響應(yīng)面法優(yōu)化飼用屎腸球菌QW256增殖培養(yǎng)條件

郭建軍， 袁 林， 熊大維， 黃國昌， 曾 靜*， 王振希

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.南昌工程學(xué)院理學(xué)院，江西 南昌 330099）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）屬于乳酸菌中的腸球菌，革蘭氏陽性，需氧或者兼性厭氧菌，菌落呈圓形或者橢圓形，無芽孢和鞭毛，生長迅速，代謝乳酸，通常定植在動物消化道內(nèi)的回腸和結(jié)腸部位，為腸道正常優(yōu)勢菌群（彭眾等，2018）。基于其具有耐胃酸、耐熱性強(qiáng)、耐藥性強(qiáng)等優(yōu)良生物學(xué)特性，可在腸道中形成優(yōu)勢菌群和與腸道表面黏附形成保護(hù)屏障，產(chǎn)生有機(jī)酸降低腸道pH和一些抗菌物質(zhì)抑制有害菌，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，降低腹瀉率與死亡率，以及促進(jìn)反芻動物瘤胃發(fā)酵，抑制有害微生物生長，作為抗生素的替代品已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中（白天天等，2021），有著良好的飼用前景。

高密度培養(yǎng)核心在于為菌體提供合適的營養(yǎng)成分和生長條件，獲得較高菌株菌體密度，降低菌株培養(yǎng)成本和縮短生產(chǎn)周期，從而實(shí)現(xiàn)高密度、高產(chǎn)率和高濃度培養(yǎng)（聶黔麗等，2021）。不同屎腸球菌菌株對其生長條件存在較大差異，影響其高密培養(yǎng)的因素較多，包括培養(yǎng)基的成分（氮源、碳源、無機(jī)鹽和生長因子）和基礎(chǔ)培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度、初始pH、溶氧濃度）等。實(shí)驗(yàn)室前期從健康仔豬腸道內(nèi)分離篩選得到一株產(chǎn)γ氨基丁酸屎腸球菌QW256，根據(jù)兼具益生特性與開發(fā)潛力的屎腸球菌QW256的生長需求，從增殖培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)條件2個方面，以活菌數(shù)為響應(yīng)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，Plackett-Burman試驗(yàn)，最陡爬坡試驗(yàn)以及中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法，對屎腸球菌QW256培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得最優(yōu)的培養(yǎng)基配方和適宜的培養(yǎng)條件，為其工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株資源 屎腸球菌QW256來自江西省環(huán)境微生物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物8 g/L、牛肉膏5 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、吐 溫-80 1 mL/L、MnSO4·H2O 0.058 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.2~6.4。固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，改變碳源、氮源、無機(jī)鹽等，各成分的量隨試驗(yàn)設(shè)計(jì)的變化而不同。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將屎腸球菌QW256甘油保存管于MRS培養(yǎng)基上劃線活化，37℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min培養(yǎng)16 h后獲得種子液。發(fā)酵培養(yǎng)基成分根據(jù)試驗(yàn)方案逐次改變，向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3%的種子液，37℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測活菌數(shù)。參照國標(biāo)GB 4789.35—2016按照MRS瓊脂平板傾注法檢測活菌數(shù)。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：接種量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵初始pH是影響乳酸腸球菌高活菌數(shù)培養(yǎng)的重要因素。取種子液以一定的接種量轉(zhuǎn)接到有300 mL MRS培養(yǎng)基的500 mL藍(lán)口瓶中，一定溫度下于120 r/min培養(yǎng)20 h后測定發(fā)酵液的活菌數(shù)和pH，依次考察不同接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、不同培養(yǎng)溫度（30、32、35、37、40、42℃）和不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對菌活菌數(shù)的影響。

發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化：分別以20 g/L葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖漿、玉米淀粉和糖蜜等替代MRS培養(yǎng)基中的碳源，在已優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20 h，以活菌數(shù)為考察指標(biāo)，確定碳源。在篩選出最佳碳源基礎(chǔ)上，考察碳源添加量（5、10、15、20、30、40 g/L）對菌株生長的影響；然后依次考察不同氮源種類（酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、玉米漿、黃豆餅粉和硫酸銨）、不同類別緩沖鹽體系（檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等）、微量元素、促生長因子對菌株生長狀況的影響。

