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    桔梗皂苷D治療肥胖的潛在作用機(jī)制研究*

    2022-11-16 07:25:00王賢鐘沁劉芳韋睿然桂黎明
    關(guān)鍵詞:脂肪組織靶點(diǎn)脂肪

    王賢, 鐘沁, 劉芳, 韋睿然, 桂黎明*

    (1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室, 貴州 貴陽(yáng) 550000; 2.安徽醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 安徽 合肥 230031)

    肥胖是一類慢性代謝性疾病,與許多疾病密切相關(guān),包括脂代謝紊亂、胰島素抵抗、2 型糖尿病、肝膽疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性心臟病等[1-6]。世界肥胖問(wèn)題工作小組采用身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)作為超重與肥胖的判定標(biāo)準(zhǔn)[7],BMI ≥28 kg/m2時(shí),即可判定為肥胖,肥胖的患病率正呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì),已經(jīng)成為世界健康問(wèn)題之一。據(jù)估計(jì),未來(lái) 20 年肥胖仍會(huì)持續(xù)增長(zhǎng)[8],因此解決并改善肥胖問(wèn)題刻不容緩。目前,主要通過(guò)飲食運(yùn)動(dòng)療法、抗肥胖藥物、外科手段減輕肥胖,但效果均不理想[9-12]。桔梗皂苷 D (platycodin D,PD)是從傳統(tǒng)中藥桔梗里提取的一種三萜類單體的皂苷成分,在桔梗里含量相對(duì)較高且為其主要生物活性成分,具有抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等多種藥理作用[13-14]。相關(guān)研究表明,PD 能抑制胰脂肪酶活性,從而抑制腸道對(duì)食物脂肪的吸收[15];動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,PD 通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪生成和產(chǎn)熱來(lái)減輕 db/db 小鼠的肥胖[16]。小鼠成纖維 3T3-L1細(xì)胞是一種特征明確的前脂肪細(xì)胞,具有從前體細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的潛力[17],是體外研究脂肪酸代謝和肥胖的成熟細(xì)胞模型[18-21]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)PD 干預(yù)肥胖的分子靶點(diǎn)與潛在作用機(jī)制,并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證PD 抑制 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)制,觀察促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞生成的關(guān)鍵基因-固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FAS)的mRNA和蛋白的表達(dá)水平[22-24],為肥胖治療的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1細(xì)胞來(lái)源 小鼠成纖維 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞株來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)(SCSP- 5038)。

    1.1.2藥物 PD粉末純度98.34%(MCE, HY-N1411),使用 DMSO配制成 10 mmol/L 的母液備用。

    1.1.3主要試劑與儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基(GIBCO, 美國(guó)),新生小牛血清(Ausbian,澳大利亞),胎牛血清(Vistech, 丹麥),青/鏈霉素、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺(GIBCO, 美國(guó)),Dexamethasone、IBMX、Rosiglitazone(Sigma-Aldrich,美國(guó)),Insulin(Solarbio,中國(guó)),CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Biosharp,中國(guó)),油紅 O 染色試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Solarbio,中國(guó)),RNA 快速提取試劑盒、快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Super SYBR qPCR Master MIX(ES science,中國(guó)),一抗蛋白(SREBP-1c、FAS)、二抗蛋白(Affinity,中國(guó))。多功能酶標(biāo)儀(Bio-tek,美國(guó)),倒置熒光顯微鏡(Leica,德國(guó)),實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad,美國(guó)),蛋白化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國(guó))。

    1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接分析

    1.2.1藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò) Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取PD 的 Smiles 結(jié)構(gòu)式,文件以 SDF 格式保存并導(dǎo)入 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstarget-prediction.ch/index.php)進(jìn)行活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè),以“小鼠”為研究物種收集靶點(diǎn),去除重復(fù)項(xiàng),整理這些靶點(diǎn)的蛋白名稱、基因名稱及 UniPort ID 等信息。

