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    抗栓膠囊中黃曲霉毒素的含量測定及安全性評價

    2022-11-16 08:49:38薛平顧崢嶸劉旻虹李莉常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心江蘇常州213000
    中南藥學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:抗栓黃曲霉藥典

    薛平,顧崢嶸,劉旻虹,李莉(常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,江蘇 常州 213000)

    抗栓膠囊由當(dāng)歸尾、水蛭、土鱉蟲、丹參、烏梢蛇、麝香、馬錢子、骨碎補(bǔ)、僵蠶、蜈蚣、延胡索、蟾酥等19 味藥材制成,具有活血化瘀、抗栓通脈之功效;一般用于血栓閉塞性脈管炎瘀血阻絡(luò)證,常用于輔助治療腦血栓、心肌梗死、血栓性靜脈炎等疾病[1-3]。

    目前抗栓膠囊的質(zhì)量研究主要是針對當(dāng)歸尾、丹參和甘草等藥材的薄層色譜鑒別及丹參酮ⅡA、士的寧等標(biāo)志成分的含量測定,而安全性探索相對較少[1-3]??顾z囊中含有土鱉蟲生藥粉末,關(guān)于土鱉蟲黃曲霉毒素超標(biāo)的現(xiàn)象時有報道[4-5]。中藥外源性有害物質(zhì)黃曲霉毒素的檢測和控制是藥品質(zhì)量控制的重中之重[6],目前該藥仍未進(jìn)行過黃曲霉毒素的安全性評估。

    黃曲霉毒素(AFT)是公認(rèn)的超級毒性致癌物,其種類較多,黃曲霉毒素的種類主要有黃曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、M1(AFM1)和M2(AFM2)等,其中AFB1毒性最強(qiáng),中藥制劑主要涉及AFB1、AFB2、AFG1和AFG2[5-7]。本文采用免疫親和柱凈化高效液相色譜柱后衍生熒光法(HPLC-FLD)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)測定抗栓膠囊中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的殘留量。兩種檢測方法互相驗(yàn)證,排除干擾,在符合《中國藥典》2020年版要求的前提下,完善檢測方法[7]。通過測定抗栓膠囊樣品中黃曲霉毒素的殘留量,為該藥的質(zhì)量控制和監(jiān)管提供參考。

    1 儀器與試藥

    LC-20A 高效液相色譜儀、RF-20AXS 熒光檢測器(日本島津有限公司);光化學(xué)衍生器(美國AURA);LCMS-8060 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津);XP504 電子天平(萬分之一,瑞士梅特勒-托利多公司);KQ5200DE 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);IKA T25 分散機(jī)[艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司];Thermo Scientific Multifuge X4R Pro 臺式冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。黃曲霉毒素混合對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:610001-202107:AFB1以 1.08 μg·mL-1計(jì)算;AFB2以 0.33μg·mL-1計(jì)算;AFG1以 1.01 μg·mL-1計(jì)算;AFG2以0.30 μg·mL-1計(jì)算]。4 種不同品牌3 mL規(guī)格的免疫親和柱[廠家分別為VICAM(維康)、ROMER、華安麥科和青島普瑞邦(Pribolab)],甲醇、乙腈和乙酸銨均為色譜純,水為去離子水,氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀和吐溫20 均為分析純??顾z囊樣品來自全國20 個省級行政區(qū),涉及9 家生產(chǎn)企業(yè)(編號A~I(xiàn)),共29批次樣品。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件[7-10]

    2.1.1 HPLC-FLD 色譜柱:Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:甲醇-乙腈-水(16∶16∶68);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:40℃;柱后光化學(xué)衍生法:光化學(xué)衍生器(254 nm);檢測器:熒光檢測器,激發(fā)波長λex:360 nm,發(fā)射波長λem:450 nm。

    2.1.2 LC-MS 色譜柱:Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×100 mm,1.9 μm);流動相:10 mmol·L-1醋酸銨溶液為流動相A,以甲醇為流動相B;流速:0.3 mL·min-1,梯度洗脫(0~4.5 min,65%→15%A;4.5~6 min,15%→0%A;6~6.5 min,0%→65%A;6.6~10 min,65%A);柱溫:25℃;進(jìn)樣量:5 μL。

