20 h，以活菌數(shù)為考察指標(biāo)，確定碳源。在篩選出最佳碳源基礎(chǔ)上，考察碳源添加量（5、10、15、20、30、40 g/L）對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響；然后依次考察不同氮源種類（酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、玉米漿、黃豆餅粉和硫酸銨）、不同類別緩沖鹽體系（檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等）、微量元素、促生長(zhǎng)因子對(duì)菌株生長(zhǎng)狀況的影響。

1.2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選高低2個(gè)水平，以（-1、1）編碼各值，其中高水平是低水平的1.5倍，以培養(yǎng)后發(fā)酵液活菌數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)分析，計(jì)算各因素效應(yīng)和重要性評(píng)價(jià)，篩選出對(duì)屎腸球菌發(fā)酵液活菌數(shù)具有顯著性影響的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定各因素的步長(zhǎng)及變化方向進(jìn)行試驗(yàn)，使其成梯度變化，檢測(cè)各個(gè)梯度下發(fā)酵液活菌數(shù)，逼近最佳區(qū)域，確定下一步中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)中因素的中心點(diǎn)。

1.2.5 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)找出試驗(yàn)的顯著因素與水平，顯著因素響應(yīng)區(qū)域的中心點(diǎn)為零水平，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)3因素5水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每組重復(fù)3次，取平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和可靠性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)菌株屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的影響 由圖1B可知，隨著接種量的增加，屎腸球菌QW256菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)發(fā)酵液活菌數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，接種量為5%時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值，因此選擇5%為最適接種量。由圖1C可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為29～37℃時(shí)，隨著溫度的升高活菌數(shù)逐漸升高；當(dāng)發(fā)酵溫度高于39℃之后，活菌數(shù)迅速下降。因此，最佳發(fā)酵溫度為37℃。由圖1D可知，隨著MRS初始pH的升高，發(fā)酵液活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，在初始pH為7.0時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高；但初始pH為6.5～7.5時(shí)，活菌數(shù)沒有顯著區(qū)別，因此，選擇初始pH為7.0。

圖1 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的影響

2.2 增殖發(fā)酵培養(yǎng)基組分對(duì)菌株屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的影響

2.2.1 不同碳氮源對(duì)菌株屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)基中碳源和氮源成分及其適宜添加量的選擇是改善乳酸菌生長(zhǎng)的手段。在以MRS為基本培養(yǎng)基上，改變碳源、氮源，進(jìn)而篩選合適屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的碳源和氮源。本著工業(yè)生產(chǎn)成本最低化原則，篩選發(fā)酵乳酸菌常用到的碳氮源，結(jié)果見表1。

表1 不同碳氮源對(duì)菌株屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的影響

由表1可知，屎腸球菌QW256在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)較好，發(fā)酵后活菌數(shù)最高，為9.16×108CFU/mL，與 糖 蜜試驗(yàn)組9.10×108CFU/mL無顯著差異（P＞0.05），二者與其余各組存在顯著差異（P＜0.05），說明屎腸球菌QW256比較適合在以葡萄糖或糖蜜為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)。綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)成本選擇糖蜜作為碳源進(jìn)行下一步研究。

屎腸球菌QW256在以酵母粉和玉米漿為單一氮源時(shí)發(fā)酵液活菌數(shù)明顯高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），酵母提取物和玉米漿試驗(yàn)組間不存在顯著性差異（P＞0.05）；以酵母粉和玉米漿為屎腸球菌QW256生長(zhǎng)氮源進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化時(shí)，酵母提取物和玉米漿以1∶2比例復(fù)配時(shí)發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到最大，顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

2.2.2 緩沖鹽體系和微量元素對(duì)菌株屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的影響 由表2可知，檸檬酸-檸檬酸鈉試驗(yàn)組發(fā)酵液活菌數(shù)顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），其他組與MRS對(duì)照組不存在顯著性差異（P＞0.05），表明檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系能夠在一定程度上促進(jìn)屎腸球菌QW256菌體增殖；微量元素通常作為酶或者活性物質(zhì)的組成部分或者激活劑發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基內(nèi)加入精氨酸、Mg2+對(duì)屎腸球菌生長(zhǎng)有促進(jìn)效果，故在優(yōu)化培養(yǎng)基選擇加入硫酸鎂和精氨酸。