    1.2.2肥胖的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在 Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)中輸入關(guān)鍵詞 “obesity” 作為檢索條件,并將篩選條件設(shè)置為score≥20,收集并整理 3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同收錄的肥胖相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

    1.2.3PD與肥胖的共同靶點(diǎn)篩選 將獲取的藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)輸入微生信在線平臺(tái),獲得兩者靶點(diǎn)蛋白交集的維恩圖。

    1.2.4蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用 STING 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://stringdb.org/cgi/input.pl)對(duì)獲取的藥物—疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析[25],本研究設(shè)定最小互作分?jǐn)?shù)值≥0.7,篩選潛在作用核心靶點(diǎn),并應(yīng)用 Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化處理。

    1.2.5GO功能與KEGG富集分析 通過(guò) R軟件(https://www.rproject.org)對(duì)藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行 基因本體分析(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析[26]。基因名稱選擇為“OFFICE_GENE_SYMBOL”,選擇 GO 功能中的生物過(guò)程(biological processes,BP)、分子功能(molecular functions,MF)和細(xì)胞組分(cellular components,CC)3 個(gè)參數(shù)對(duì)基因進(jìn)行富集;使用 R 語(yǔ)言進(jìn)行 KEGG 通路富集分析,根據(jù)調(diào)整后的P值(P<0.05)進(jìn)行排序。通過(guò)微生信進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理,得到條形圖及氣泡圖。

    1.2.6藥物-靶點(diǎn)-通路可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物與疾病共同基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org)軟件構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖,以網(wǎng)絡(luò) degree、betweenness centrality和 Closeness 為篩選條件,挖掘網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點(diǎn)。

    1.2.7分子對(duì)接 在 Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載PD活性成分的 2D 結(jié)構(gòu)圖,通過(guò) PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)的配體結(jié)構(gòu),使用 Autodock Vina 對(duì)接每個(gè)成分和配體,獲取結(jié)合能最高的位點(diǎn),最后使用 PyMol 軟件(https://pymol.org/)對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)可知,結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的對(duì)接分?jǐn)?shù)表明該化合物與靶點(diǎn)之間具有良好的結(jié)合活性,且結(jié)合能越小代表二者間結(jié)合的活性越好。

    1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

    1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞在 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中用完全培養(yǎng)基(高糖DMEM培養(yǎng)基+10%新生小牛血清+1%青鏈霉素+1%丙酮酸鈉+1%非必需氨基酸+1% L-谷氨酰胺)進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

    1.3.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8)法測(cè)定細(xì)胞存活率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 3T3-L1細(xì)胞,按 1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于 96 孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),第2天加入5、10、20、40、60及80 μmol/L PD,每個(gè)濃度設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔,另設(shè)對(duì)照組(不加 PD)與空白組(僅含培養(yǎng)基,不含 PD,不接種細(xì)胞),分別處理24、48及72 h,取CCK-8溶液10 μL加到96孔板,溫育2 h ,采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處細(xì)胞吸光度值(optical density, OD)。

    1.3.3細(xì)胞凋亡率 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),將細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),加入5、10、20、40、60及80 μmol/L PD分別處理 24、48及72 h;取胰酶100 μL消化貼壁細(xì)胞,加入 1 mL 培養(yǎng)基終止消化并吹打均勻,細(xì)胞懸液收集至EP 管中,4 ℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清;加入 PBS 重懸 1 次,去離子水按照1 ∶3稀釋結(jié)合緩沖液,用1×Binding buffer 重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)濃度為1×109個(gè)細(xì)胞/L;取細(xì)胞懸液100 μL 加入5 mL 的流式管,加入 Annexin V- Alexa flour647 染液5 μL,混勻后室溫避光培養(yǎng)5 min,再加入20 mg/L PI 染液10 μL,加入 PBS 400 μL,立刻進(jìn)行流式檢測(cè),收集數(shù)據(jù)并分析。