    離子源:電噴霧離子源(ESI);離子源接口溫度:300℃;脫溶劑溫度:526℃;DL 管溫度:250 ℃;載氣流速:2 L·min-1;加熱器流量:10 L·min-1;加熱塊溫度:400℃;干燥氣流速:10 L·min-1;采集模式為正離子模式;各化合物監(jiān)測離子對和碰撞電壓(CE)見表1。

    表1 監(jiān)測離子對、碰撞電壓Tab 1 Monitor ion pair and collision voltage

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 對照品溶液 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液1 mL,置20 mL 量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,作為對照品儲備液。

    HPLC-FLD 對照品溶液:精密量取上述對照儲備液1 mL,置25 mL 量瓶中,用70%甲醇稀釋至刻度,即得。

    LC-MS 系列對照品溶液:精密量取對照儲備液適量,用70%甲醇稀釋成含AFB2、AFG2質(zhì)量濃度為0.03~0.6 ng·mL-1,含AFB1、AFG1質(zhì)量濃度為0.12~2 ng·mL-1的系列對照品溶液,見表2。

    表2 系列混合對照品溶液質(zhì)量濃度(ng·mL-1)Tab 2 Concentration of series mixed reference solution (ng·mL-1)

    2.2.2 供試品溶液[7-8]取抗栓膠囊樣品內(nèi)容物粉末約5 g,精密稱定,置于均質(zhì)瓶中,精密加入70%乙腈溶液75 mL,高速攪拌2 min(11 000 r·min-1),4000 r·min-1離心5 min,精密量取上清液7 mL,置50 mL 量瓶中,用緩沖液(稱取8.0 g 氯化鈉、1.2 g 磷酸氫二鈉、0.2 g 磷酸二氫鉀、0.2 g 氯化鉀,加水990 mL 使溶解,用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0,加水稀釋至1000 mL,即可)稀釋至刻度,搖勻,離心10 min,過濾(用玻璃纖維濾紙過濾),精密量取上清液20 mL,通過免疫親和柱,流速3 mL·min-1,用10 mL 含1%吐溫20 的水洗脫,再用20 mL 水洗脫,棄去洗脫液,再用1.5 mL 甲醇洗脫,收集洗脫液,置2 mL 量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.22 μm)濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

    2.3.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項(xiàng)下HPLC-FLD 對照品溶液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μL;陰性樣品(未檢出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)和供試品溶液各進(jìn)樣20 μL 測定,黃曲霉毒素兩個相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,典型色譜圖見圖1。

    圖1 陰性樣品(A)、對照品(B)、供試品(C)的液相熒光色譜圖Fig 1 Liquid phase fluorescence chromatogram of negative sample(A),reference(B),and sample(C)

    2.3.2 LC-MS 取表2中的3 號對照品溶液、陰性樣品(未檢出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)和供試品溶液按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μL 測定,結(jié)果各峰形良好,響應(yīng)高,試驗(yàn)條件滿足測定要求,典型色譜圖見圖2。

    圖2 陰性樣品(A)、對照品(B)、供試品(C)質(zhì)譜MRM 的TIC色譜圖Fig 2 TIC chromatogram of mass spectrometry MRM of negative sample(A),reference(B),and sample(C)

    2.4 線性關(guān)系考察

    2.4.1 HPLC-FLD 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下HPLC-FLD 對照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL,注入液相色譜儀,測定峰面積,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(X,μL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表3。

    2.4.2 LC-MS 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下LC-MS系列對照品溶液進(jìn)樣5 μL,測定峰面積,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X,ng·mL-1)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表3。

    2.5 精密度試驗(yàn)

    2.5.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項(xiàng)下的HPLC-FLD對照品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針,結(jié)果峰面積RSD,AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積RSD分別為1.2%、0.92%、0.75%和0.59%,表明儀器精密度良好。

    2.5.2 LC-MS 取表2中的3 號對照品溶液,按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針,計(jì)算峰面積RSD,結(jié)果AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積RSD分別為6.9%、4.1%、5.1%和2.9%,表明儀器精密度良好。

    2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

    取抗栓膠囊樣品(生產(chǎn)企業(yè)F,批號:200510),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析,HPLC-FLD 進(jìn)樣20 μL,LC-MS 進(jìn)樣5 μL,平行操作6 份。HPLC-FLD 法測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量的RSD分別為5.2%、5.3%、4.3%和4.1%;LC-MS 測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量的RSD分別為7.9%、5.9%、6.6%和5.9%,RSD均小于10%,表明本方法重復(fù)性良好,兩種檢測方法均可行。

