牛奶蛋白過敏嬰兒腸道菌群動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)

李心悅 王 碩 張 華 李在玲

北京大學(xué)第三醫(yī)院 1.兒科，2.臨床流行病學(xué)研究中心（北京 100191）

牛奶蛋白過敏（cow’s milk protein allergy，CMPA）是兒童早期最常見的食物過敏之一，在3歲以下的兒童中發(fā)病率高達(dá)2%～3%[1]。CMPA影響兒童正常生長(zhǎng)發(fā)育，加重家庭的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。食物過敏的發(fā)生機(jī)制是腸道黏膜無法對(duì)食物抗原建立正常的免疫耐受，可能與腸道微生態(tài)失衡密切相關(guān)[2]。研究表明，CMPA 患兒與健康兒童的腸道菌群在多樣性、豐度及構(gòu)成等方面均存在差異[3-4]。眾所周知，腸道菌群是動(dòng)態(tài)發(fā)展的，生命早期的腸道菌群變化似乎會(huì)影響食物過敏的結(jié)局[5-6]。但目前多為橫斷面研究，因此需要對(duì)CMPA 患兒進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪。本研究通過監(jiān)測(cè)CMPA 患兒對(duì)牛奶蛋白的耐受情況，分析此過程中糞便菌群的變化，為明確腸道微生物改變與CMPA 的關(guān)系提供線索，為尋找縮短CMPA病程的措施提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年9月至2021年3月在北京大學(xué)第三醫(yī)院兒科門診就診，診斷為CMPA 的患兒為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡0～12月；②符合CMPA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：具備以下任意一項(xiàng)則排除出組，①無CMPA 相關(guān)癥狀；②隨訪過程中應(yīng)用抗生素、全身性糖皮質(zhì)激素、益生菌、益生元等藥物；③家中飼養(yǎng)寵物；④患有急慢性疾病，如感染性疾病、肝腎功能不全、血液病、自身免疫性疾病、先天性疾病、遺傳代謝性疾病等。選擇同期健康體檢的兒童作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡0～12月；②無過敏相關(guān)臨床表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：具備以下任意一項(xiàng)則排除出組，①父母任意一方有過敏史；②隨訪過程中應(yīng)用抗生素、全身性糖皮質(zhì)激素、益生菌、益生元等藥物；③家中飼養(yǎng)寵物；④家長(zhǎng)依從性差。

在隨訪過程中，根據(jù)牛奶蛋白口服食物激發(fā)試驗(yàn)（oral food challenge，OFC）結(jié)果，將陰性的CMPA兒童歸入耐受組，陽性則歸入過敏組。

本研究通過北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理審查（2020倫審第332-01號(hào)），家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CMPA 診斷標(biāo)準(zhǔn) 采用2017、2019 年《國(guó)際牛奶蛋白過敏基層醫(yī)療指南》（International Milk Allergy in Primary Care，iMAP）[7-8]及2017年中國(guó)《食物過敏相關(guān)消化道疾病診斷與管理專家共識(shí)》[9]提出的CMPA診斷標(biāo)準(zhǔn)：①攝入牛奶或奶制品后出現(xiàn)以下1項(xiàng)或多項(xiàng)臨床表現(xiàn)，包括腹瀉、便血、吐奶、拒奶、皮疹、咳嗽、喘鳴、哭鬧不安、睡眠不好、體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢；②牛奶蛋白回避后癥狀減輕或消失，再引入后癥狀加重或再次出現(xiàn)；③以下實(shí)驗(yàn)室檢查有1項(xiàng)或多項(xiàng)陽性，血清過敏原特異性IgE（＞0.35 kU/L），開放性口服牛奶蛋白激發(fā)試驗(yàn)[10]，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)（鮮奶或配方奶的風(fēng)團(tuán)直徑較陰性對(duì)照≥3 mm）。

1.2.2 隨訪 CMPA組兒童予氨基酸奶粉喂養(yǎng)，并進(jìn)行為期6個(gè)月的隨訪，分別在第0、2周及第1、3、6個(gè)月時(shí)留取糞便，糞便采集于無菌凍存管后，2 h內(nèi)置-80 ℃保存?zhèn)溆?。隨訪下列內(nèi)容：評(píng)估臨床癥狀，有無添加輔食，有無應(yīng)用抗生素、全身性糖皮質(zhì)激素、益生菌、益生元等藥物。在第1、3、6個(gè)月時(shí)，若患兒癥狀減輕或消失則進(jìn)行牛奶蛋白OFC以評(píng)估免疫耐受是否建立。對(duì)照組兒童入組時(shí)留取糞便1次。

1.2.3 腸道菌群16SrRNA高通量測(cè)序 提取研究對(duì)象糞便樣本基因組DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量、濃度和純度；合格后使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3'）和806 R（5'-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3'）對(duì)16 SrRNA 基因V 3-V 4 可變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，采用2%瓊脂糖凝膠電泳和QuantusTMFluorometer（Promega，USA）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，美國(guó)）建庫。合格后予Illumina Miseq PE 300/NovaSeq PE250測(cè)序儀測(cè)序。