    1.3.43T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 3T3-L1細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí),根據(jù) Zebisch 等[24]的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,先將1 mg/L Insulin、0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L Dexamethasone 及2 μmol/L Rosiglitazone 同時(shí)加入高糖 DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素)中誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞 48 h,再用僅含1 mg/L Insulin 的培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)48 h,最后換用不添加任何誘導(dǎo)成分的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,直至鏡下出現(xiàn)脂滴。在分別給予5、10及20 μmol/L PD處理細(xì)胞,并設(shè)對(duì)照組(不加PD)。收集誘導(dǎo)完成后的細(xì)胞,采用油紅O染色檢測(cè) PD細(xì)胞中脂滴的積累情況,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度 PD 對(duì)SREBP-1c、FAS的 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響。

    1.3.5油紅O染色 去除培養(yǎng)基、PBS 洗滌、固定液固定細(xì)胞 25 min、去除固定液,使用雙蒸水洗滌 2 次,加入 60% 異丙醇浸洗 5 min,棄去異丙醇后直接加入新鮮配制好的油紅 O 染色工作液,浸染 30 min;染色完畢后,雙蒸水洗滌 5 次,每孔加入雙蒸水覆蓋細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

    1.3.6RT-qRCR 檢測(cè)SREBP-1c、FASmRNA表達(dá) 使用RNA快速提取試劑盒提取總RNA,同時(shí)測(cè)定RNA純度與濃度,隨后將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件為設(shè)定為42 ℃ 15 min; 最后使用2× Super SYBR green qPCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),條件設(shè)定為95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。SREBP-1c 上游引物序列為5′- GACGAC-GGAGCCATGGATT -3′,下游引物序列為 5′-CAGCAGTGAGTCTGCCTT-GAT -3′, 目的片段672 bp;FAS 上游引物序列為5′- GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3′,下游引物序列為 5′- TGGG-TAATCCATAGAGCCCAG -3′,目的片段140 bp;內(nèi)參照β-actin 上游引物序列為5′- CATGTACGTTGCT-ATCCAGGC -3′,下游引物序列為5′- CTCCTTAATGTCACGCACG-AT -3′, 目的片段250 bp。

    1.3.7Western blot 檢測(cè) SREBP-1c、FAS 蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液(含1% PMSF)裂解細(xì)胞提取總蛋白,BCA 蛋白濃度檢測(cè)定量各組總蛋白濃度;采用10%的 SDS-PAGE 凝膠分離蛋白,隨后轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上,5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h,TBST洗滌后,SREBP-1c、FAS蛋白一抗(1 ∶1 000)4 ℃ 孵育過(guò)夜,TBST 洗滌后,二抗(1 ∶3 000)室溫孵育 1.5 h,TBST 洗滌后,ECL 顯影后應(yīng)用 Image Lab 軟件分析條帶的灰度值。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接分析

    2.1.1PD潛在作用靶點(diǎn)篩選 通過(guò) STD、HERB、SuperPred PharmMapper、SwissTargrtPrediction、SEA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),共找到 539 個(gè)靶點(diǎn),使用 UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范命名并排除重復(fù)靶點(diǎn),共獲得 438 個(gè)靶點(diǎn)。

    2.1.2肥胖潛在靶點(diǎn)獲取 在 TTD、 GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與肥胖相關(guān)的靶點(diǎn),合并去除重復(fù)后共得到 1 104 個(gè)疾病靶點(diǎn)。

    2.1.3PD與肥胖交集靶點(diǎn) 將獲得的PD靶點(diǎn)與肥胖疾病靶點(diǎn)上傳微生信在線平臺(tái),靶點(diǎn)合并取交集得到維恩圖,獲得 131 個(gè)交集靶點(diǎn)(圖1)。

    圖1 藥物與肥胖共同靶點(diǎn)韋恩圖

    2.1.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心蛋白的篩選 將藥物與疾病的131個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)得到 txt 文本文件,隨后將文本導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行分析和可視化處理(圖2),網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示,PPI網(wǎng)絡(luò)共含有124個(gè)節(jié)點(diǎn),1 794條邊。采用 Cytohubba 插件中的MCC算法,根據(jù)度值共獲得10個(gè)核心靶點(diǎn)基因,包括包括蛋白激酶B α(protein kinase B α,AKT1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription,STAT3)、腫瘤蛋白53(tumor protein p53,TP53)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)白介素6(Interleukin-6,IL6)等(表1)。