    2.7 檢測限與定量限

    2.7.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項(xiàng)下HPLC-FLD對照品溶液稀釋至一定的濃度,在 “2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以信噪比為10∶1 時相應(yīng)濃度計(jì)算定量限,以信噪比為3∶1 時相應(yīng)濃度計(jì)算檢測限,定量限與檢測限均折算到試樣中被測物能被檢測出的量,結(jié)果見表3。

    2.7.2 LC-MS 取“2.2.1”項(xiàng)下LC-MS 系列對照品溶液中濃度最低的對照品溶液稀釋至一定的濃度,在 “2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以信噪比為10∶1 時相應(yīng)濃度計(jì)算定量限,以信噪比為3∶1 時相應(yīng)濃度計(jì)算檢測限,結(jié)果見表3。

    表3 線性關(guān)系、檢測限和定量限Tab 3 Linear,LOD and LOQ

    2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取抗栓膠囊樣品(生產(chǎn)企業(yè)F,批號:200510),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在0、2、4、6、10、12、16、24 h 時分別按“2.1”項(xiàng)下兩種色譜條件進(jìn)行分析,HPLC-FLD 進(jìn)樣20 μL,LC-MS進(jìn)樣5 μL,計(jì)算峰面積RSD。HPLC-FLD 法測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積的RSD分別為1.5%、0.83%、0.57%和0.56%;LC-MS 測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積的RSD分別為4.7%、3.3%、6.0%和2.0%,表明供試品溶液穩(wěn)定性良好,檢測方法可行。

    2.9 加樣回收試驗(yàn)

    取抗栓膠囊空白樣品(不含黃曲霉毒素)5 g,平行6 份,精密稱定,精密加入對照儲備液0.5 mL,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后,分別按“2.1”項(xiàng)下兩種色譜條件進(jìn)行分析,HPLC-FLD進(jìn)樣20 μL,LC-MS 進(jìn)樣5 μL,結(jié)果HPLC-FLD法平均加樣回收率(RSD)分別為AFG291.79%(1.3%)、AFG188.29%(2.1%)、AFB298.48%(1.3%)、AFB198.82%(1.1%);LC-MS 法平均加樣回收率(RSD)分別為AFG291.31%(5.8%)、AFG192.54%(4.1%)、AFB299.62%(4.4%)、AFB194.03%(2.8%),表明本試驗(yàn)準(zhǔn)確度良好。

    2.10 樣品測定

    取不同生產(chǎn)企業(yè)的抗栓膠囊樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別采用“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析,HPLC-FLD 進(jìn)樣20 μL,LC-MS 進(jìn)樣5 μL,計(jì)算樣品中4 種黃曲霉毒素的含量及其總量,結(jié)果見表4。部分超出線性范圍的供試品溶液稀釋后進(jìn)樣測定。

    表4 樣品測定結(jié)果(μg·kg-1)Tab 4 Sample determination results (μg·kg-1)

    HPLC-FLD 和LC-MS 兩種方法測定結(jié)果相對一致,其中液相色譜光化學(xué)衍生法HPLC-FLD 成本低,可成為生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制方法的首選?!吨袊幍洹?020年版中將LC-MS 作為黃曲霉毒素測定的驗(yàn)證結(jié)果,故以LC-MS 測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)。AFG2的含量為0~28.946 μg·kg-1,AFG1的含量為0~496.11 μg·kg-1,AFB2的含量為0.029~37.751 μg·kg-1,AFB1的含量為1.115~481.879 μg·kg-1;4種黃曲霉毒素的總量為1.442~1044.686 μg·kg-1。29 批次樣品中黃曲霉毒素檢出率極高,其中AFB1檢出率100%。《中國藥典》2020年版中有關(guān)黃曲霉毒素的規(guī)定均為每1000 g 含AFB1不得過5 μg,AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量不得過10 μg。參考此限度,按藥典的數(shù)據(jù)修約規(guī)則,29 批次樣品其中10 個批次樣品AFB1超過5 μg,且AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量超過10 μg;1 批次樣品AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量超過10 μg。29 批次樣品中黃曲霉毒素的不合格率為38%,其中一批次黃曲霉毒素殘留量遠(yuǎn)超參考限度,安全風(fēng)險相對較高。

