早孕絨毛及蛻膜組織中IL-6對吲哚胺2,3-雙加氧酶表達的影響*

陳譽尹， 趙淑云， 王瑞， 伍紫蕊， 李玉佳， 文興慧， 瞿佳麗， 黃官友**

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 生殖中心， 貴州 貴陽 550004； 2.畢節(jié)市中醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 貴州 畢節(jié) 551700)

哺乳動物的子宮是孕育胚胎的場所，可為胚胎提供充足的養(yǎng)分，并對胚胎進行保護；子宮又是母體與胎兒緊密接觸場所，孕體中一半的基因來自父親，發(fā)育中的胚胎和胎盤被認為是半移植物 ，胎兒容易成為免疫系統(tǒng)攻擊的潛在目標，如果沒有強有力的免疫抑制，這種半移植物很快會被識別并產(chǎn)生排斥。在整個妊娠期，母體的免疫系統(tǒng)將胎兒視為暫時的自我，而不予以攻擊[1]，母胎耐受是保護胎兒不被母體免疫系統(tǒng)攻擊的主要原因[1-3]。研究表明，在母胎界面(母體和胎兒的接觸面，主要包括絨毛及蛻膜組織)中輔助型T細胞2(T helper 2 cell，Th2)型細胞因子如白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和吲哚胺2,3-雙加氧酶 (indoleamine2,3-dioxygenase，IDO) 是維持母胎耐受的兩個主要因子[4-7]。目前有關IL-6在母胎耐受中機制的研究較少，既往的研究表明，IL-6可上調早孕絨毛及蛻膜組織中IDO的表達[8]，本研究主要探討母胎界面中IL-6調控IDO表達的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

蛋白酶抑制劑( P8340) 和 RIPA Buffer購自Sigma公司，BCA-100 蛋白定量測定制劑盒 、一抗和二抗去除液購自碧云天公司，兔抗IDO、兔抗信號轉導及轉錄激活子-1(signal transducerand activator of transcription 1，STAT1) 抗體、兔抗蛋白質酪氨酸磷酸酶-1(src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-1， SHP-1)抗體、兔抗蛋白質酪氨酸磷酸酶-2(Src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-2，SHP-2)抗體、GAPDH兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白(immune globulin，IgG)及10×TBST購自Cell Signaling Technology 公司,PVDF 膜及ECL 試劑盒購自 PerkinElmer 公司，5×SDS-PACE 蛋白上樣緩沖液及預染蛋白相對分子質量(Mr) Marker 購自 Biosharp 公司，SDS-PACE 制備試劑盒購北京SOLARBIO公司，重組人IL-6細胞因子購自PEPROTECH公司， F- 12/DMEM及FBS購自Invitrogen 公司。保溫箱為美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 研究方法

1.2.1標本來源、收集及處理 選擇行人工流產(chǎn)終止妊娠的37例正常早孕(孕周6～8周)婦女，妊娠期間未服用任何藥物，并排除全身性疾病、稽留流產(chǎn)、接受過人流前處理( 如孕酮和米非司酮)的患者[8]。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(2020倫審第023號)，將研究實施目的與方法過程告知受試者，均同意表示自愿配合研究，并簽署同意書。 收集所有受試者的子宮絨毛及蛻膜組織，操作過程嚴格遵循無菌原則，采用無菌磷酸鹽緩沖液( phosphate buffer saline pH7. 2，PBS pH7. 2)對絨毛和蛻膜組織進行清洗，去除紅細胞。

1.2.2組織培養(yǎng) 絨毛和蛻膜組織在收集后40 min內(nèi)(去除紅細胞)處理完畢，具體步驟：將收集的絨毛的和蛻膜組織切成小塊( 濕重≤1 mg) ，用 F-12 /DMEM沖洗2次，離心5 min，在培養(yǎng)基中加入10% FBS 和1%青霉素，37 ℃保溫箱中培養(yǎng)，控制環(huán)境中CO2濃度為5%。后分別用含 0、50×10-6及100×10-6mg/L IL-6的培養(yǎng)基孵育24 h。

1.2.3Western blot檢測絨毛和蛻膜組織中IL-6、IDO 、SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達 收集所需的絨毛和蛻膜組織，放置在液氮冷卻處理的研缽中，加入液氮后研磨，成粉末狀，加入蛋白酶抑制劑形成裂解效果，4 ℃、1 2000 r/min離心30 min，取上清液，用 BCA 測蛋白濃度；進而繼續(xù)在其中加入上樣緩沖液，加溫處理煮沸變性，加入聚丙烯酰胺凝膠中的電泳、轉膜，將蛋白轉至PVDF 膜上；用5%的脫脂奶粉封閉PVDF 膜 ，時間控制在2 h，一抗 4 ℃ 孵育過夜，洗膜后加入二抗，孵育后加入ECL 顯影，使用 Imagel J 軟件處理圖片，GAPDH 作為內(nèi)參對照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 正常早孕絨毛及蛻膜組織中 IDO和STAT1蛋白的表達

Western blot 結果表明，早孕絨毛及蛻膜組織中均有 IDO和STAT1蛋白的表達(圖1A及圖2A)，且絨毛組織中IDO和STAT1蛋白的均高于蛻膜組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為Western Blot檢測在正常早孕蛻膜和絨毛組織中IDO蛋白的結果，B為正常早孕蛻膜和絨毛組織中IDO蛋白表達的定量結果；(1)與蛻膜組織比較，P<0.05。