    圖2 PD治療肥胖的“藥物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

    表1 PD治療肥胖的潛在核心靶點(diǎn)

    2.1.5PD對(duì)肥胖作用靶點(diǎn)的生物學(xué)分析 使用R軟件對(duì)PD對(duì)肥胖作用靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能富集分析,共獲得2 614個(gè)GO條目(P<0.05),分別選取BP、CC MF的Count值排名前十的條目(圖3)。BP條目有2 444個(gè),其中包括營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)(response to nutrient levels)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to oxidative stress)、肌肉細(xì)胞增殖(muscle cell proliferation)、類固醇激素反應(yīng)(response to steroid hormone)及脂多糖反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)等; CC條目有 27 個(gè),其中包括細(xì)胞質(zhì)膜(membrane raft)、常染色質(zhì)(euchromatin)、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(RNA polymerase Ⅱ transcription regulator complex)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)及微膜區(qū)(membrane microdomain)等; MF條目有 143 個(gè),包括核受體活性(nuclear receptor activity)、類固醇結(jié)合(steroid binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA binding transcription factor binding)及轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合(transcription coregulator binding)等。根據(jù)P<0.05 進(jìn)行 KEGG 通路富集,共獲得 154 條相關(guān)通路,選取P值排名靠前的 20 條通路利用微生信制作氣泡圖(圖4),得到PD 治療肥胖的主要信號(hào)通路包括酒精性肝病(alcoholic liver disease)、胰島素抵抗(insulin resistance)、AMPK 信號(hào)通路(AMPK signaling pathway)(圖5)、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、HIF-1 信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(adipocytokine signaling pathway)及AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway)等。

    圖3 PD治療肥胖核心靶點(diǎn)的 GO 功能富集分析

    圖4 KEGG 功能富集分析

    圖5 PD治療肥胖癥作用的 AMPK 信號(hào)通路

    2.1.6PD-肥胖靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將PD和肥胖癥共同靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2 軟件,獲得P D-靶點(diǎn)-肥胖網(wǎng)絡(luò)(圖6),該網(wǎng)絡(luò)共有 152 個(gè)節(jié)點(diǎn)、560 條邊。

    注:圖中深灰色代表PD,其他代表PD 的相關(guān)靶點(diǎn)及信號(hào)通路,邊代表兩者之間的關(guān)系。

    2.1.7分子對(duì)接結(jié)果分析 為了從分子水平闡明PD 與關(guān)鍵白蛋靶點(diǎn) AMPK、SREBP1c、FAS 的作用模式,通過(guò)Autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能見(jiàn)表 2,由此可知蛋白與化合物對(duì)接相互作用的結(jié)合能在 -10.2~-8.8 kcal/mol,提示本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)與結(jié)果較為可靠,具有較高的參考價(jià)值。圖7為PD與肥胖核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接模式圖。

    表2 PD 與關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)結(jié)合能

    注:A、B、C依次為 AMPK、SREBP-1c、FAS 對(duì)接結(jié)果。

    2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

    2.2.13T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率 CCK-8結(jié)果顯示(圖 8),使用不同濃度 PD 處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞 24、48及72 h,PD<20 μmol/L對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用(細(xì)胞存活率均在90% 以上);PD>20 μmol/L細(xì)胞毒作用明顯增強(qiáng),細(xì)胞存活率明顯降低 (P<0.001),表明 PD 抑制細(xì)胞增殖作用呈濃度依賴性。因此,選擇 20 μmol/L PD作為最大給藥濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)在該濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。