1.2.4 分類學(xué)分析 采用fastp 軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE 軟件根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行 OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP分類學(xué)注釋工具（RDA classifier）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 Alpha 多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性。其中，ace、chao、shannon、shannoneven、pd等指數(shù)能夠反映群落豐富度、多樣性和均勻度。Beta多樣性反映不同樣本群落結(jié)構(gòu)的相似性或差異關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法檢驗(yàn)。在基線水平對(duì)兩組樣本進(jìn)行基于Bray-Curtis距離算法的主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），組間群落組成差異采用Anosim檢驗(yàn)。LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析用于檢測(cè)不同組間的物種豐度差異，獲得顯著差異物種后再采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）來估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果影響的大小。多個(gè)相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗(yàn)應(yīng)用Friedman檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

CMPA組符合入選標(biāo)準(zhǔn)共98例，其中失訪或中途退出24例，家中飼養(yǎng)寵物1例，應(yīng)用抗生素、全身性糖皮質(zhì)激素、益生菌、益生元23例，最終入組50例。對(duì)照組78例，失訪或中途退出16例，其中父母有過敏史24例，應(yīng)用抗生素、全身性糖皮質(zhì)激素、益生菌、益生元18例，最終入組20例。

CMPA 組與對(duì)照組之間月齡、性別、出生體重、分娩方式、入組時(shí)喂養(yǎng)方式差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組兒童基線資料具有可比性，見表1。

表1 對(duì)照組和CMPA組一般資料比較

2.2 CMPA組與對(duì)照組腸道菌群Alpha及Beta多樣性分析

比較兩組基線水平的腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，CMPA組的Shannon指數(shù)及Shannoneven指數(shù)較對(duì)照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。Anosim檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組樣本間群落組成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R=0.26，P=0.001）。見圖1。

表2 兩組Alpha多樣性指數(shù)比較[M(P25～P75)，(x±s)]

圖1 兩組Beta 多樣性分析結(jié)果（主坐標(biāo)分析)

2.3 CMPA組與對(duì)照組腸道菌群物種組成

對(duì)照組在門水平上相對(duì)豐度較高的菌群依次為放線菌門、厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門；CMPA組放線菌門的相對(duì)豐度明顯降低，厚壁菌門的相對(duì)豐度升高。屬水平上，對(duì)照組中雙歧桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，其他相對(duì)豐度較高的菌群為布勞特菌屬、克雷伯菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬、埃希菌屬、瘤胃球菌屬、乳桿菌屬；而CMPA組中，雙歧桿菌屬不再是優(yōu)勢(shì)物種，除了梭菌屬的相對(duì)豐度較高外，腸球菌、鏈球菌、克雷伯菌、埃希菌屬等條件致病菌的相對(duì)豐度升高。見圖2。

圖2 CMPA 組與對(duì)照組物種組成分析結(jié)果

通過LEfSe多級(jí)物種差異分析及LDA線性判別分析找出兩組的差異物種，結(jié)果顯示，對(duì)照組中放線菌門、雙歧桿菌科、巴氏桿菌科、雙歧桿菌屬、流感嗜血桿菌屬、普氏糞植桿菌屬為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物種（LDA=4.07～5.35，P＜0.05），其中雙歧桿菌科影響較大。CMPA 組中厚壁菌門、芽孢桿菌綱、梭菌綱、腸球菌科、消化鏈球菌科、腸球菌屬、梭菌屬、羅氏菌屬（Rothia）、Intestinibacter、瘤胃球菌屬為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物種（LDA=3.93～5.24，P＜0.05），其中厚壁菌門、芽孢桿菌綱、梭菌綱、腸球菌科影響較大，見圖3。

圖3 CMPA 組與對(duì)照組物種差異分析結(jié)果

2.4 CMPA組兒童治療及轉(zhuǎn)歸

隨訪至1個(gè)月時(shí)，50例患兒檢測(cè)OFC，陰性12例，提示24.0 %的患兒牛奶蛋白耐受；隨訪至3個(gè)月時(shí)，OFC 陽性的38 例患兒再次檢測(cè)OFC，轉(zhuǎn)為陰性12例，共48.0%患兒建立免疫耐受；隨訪至6個(gè)月時(shí)，OFC仍陽性的26例復(fù)查OFC，陰性14例，共76.0%患兒建立免疫耐受，還有12例（24.0%）患兒仍然存在CMPA。

2.5 CMPA 兒童治療過程中耐受組與過敏組腸道菌群物種差異

隨訪2 周及1 個(gè)月時(shí)兩組間未出現(xiàn)差異物種。隨訪3 個(gè)月時(shí)兩組開始出現(xiàn)差異物種，主要以過敏組中厚壁菌門、梭菌綱、毛螺菌科相對(duì)豐度高為特點(diǎn)（LDA=5.11～5.16，P＜0.01）。見圖4。這種差異在隨訪6 個(gè)月時(shí)進(jìn)一步增大，過敏組中除了前述的厚壁菌門、梭菌綱、毛螺菌科外，還包括Erysipelatoclostridiaceae、瘤胃球菌屬、毛霉菌屬（Erysipelatoclostridium），均為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物種（LDA=4.22～5.19，P＜0.05）；同時(shí)，耐受組中放線菌綱、雙歧桿菌科、葡萄球菌科、雙歧桿菌屬、葡萄球菌屬為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物種（LDA=4.34～5.14，P＜0.05），其中放線菌綱、雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬相對(duì)豐度明顯高于過敏組。見圖5。