注：A為Western Blot檢測在正常早孕蛻膜和絨毛組織中STAT1蛋白結果，B為正常早孕蛻膜和絨毛組織中STAT1蛋白表達的定量結果；(1)與蛻膜組織比較，P<0.05。

2.2 IL-6濃度與正常早孕絨毛和蛻膜組織中IDO、SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達

Western blot結果顯示，在不同濃度IL-6培養(yǎng)的早孕絨毛和蛻膜組織中， IL-6的濃度與 IDO、SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達呈正相關(絨毛：P=0.043 3、0.021 3、0.005 5及0.011 9，r=0.995 4、0.998 9、0.999 9、0.999 7；蛻膜：P=0.045 4，0.034 5，0.045 6、0.044 6，r=0.994 9、0.997 1、0.994 9、0.995 1)，IL-6上調IDO、SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達(圖3A、圖3B、圖3C、圖4B)；IDO 蛋白與SHP-1、SHP-2及 STAT1蛋白的表達呈正相關(絨毛，圖3A和3C，P=0.001 1、0.046 8、0.022 6，r=0.802 2、0.735 9、0.547 5; 蛻膜，圖4A和4C，P=0.001 4、<0.000 1、<0.000 1，r=0.786 3、0.944 4、0.944 1)；STAT1蛋白與SHP-1、SHP-2蛋白的表達呈正相關(絨毛，圖3A和3D，P=0.009 1、0.414 0，r=0.645 1、0.228 3; 蛻膜，圖4A和4D，P=0.010 4、<0.000 1，r=0.632 3、0.918 7)。

注：A為Western Blot檢測在不同濃度IL-6 培養(yǎng)下正常早孕蛻膜組織中 IDO、SHP-1、SHP-2及STAT1蛋白的結果，B為正常早孕蛻膜組織中 IDO、SHP-1、SHP-2及STAT1蛋白與加入IL-6濃度的相關性分析，C為正常早孕蛻膜組織中 IDO與SHP-1、SHP-2及STAT1蛋白相關性分析，D為正常早孕蛻膜組織中STAT1與SHP-1、SHP-2蛋白相關性分析。

3 討論

在妊娠早期，IDO是維持母-胎免疫耐受的主要蛋白之一[5,9-11]。本課題組既往的研究表明，早孕婦女絨毛和蛻膜中的雌激素通過下調細胞因子信號轉導抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3)[12]的表達和上調轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表達來上調IDO的表達，進而誘導母-胎耐受[13]。然而，母-胎界面調控IDO表達的具體機制仍然不清。

早期的研究表明，IL-6可以通過上調樹突狀細胞中(DCs)[14]中的SOCS3(而不是SHPS)來降低IDO的表達，但最近的研究表明，使用小片段干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)抑制IL-6可以減少SKOV-3和NCI-H596細胞[15]中IDO mRNA和蛋白的表達以及犬尿氨酸的形成。有研究表明，在早孕婦女的絨毛及蛻膜中，IL-6可上調IDO的表達，但其上調IDO表達的分子機制仍需要進一步的研究[8]。

本實驗對早孕婦女的絨毛及蛻膜組織進行檢測，結果表明，人早孕絨毛和蛻膜組織均表達 IDO蛋白，這與以往的報道的類似[10,16-17]。 有學者發(fā)現(xiàn)，STAT1蛋白可在正常足月胎盤組織的滋養(yǎng)細胞中表達，并與該細胞的活力和侵襲力有關[18-19]；本研究表明，STAT1 蛋白可在人的正常早孕絨毛和蛻膜組織表達。本研究中，在培養(yǎng)的正常早孕絨毛和蛻膜組織中，IL-6均能以劑量依賴性方式增加培養(yǎng)的絨毛和蛻膜中IDO和STAT1的表達，這與經(jīng)典的IL-6信號通路顯示的IL-6上調STAT1的表達一致[20-21]。人類IDO蛋白的組成成分較多，主要包括催化亞單位和非催化亞單位，分別為C 端和N 端，同時還包括一個對兩者進行連接的環(huán)。IDO非催化亞單位含有兩個功能性的免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIMs，基本結構為 I/V/L/SxYxxL/ V/F (I：Ile，V：Val，L：Leu ，S：Ser ，Y：Tyr，F(xiàn)：Phe)[22]。ITIM中的酪氨酸發(fā)生磷酸化后，可被含有SH2結構域的分子所結合[23]；IDO通過其ITIM與SHP-1/2[22](含1個SH2結構域的蛋白質酪氨酸磷酸酶為SHP-1，含2個SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶為SHP-2)結合后，上調IDO自身的表達，SHP-1/2的表達越高，IDO的表達就越高。本研究表明，在早孕婦女的絨毛及蛻膜組織中，IL-6均能以劑量依賴性方式增加培養(yǎng)的絨毛和蛻膜中 SHP-1/2 的表達，且IDO的表達 與SHP-1、SHP-2及STAT1的表達呈正相關，STAT1的表達與SHP-1/2的表達呈正相關；提示IL-6同時上調IDO、SHP-1/2 和STAT1的表達，IL-6通過上調 STAT1的表達來上調的IDO的表達。基于STAT1可招募SHP-1/2并增加SHP1/2 的表達[24-25]；SHP-1/2與IDO 結合后上調IDO的表達[21]； 本研究推測，在正常早孕絨毛和蛻膜組織中，IL-6可能通過上調STAT1的表達來上調SHP-1/2表達，進而上調IDO的表達。