    注:(1)與對(duì)照組相比,P<0.001。

    2.2.2PD對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡的影響 收集培養(yǎng)24、48及72 h 的細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè),結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比, 5、10及20 μmol/L PD 分別連續(xù)培養(yǎng)72 h,3T3-L1前脂肪細(xì)胞始終能夠保持較高的細(xì)胞活性,未發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡(圖9)。

    注:A 為凋亡率流式圖,B 為凋亡率線形圖;(1)與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組相比,P<0.01。

    2.2.3PD對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響 結(jié)果顯示:對(duì)照組3T3-L1前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后出現(xiàn)大量脂滴;在5、10及20 μmol/L PD處理細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)也出現(xiàn)數(shù)量不等的脂滴,并且隨著PD濃度的增加,脂滴數(shù)量逐漸減少,其中,20 μmol/L組中的脂滴含量最少,與對(duì)照組的脂滴含量相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。提示PD 呈濃度效應(yīng)抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化(圖10)。

    圖10 不同濃度 PD 對(duì) 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化影響

    2.2.4不同濃度PD對(duì)SREBP-1c和FASmRNA表達(dá)的影響SREBP-1c和FAS是促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞生成的關(guān)鍵基因,因此,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討PD抑制3T3-L1細(xì)胞分化過(guò)程中這兩種基因的表達(dá)情況。RT-qPCR 結(jié)果顯示(圖 11),與對(duì)照組比較,PD各濃度組的SREBP-1c、FASmRNA表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)(P<0.01),且SREBP-1c、FASmRNA表達(dá)量隨著PD濃度的增加而逐漸減低,其中PD為20 μmol/L時(shí)降低最為顯著。提示 PD 在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中,能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞中SREBP-1c、FASmRNA表達(dá)量來(lái)抑制3T3-L1細(xì)胞分化成為成熟脂肪細(xì)胞。

    注:(1)與對(duì)照組相比,P<0.01。

    2.2.5不同濃度PD對(duì)SREBP-1c與FAS蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示(圖 12),與對(duì)照組比較,SREBP-1c、FAS蛋白表達(dá)量隨著PD濃度的升高呈現(xiàn)不同程度的下調(diào),并且與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示PD在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中,能夠通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中SREBP-1c、FAS蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制3T3-L1細(xì)胞分化。

    注:(1)與對(duì)照組相比,P<0.01。

    3 討論

    肥胖的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜且涉及多通路的過(guò)程,各因子與因子之間、因子與通路之間形成一個(gè)相互影響、聯(lián)系緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。目前,抗肥胖治療并不樂(lè)觀,但隨著中草藥研究的進(jìn)展,這一情況正逐漸得到改善。中藥療法注重整體觀和辨證論治原則,根據(jù)不同時(shí)期癥型選擇選擇不同治療方法,標(biāo)本兼治,且中藥藥性溫和,相對(duì)安全。中藥因其本身含有多種活性成分,毒效應(yīng)小,具有多效應(yīng)、多靶點(diǎn)及多通路途徑協(xié)同調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)。桔梗是我國(guó)傳統(tǒng)重要的藥用資源之一,桔梗屬于桔梗科植物Grandiflorum(Jacq.) A.DC.的干燥根[27],含有多種活性成分與較高的生物活性,其本身具有利咽、祛痰、抗炎、降糖及提高免疫力等功能,廣泛用于癌癥、哮喘、炎癥及糖尿病腎病等方面的治療與研究[28-29]。相關(guān)研究表明,桔梗的活性組成部分桔??傇磉熬哂幸种埔戎久富钚宰饔肹30]。