1.2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選高低2個水平，以（-1、1）編碼各值，其中高水平是低水平的1.5倍，以培養(yǎng)后發(fā)酵液活菌數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)分析，計(jì)算各因素效應(yīng)和重要性評價，篩選出對屎腸球菌發(fā)酵液活菌數(shù)具有顯著性影響的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定各因素的步長及變化方向進(jìn)行試驗(yàn)，使其成梯度變化，檢測各個梯度下發(fā)酵液活菌數(shù)，逼近最佳區(qū)域，確定下一步中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)中因素的中心點(diǎn)。

1.2.5 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)找出試驗(yàn)的顯著因素與水平，顯著因素響應(yīng)區(qū)域的中心點(diǎn)為零水平，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)3因素5水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每組重復(fù)3次，取平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。通過Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型進(jìn)行方差分析和可靠性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對菌株屎腸球菌QW256生長的影響 由圖1B可知，隨著接種量的增加，屎腸球菌QW256菌株生長培養(yǎng)發(fā)酵液活菌數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，接種量為5%時活菌數(shù)達(dá)到最大值，因此選擇5%為最適接種量。由圖1C可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為29～37℃時，隨著溫度的升高活菌數(shù)逐漸升高；當(dāng)發(fā)酵溫度高于39℃之后，活菌數(shù)迅速下降。因此，最佳發(fā)酵溫度為37℃。由圖1D可知，隨著MRS初始pH的升高，發(fā)酵液活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢，在初始pH為7.0時，活菌數(shù)達(dá)到最高；但初始pH為6.5～7.5時，活菌數(shù)沒有顯著區(qū)別，因此，選擇初始pH為7.0。

圖1 不同培養(yǎng)條件對菌株屎腸球菌QW256生長的影響

2.2 增殖發(fā)酵培養(yǎng)基組分對菌株屎腸球菌QW256生長的影響

2.2.1 不同碳氮源對菌株屎腸球菌QW256生長的影響 培養(yǎng)基中碳源和氮源成分及其適宜添加量的選擇是改善乳酸菌生長的手段。在以MRS為基本培養(yǎng)基上，改變碳源、氮源，進(jìn)而篩選合適屎腸球菌QW256生長的碳源和氮源。本著工業(yè)生產(chǎn)成本最低化原則，篩選發(fā)酵乳酸菌常用到的碳氮源，結(jié)果見表1。

表1 不同碳氮源對菌株屎腸球菌QW256生長的影響

由表1可知，屎腸球菌QW256在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)生長較好，發(fā)酵后活菌數(shù)最高，為9.16×108CFU/mL，與 糖 蜜試驗(yàn)組9.10×108CFU/mL無顯著差異（P＞0.05），二者與其余各組存在顯著差異（P＜0.05），說明屎腸球菌QW256比較適合在以葡萄糖或糖蜜為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)生長。綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)成本選擇糖蜜作為碳源進(jìn)行下一步研究。

屎腸球菌QW256在以酵母粉和玉米漿為單一氮源時發(fā)酵液活菌數(shù)明顯高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），酵母提取物和玉米漿試驗(yàn)組間不存在顯著性差異（P＞0.05）；以酵母粉和玉米漿為屎腸球菌QW256生長氮源進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化時，酵母提取物和玉米漿以1∶2比例復(fù)配時發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到最大，顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

2.2.2 緩沖鹽體系和微量元素對菌株屎腸球菌QW256生長的影響 由表2可知，檸檬酸-檸檬酸鈉試驗(yàn)組發(fā)酵液活菌數(shù)顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），其他組與MRS對照組不存在顯著性差異（P＞0.05），表明檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系能夠在一定程度上促進(jìn)屎腸球菌QW256菌體增殖；微量元素通常作為酶或者活性物質(zhì)的組成部分或者激活劑發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基內(nèi)加入精氨酸、Mg2+對屎腸球菌生長有促進(jìn)效果，故在優(yōu)化培養(yǎng)基選擇加入硫酸鎂和精氨酸。

表2 緩沖鹽體系和微量元素對菌株屎腸球菌QW256生長的影響

以碳源及氮源的結(jié)果得到初優(yōu)培養(yǎng)基：糖蜜20 g/L、酵母粉8 g/L、玉米漿16 g/L。通過培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果及乳酸腸球菌生長特點(diǎn)的分析，確定檸檬酸0.25 g/L、檸檬酸鈉4.5 g/L、硫酸鎂0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L添加到初優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)行PB試驗(yàn)。