表2 緩沖鹽體系和微量元素對(duì)菌株屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的影響

以碳源及氮源的結(jié)果得到初優(yōu)培養(yǎng)基：糖蜜20 g/L、酵母粉8 g/L、玉米漿16 g/L。通過培養(yǎng)基中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果及乳酸腸球菌生長(zhǎng)特點(diǎn)的分析，確定檸檬酸0.25 g/L、檸檬酸鈉4.5 g/L、硫酸鎂0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L添加到初優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)行PB試驗(yàn)。

2.3 兩水平部分因子設(shè)計(jì)篩選影響屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的主要影響因子 以屎腸球菌QW256活菌含量（108CFU/mL）為響應(yīng)值進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析，得到回歸模型方差分析和各因素的主效應(yīng)見表4。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，該模型的決定系數(shù)為96.52%，校正后的決定系數(shù)91.36%＞70%，并且模型的P值為0.0033，證明模型與實(shí)際情況擬合較好。糖蜜、酵母粉、檸檬酸、檸檬酸鈉、硫酸鎂、接種量和初始pH為正效應(yīng)，選擇它們的高水平應(yīng)用到后續(xù)試驗(yàn)中；玉米漿、精氨酸、培養(yǎng)溫度為負(fù)效應(yīng)，選擇它們的低水平應(yīng)用到后續(xù)試驗(yàn)中。從P值來看，糖蜜在置信區(qū)間P<0.01影響顯著，檸檬酸鈉和初始pH在置信區(qū)間0.01

表4 PB試驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析結(jié)果

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面最優(yōu)鄰域 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖蜜、檸檬酸鈉和初始pH因素都呈顯著正效應(yīng)，變化方向?yàn)楦饕蛩貪舛忍荻冗f增，進(jìn)行最速上升試驗(yàn)。表5的結(jié)果表明，最大活菌數(shù)在第4次試驗(yàn)附近，故采用糖蜜22.5 g/L，檸檬酸鈉4.9 g/L，初始pH 7.6進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

表5 最速上升試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化屎腸球菌QW256生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子 以糖蜜、檸檬酸鈉和初始pH 3個(gè)顯著影響因子作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的自變量，以培養(yǎng)后發(fā)酵液活菌數(shù)作為響應(yīng)值進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)3因素5水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表6所示。

表6 屎腸球菌QW256增殖條件優(yōu)化中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由Design-Expert 8.0.6軟件擬合得到多元回歸模型，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表 示 為：R=-469.986-0.995X1+14.443X2+117.19X3+0.334X1X2+0.312X1X3+3.682X2X3-0.063X12-4.978X22-9.252X32，回歸方程的參數(shù)估計(jì)和方差分析見表7。

表7 中心組合試驗(yàn)回歸模型的方差分析

由表7可知，調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.8703與確定系數(shù)值R2=0.9211較為接近，表明該模型活菌數(shù)的預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值之間的擬合度良好；精密度Adeq Precision=8.379>4，說明該模型響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)，可用于擬合上述試驗(yàn)結(jié)果，CV=1.59%，說明總變異中只有1.59%不能用此模型進(jìn)行解釋，不能擬合情況可以忽略；二次多項(xiàng)式模型P值為0.0089，極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)的P值為0.2774（P>0.1），差異不顯著，說明該模型能夠涵蓋所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)精確度強(qiáng)及可信度高，可以用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)最大值。

2.6 響應(yīng)曲面分析確定最佳濃度及驗(yàn)證試驗(yàn)由圖2可見，響應(yīng)面三維立體圖均為光滑的曲面，且開口向下，X1、X2、X3存在極值點(diǎn)，說明區(qū)域在所設(shè)計(jì)的響應(yīng)面范圍覆蓋了最大值，能夠找到活菌數(shù)的最大值，響應(yīng)面立體圖曲線較為彎曲，說明因素兩兩之間交互作用顯著，各因素對(duì)結(jié)果影響較大；使用Goal Maximize命令對(duì)R進(jìn)行嶺脊分析，當(dāng)3個(gè)因子最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)（X1、X2、X3）的代碼值（0.87、0.52、0.76）時(shí)，得出回歸模型存在的最大估計(jì)值為：活菌數(shù)最大值為1.073×1010CFU/mL，即與其對(duì)應(yīng)的是糖蜜24.7 g/L，檸檬酸鈉5.1g/L，初始pH 7.7。