    3 討論

    3.1 測定方法的優(yōu)化

    本試驗(yàn)測定方法主要參考《中國藥典》2020年版2351 真菌毒素測定法項(xiàng)下的黃曲霉毒素測定法,同時進(jìn)行了部分優(yōu)化。優(yōu)化原因主要是抗栓膠囊基質(zhì)復(fù)雜,預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)對待測成分測定干擾較大。免疫親和柱一般要求過柱的作業(yè)溶液pH 值為中性,抗栓膠囊初始提取液pH 值大約為5.3,整體偏酸性;過柱的作業(yè)溶液要求含甲醇量不超過20%,含乙腈不得過10%。作業(yè)溶液pH 值過低或者過高,含有機(jī)相過高均不利于免疫親和柱吸附黃曲霉毒素。

    前期試驗(yàn)考察了提取溶劑70%甲醇、80%甲醇、70%乙腈、80%乙腈和1%甲酸的70%甲醇的提取效果,發(fā)現(xiàn)70%乙腈提取效率最高。

    考察測定量和取樣量的影響:取混合好的抗栓膠囊內(nèi)容物各5、10、15 g,比較樣品中待測成分的含量,試驗(yàn)總體結(jié)果表明測定稱樣量為5 g 時,已經(jīng)可以達(dá)到測定要求,但每盒樣品中的內(nèi)容物可能會出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象。對比了取樣10、50、100、200 g 的試驗(yàn)結(jié)果,建議每個批次樣品內(nèi)容物取樣量不少于100 g。

    選擇市場上常見的4 種不同品牌的免疫親和柱進(jìn)行比較,結(jié)果表明不同品牌的親和柱對測定影響較小,本試驗(yàn)方法兼容性良好。

    3.2 建議與存在的不足

    黃曲霉毒素毒性極強(qiáng),目前大多不建議設(shè)定黃曲霉毒素的安全耐受量和無毒作用劑量,限量越低越好[10]??顾z囊組方復(fù)雜,組方中有大量的原料藥按《中國藥典》2020年版需要進(jìn)行黃曲霉毒素限量檢查,限量檢查的品種包括土鱉蟲、蜈蚣、水蛭、蜂房、地龍、醋延胡索、制馬錢子(藥材及生馬錢子飲片要求檢驗(yàn))和麩炒僵蠶(藥材及僵蠶飲片要求檢驗(yàn))。

    部分樣品AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量殘留量極高原因跟生產(chǎn)企業(yè)的風(fēng)險意識不強(qiáng)有關(guān),客觀原因是此次抽檢的樣品生產(chǎn)日期處于2020年版《中國藥典》換版期間,生產(chǎn)企業(yè)原料藥均按《中國藥典》2015年版檢驗(yàn),這些高危品種大部分在2015年版藥典均未要求進(jìn)行黃曲霉毒素限量檢查,存在一定的安全監(jiān)控的漏洞。

    為分析抗栓膠囊黃曲霉毒素含量過高的原因,對收到的生產(chǎn)企業(yè)B 和企業(yè)E 寄送的部分原料和小樣進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)企業(yè)B 提供的原料蜂房AFG2、AFG1、AFB2和AFB1殘留量較高,嚴(yán)重超過了《中國藥典》2020年版蜂房下的標(biāo)準(zhǔn)限度。遺憾的是未能獲得黃曲霉毒素殘留量較高樣品相對應(yīng)的原料藥,生產(chǎn)企業(yè)寄送的部分原料不具有顯著代表性,抗栓膠囊黃曲霉毒素污染的具體原因仍需進(jìn)一步探究。課題組根據(jù)與相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)溝通、日常相關(guān)飲片檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[9-12]推測抗栓膠囊黃曲霉毒素污染是上述多種高危原料飲片共同導(dǎo)致的結(jié)果,其中土鱉蟲、醋延胡索和蜂房可能是最主要的源頭,蜈蚣、水蛭、地龍、制馬錢子和麩炒僵蠶可能是次要源頭。

    抗栓膠囊主要服用人群為老年人,黃曲霉毒素是中藥外源性有害物質(zhì)量控制的重中之重。基于上述試驗(yàn)結(jié)果,抗栓膠囊存在黃曲霉毒素污染的安全風(fēng)險,課題組已向國家藥品監(jiān)督管理局建議增加抗栓膠囊的黃曲霉毒素限量檢查,加大該藥的安全監(jiān)控;但此藥的安全質(zhì)量更需要相關(guān)企業(yè)加強(qiáng)黃曲霉毒素方面的質(zhì)量控制的意識,嚴(yán)格把控原料的質(zhì)量,保證用藥安全。

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