2.3 兩水平部分因子設(shè)計(jì)篩選影響屎腸球菌QW256生長的主要影響因子 以屎腸球菌QW256活菌含量（108CFU/mL）為響應(yīng)值進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。對試驗(yàn)結(jié)果分析，得到回歸模型方差分析和各因素的主效應(yīng)見表4。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，該模型的決定系數(shù)為96.52%，校正后的決定系數(shù)91.36%＞70%，并且模型的P值為0.0033，證明模型與實(shí)際情況擬合較好。糖蜜、酵母粉、檸檬酸、檸檬酸鈉、硫酸鎂、接種量和初始pH為正效應(yīng)，選擇它們的高水平應(yīng)用到后續(xù)試驗(yàn)中；玉米漿、精氨酸、培養(yǎng)溫度為負(fù)效應(yīng)，選擇它們的低水平應(yīng)用到后續(xù)試驗(yàn)中。從P值來看，糖蜜在置信區(qū)間P<0.01影響顯著，檸檬酸鈉和初始pH在置信區(qū)間0.01

表4 PB試驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析結(jié)果

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面最優(yōu)鄰域 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖蜜、檸檬酸鈉和初始pH因素都呈顯著正效應(yīng)，變化方向?yàn)楦饕蛩貪舛忍荻冗f增，進(jìn)行最速上升試驗(yàn)。表5的結(jié)果表明，最大活菌數(shù)在第4次試驗(yàn)附近，故采用糖蜜22.5 g/L，檸檬酸鈉4.9 g/L，初始pH 7.6進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

表5 最速上升試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化屎腸球菌QW256生長的關(guān)鍵因子 以糖蜜、檸檬酸鈉和初始pH 3個顯著影響因子作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的自變量，以培養(yǎng)后發(fā)酵液活菌數(shù)作為響應(yīng)值進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)3因素5水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表6所示。

表6 屎腸球菌QW256增殖條件優(yōu)化中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由Design-Expert 8.0.6軟件擬合得到多元回歸模型，試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可用回歸方程表 示 為：R=-469.986-0.995X1+14.443X2+117.19X3+0.334X1X2+0.312X1X3+3.682X2X3-0.063X12-4.978X22-9.252X32，回歸方程的參數(shù)估計(jì)和方差分析見表7。

表7 中心組合試驗(yàn)回歸模型的方差分析

由表7可知，調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.8703與確定系數(shù)值R2=0.9211較為接近，表明該模型活菌數(shù)的預(yù)測值和試驗(yàn)值之間的擬合度良好；精密度Adeq Precision=8.379>4，說明該模型響應(yīng)信號強(qiáng)，可用于擬合上述試驗(yàn)結(jié)果，CV=1.59%，說明總變異中只有1.59%不能用此模型進(jìn)行解釋，不能擬合情況可以忽略；二次多項(xiàng)式模型P值為0.0089，極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)的P值為0.2774（P>0.1），差異不顯著，說明該模型能夠涵蓋所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)精確度強(qiáng)及可信度高，可以用該模型對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析及預(yù)測最大值。

2.6 響應(yīng)曲面分析確定最佳濃度及驗(yàn)證試驗(yàn)由圖2可見，響應(yīng)面三維立體圖均為光滑的曲面，且開口向下，X1、X2、X3存在極值點(diǎn)，說明區(qū)域在所設(shè)計(jì)的響應(yīng)面范圍覆蓋了最大值，能夠找到活菌數(shù)的最大值，響應(yīng)面立體圖曲線較為彎曲，說明因素兩兩之間交互作用顯著，各因素對結(jié)果影響較大；使用Goal Maximize命令對R進(jìn)行嶺脊分析，當(dāng)3個因子最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)（X1、X2、X3）的代碼值（0.87、0.52、0.76）時，得出回歸模型存在的最大估計(jì)值為：活菌數(shù)最大值為1.073×1010CFU/mL，即與其對應(yīng)的是糖蜜24.7 g/L，檸檬酸鈉5.1g/L，初始pH 7.7。