圖2 各因素交互作用響應(yīng)面圖

為了驗(yàn)證最優(yōu)屎腸球菌QW256生長(zhǎng)條件和過程工藝參數(shù)的控制主要包括對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基pH的調(diào)控，本試驗(yàn)中屎腸球菌QW256的最佳接種量為5%、最適培養(yǎng)溫度為37℃、最適初始pH為7.7。

為了驗(yàn)證最優(yōu)屎腸球菌QW256生長(zhǎng)條件和增菌效果的可靠性，按照優(yōu)化后的條件，以初始MRS培養(yǎng)基為對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其活菌含量、發(fā)酵液pH的變化曲線結(jié)果如圖3所示。屎腸球菌QW256在MRS和優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線可以看出，延遲期由7 h提前到3 h，穩(wěn)定期由18 h提前到14 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)了2 h，整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)周期時(shí)間縮減3 h，證明優(yōu)化后的培養(yǎng)基更加有利于菌株屎腸球菌QW256的生長(zhǎng)：整個(gè)生長(zhǎng)周期中MRS培養(yǎng)基的最大活菌濃度為3.36×109CFU/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基最大活菌濃度為1.12×1010CFU/mL，與模型預(yù)測(cè)值非常接近，表明該模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際的發(fā)酵情況。而pH變化曲線可以看出，pH在對(duì)數(shù)期時(shí)下降速率較快，菌體增殖產(chǎn)生的大量有機(jī)酸的速率增加較快，且與細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)相關(guān)性。

圖3 屎腸球菌QW256的生長(zhǎng)曲線

3 討論

乳酸菌菌劑制備的關(guān)鍵在于其高密度培養(yǎng)，影響高密度培養(yǎng)的因素有菌種特性、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)過程工藝參數(shù)的控制以及培養(yǎng)模式等，增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化是高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)。乳酸腸球菌的營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜，通過培養(yǎng)基的改良或額外添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、核苷酸、維生素等），并且需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度恰當(dāng)合理，才能有效促進(jìn)菌體增殖。本試驗(yàn)中，在以MRS為培養(yǎng)基 的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良與添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以糖蜜為碳源、酵母粉和玉米漿為氮源、檸檬酸鈉鹽為緩沖鹽體系、營(yíng)養(yǎng)因子（精氨酸）等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為屎腸球菌QW256培養(yǎng)基時(shí)，緩解發(fā)酵液pH降低對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制作用，延長(zhǎng)菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得較高的生物量。培養(yǎng)過程工藝參數(shù)的控制主要包括對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基pH的調(diào)控，本試驗(yàn)中屎腸球菌QW256的最佳接種量為5%、最適培養(yǎng)溫度為37℃、最適初始pH為7.7。

本試驗(yàn)在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定適合該屎腸球菌生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)工藝參數(shù)（接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等），以及該菌的最適培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、緩沖鹽體系、生長(zhǎng)因子、微量元素等）；通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析篩選影響屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的顯著影響因子，利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近顯著因子的最大活菌數(shù)響應(yīng)區(qū)域，最后采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法得到顯著影響因子的最優(yōu)配比。本試驗(yàn)通過優(yōu)化屎腸球菌QW256培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，在最佳條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到的活菌數(shù)為1.12×1010CFU/mL，高于陳志娜等（2021）高密度培養(yǎng)屎腸球菌R2后的活菌數(shù)1.33×109CFU/mL和采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)屎腸球菌Y1增殖培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化得到活菌數(shù)2.90×109CFU/mL（苑園園等，2021）。

4 結(jié)論

本研究以工業(yè)化生產(chǎn)為出發(fā)點(diǎn)，采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析對(duì)屎腸球菌QW256培養(yǎng)條件和高密度培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，確定菌株屎腸球菌QW256的最佳增殖培養(yǎng)條件為接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、初始pH 7.8，菌株屎腸球菌QW256優(yōu)化培養(yǎng)基成分為：糖蜜24.7 g/L、酵母粉10 g/L、玉米漿16 g/L、檸檬酸0.25 g/L、檸檬酸鈉5.1 g/L、硫酸鎂0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L。在優(yōu)化后培養(yǎng)條件下培養(yǎng)17 h時(shí)發(fā)酵液活菌數(shù)為1.12×1010CFU/mL。