    在本研究中,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桔梗的主要活性成分PD 對(duì)肥胖的分子靶點(diǎn)及潛在作用機(jī)制,通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證。維恩圖交集結(jié)果顯示PD 對(duì)肥胖可能起到作用的靶點(diǎn)共131個(gè),推測(cè)PD 是通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮治療肥胖作用的。PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析可知,AKT1、EGFR、VEGFA、TP53、STAT3 靶點(diǎn)的自由度值較高,推測(cè)這些核心靶點(diǎn)可能在抗肥胖治療中起到關(guān)鍵作用。AKT1 是胰島素樣生長(zhǎng)因子 1 受體在脂肪細(xì)胞克隆擴(kuò)增后分化過(guò)程中重要的信號(hào)分子,在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面具有重要作用[31]。TNF 和 IL6 是重要的免疫炎癥調(diào)節(jié)因子,促炎因子的表達(dá)與肥胖造成的一系列免疫不良反應(yīng)密切相關(guān),TNF-α 會(huì)阻礙胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),而 IL6 具有加重胰島素抵抗的作用[32]。GO 與 KEGG 生物學(xué)分析結(jié)果表明,PD 可通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路影響肥胖的發(fā)生與發(fā)展。糖脂代謝相關(guān)通路與肥胖密切相關(guān),其中,AMPK 信號(hào)通路是調(diào)控脂質(zhì)代謝關(guān)鍵的通路之一,AMP依賴的蛋白激酶磷酸化后通過(guò)下調(diào)其下游脂肪生成相關(guān)基因,如 SREBP-1c、FAS 等,從而降低肥胖的發(fā)生[33]。此外PD與胰島素抵抗信號(hào)通路、脂肪因子信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路等與糖脂代謝相關(guān)的通路均具有聯(lián)系。分子對(duì)接結(jié)果顯示,PD 與 AMPK 的結(jié)合活性最好(-10.2 kcal/mol),隨后是與 FAS(-9.0 kcal/mol)、SREBP-1c(-8.8 kcal/mol),由對(duì)接模型初步驗(yàn)證PD 可能通過(guò) AMPK 信號(hào)通路發(fā)揮抗肥胖作用機(jī)制。

    與肥胖關(guān)系最密切的是體內(nèi)脂肪組織。脂肪組織是機(jī)體的能量?jī)?chǔ)存器官,也是機(jī)體重要的內(nèi)分泌器官,能夠分泌多種細(xì)胞因子。正常情況下,脂肪組織具有產(chǎn)熱、體溫維持、內(nèi)分泌及支持等功能,有利于身體的能量平衡。目前,哺乳動(dòng)物體內(nèi)的脂肪組織按形態(tài)特征可分為白色脂肪組織、棕色脂肪組織和米色脂肪組織。白色脂肪組織內(nèi)的白色脂肪細(xì)胞是其主要的細(xì)胞類型,是機(jī)體主要的脂肪庫(kù)。棕色脂肪組織內(nèi)含豐富的線粒體,為機(jī)體重要的適應(yīng)性產(chǎn)熱器官。米色脂肪組織是二者之間轉(zhuǎn)化過(guò)度的中間體,功能類似于棕色脂肪組織。SREBP-1 是白色脂肪組織產(chǎn)脂基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子,SREBP-1c 是主要亞型,在肝臟和白色脂肪細(xì)胞中表達(dá),通過(guò)激活甘油三酯合成基因進(jìn)而促進(jìn)脂肪的生成[34]。FAS 是介導(dǎo)白色脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯合成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白,催化脂肪從頭合成。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明,脂肪組織中 FAS 的表達(dá)量與甘油三酯和脂肪合成呈正相關(guān),且 FAS 出現(xiàn)在細(xì)胞分化為成熟脂肪過(guò)程的中、后期,其下調(diào)能減少脂滴的生成[35]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),PD 在20 μmmol/L 安全范圍內(nèi)能夠下調(diào)細(xì)胞中SREBP-1c、FAS 的表達(dá),抑制脂肪細(xì)胞脂滴生成,并且具有濃度效應(yīng)。

    綜上所述,本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接角度上闡述了PD 對(duì)肥胖的分子靶點(diǎn)及潛在作用機(jī)制,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PD 可抑制前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化為成熟脂肪細(xì)胞,其機(jī)制與下調(diào)脂肪生成關(guān)鍵因子 SREBP-1c、FAS 的表達(dá)有關(guān),但 PD 抑制脂肪生成相關(guān)蛋白信號(hào)通路仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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