圖2 各因素交互作用響應(yīng)面圖

為了驗(yàn)證最優(yōu)屎腸球菌QW256生長條件和過程工藝參數(shù)的控制主要包括對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、培養(yǎng)基pH的調(diào)控，本試驗(yàn)中屎腸球菌QW256的最佳接種量為5%、最適培養(yǎng)溫度為37℃、最適初始pH為7.7。

為了驗(yàn)證最優(yōu)屎腸球菌QW256生長條件和增菌效果的可靠性，按照優(yōu)化后的條件，以初始MRS培養(yǎng)基為對照進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其活菌含量、發(fā)酵液pH的變化曲線結(jié)果如圖3所示。屎腸球菌QW256在MRS和優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長曲線可以看出，延遲期由7 h提前到3 h，穩(wěn)定期由18 h提前到14 h，對數(shù)生長期延長了2 h，整個發(fā)酵培養(yǎng)周期時間縮減3 h，證明優(yōu)化后的培養(yǎng)基更加有利于菌株屎腸球菌QW256的生長：整個生長周期中MRS培養(yǎng)基的最大活菌濃度為3.36×109CFU/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基最大活菌濃度為1.12×1010CFU/mL，與模型預(yù)測值非常接近，表明該模型能很好地預(yù)測實(shí)際的發(fā)酵情況。而pH變化曲線可以看出，pH在對數(shù)期時下降速率較快，菌體增殖產(chǎn)生的大量有機(jī)酸的速率增加較快，且與細(xì)胞生長呈現(xiàn)相關(guān)性。

圖3 屎腸球菌QW256的生長曲線

3 討論

乳酸菌菌劑制備的關(guān)鍵在于其高密度培養(yǎng)，影響高密度培養(yǎng)的因素有菌種特性、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)過程工藝參數(shù)的控制以及培養(yǎng)模式等，增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化是高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)。乳酸腸球菌的營養(yǎng)要求復(fù)雜，通過培養(yǎng)基的改良或額外添加營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、核苷酸、維生素等），并且需要營養(yǎng)物質(zhì)濃度恰當(dāng)合理，才能有效促進(jìn)菌體增殖。本試驗(yàn)中，在以MRS為培養(yǎng)基 的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良與添加營養(yǎng)物質(zhì)，以糖蜜為碳源、酵母粉和玉米漿為氮源、檸檬酸鈉鹽為緩沖鹽體系、營養(yǎng)因子（精氨酸）等營養(yǎng)物質(zhì)作為屎腸球菌QW256培養(yǎng)基時，緩解發(fā)酵液pH降低對菌株生長的抑制作用，延長菌體對數(shù)生長期，獲得較高的生物量。培養(yǎng)過程工藝參數(shù)的控制主要包括對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、培養(yǎng)基pH的調(diào)控，本試驗(yàn)中屎腸球菌QW256的最佳接種量為5%、最適培養(yǎng)溫度為37℃、最適初始pH為7.7。

本試驗(yàn)在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定適合該屎腸球菌生長的最優(yōu)培養(yǎng)工藝參數(shù)（接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等），以及該菌的最適培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、緩沖鹽體系、生長因子、微量元素等）；通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析篩選影響屎腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的顯著影響因子，利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近顯著因子的最大活菌數(shù)響應(yīng)區(qū)域，最后采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法得到顯著影響因子的最優(yōu)配比。本試驗(yàn)通過優(yōu)化屎腸球菌QW256培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，在最佳條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到的活菌數(shù)為1.12×1010CFU/mL，高于陳志娜等（2021）高密度培養(yǎng)屎腸球菌R2后的活菌數(shù)1.33×109CFU/mL和采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對屎腸球菌Y1增殖培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化得到活菌數(shù)2.90×109CFU/mL（苑園園等，2021）。

4 結(jié)論

本研究以工業(yè)化生產(chǎn)為出發(fā)點(diǎn)，采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析對屎腸球菌QW256培養(yǎng)條件和高密度培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，確定菌株屎腸球菌QW256的最佳增殖培養(yǎng)條件為接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、初始pH 7.8，菌株屎腸球菌QW256優(yōu)化培養(yǎng)基成分為：糖蜜24.7 g/L、酵母粉10 g/L、玉米漿16 g/L、檸檬酸0.25 g/L、檸檬酸鈉5.1 g/L、硫酸鎂0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L。在優(yōu)化后培養(yǎng)條件下培養(yǎng)17 h時發(fā)酵液活菌數(shù)為1.12×1010CFU/mL。