圖4 耐受組與過敏組隨訪1、3 個(gè)月物種差異分析結(jié)果

圖5 耐受組與過敏組半年后物種差異分析結(jié)果

2.6 CMPA耐受組患兒腸道菌群動(dòng)態(tài)變化

耐受組在屬水平上隨著時(shí)間延長(zhǎng)豐度逐漸增加的物種有：雙歧桿菌屬（P＜0.001）、瘤胃球菌屬（P=0.006）、布勞特菌屬（P＜0.001）、普氏糞植桿菌屬（P=0.002）；隨著隨訪時(shí)間延長(zhǎng)豐度減少的物種有：腸球菌屬（P＜0.001）、克雷伯菌屬（P＜0.001）、腸桿菌屬（P=0.004）。提示雙歧桿菌屬等益生菌的豐度增加，機(jī)會(huì)致病菌的豐度逐漸減少。見圖6。

圖6 耐受組隨訪過程中物種差異分析

3 討論

腸道微生物群的形成發(fā)生在生命的早期，其成熟速度具有個(gè)體差異，是動(dòng)態(tài)可變的[11-13]。12月齡內(nèi)的嬰兒是CMPA 的高發(fā)人群，腸道菌群在該年齡段的影響因素相對(duì)可控。為深入了解CMPA患兒在生命早期以及免疫耐受逐漸建立的過程中腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，本研究納入50 例12 月齡內(nèi)的CMPA患兒，與同期的20例健康兒童作對(duì)照。Alpha多樣性分析表明，CMPA 組腸道微生物群落的均勻度及多樣性均較對(duì)照組顯著增高，與既往研究結(jié)果相同[4]。提示CMPA組腸道菌群成熟度可能高于健康兒童，而腸道微生物群落提前成熟可能并不利于腸道對(duì)食物免疫耐受的早期建立。

Beta多樣性分析提示兩組兒童腸道微生物群落構(gòu)成存在顯著差異。對(duì)照組以放線菌門為主，其中雙歧桿菌科占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；CMPA組放線菌門、雙歧桿菌科的相對(duì)豐度明顯降低，反而是厚壁菌門的相對(duì)豐度升高。其中，CMPA組中腸球菌科等機(jī)會(huì)致病菌的豐度明顯增加，提示CMPA 患兒腸道微生物群落組成處于失衡狀態(tài)。相關(guān)研究也觀察到相似的變化，但不同的是，CMPA 組中增多的厚壁菌門主要為毛螺菌科的富集；而低雙歧桿菌科/毛螺菌科比例的微生物群組成似乎與小鼠腸道免疫系統(tǒng)向Th2方向偏移相關(guān)[4,14]。本研究CMPA 組患兒未出現(xiàn)低雙歧桿菌科/毛螺菌科比例的微生物組成變化，但在后續(xù)動(dòng)態(tài)對(duì)比過敏組與耐受組患兒的腸道菌群差異中發(fā)現(xiàn)了這種微生物組成特點(diǎn)。

CMPA患兒過敏組與耐受組的腸道菌群組成差異隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸發(fā)生。在隨訪3 個(gè)月時(shí)開始出現(xiàn)，以過敏組中厚壁菌門、梭菌綱、毛螺菌科相對(duì)豐度高于耐受組為特點(diǎn)；隨訪6個(gè)月時(shí)，這種差異進(jìn)一步加大。過敏組中除了前述差異物種外，瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度也偏高；同時(shí)，耐受組中放線菌門、雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬相對(duì)豐度開始高于過敏組。由此可見，與耐受組相比，過敏組腸道菌群逐漸出現(xiàn)低雙歧桿菌科/毛螺菌科的表現(xiàn)。

發(fā)現(xiàn)過敏組與耐受組的腸道微生物群落組成差異后，本研究進(jìn)一步探究耐受組在建立牛奶蛋白免疫耐受的過程中腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化。在屬水平上，觀察到腸球菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬等條件致病菌的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)。而雙歧桿菌屬、布勞特菌屬、瘤胃球菌屬、普氏糞植桿菌屬等的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。查閱文獻(xiàn)，在耐受組相對(duì)豐度逐漸增加的菌種中，除了雙歧桿菌為產(chǎn)乙酸菌外，其余3種均為產(chǎn)丁酸菌[15-17]。與本研究類似，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)8歲時(shí)耐受牛奶蛋白的兒童3～6個(gè)月時(shí)腸道微生物群中厚壁菌門、梭菌綱富集[6]。但是該研究并未描述屬水平差異，也未追蹤差異菌群動(dòng)態(tài)變化。另有研究發(fā)現(xiàn)，治療后的CMPA患兒腸道中布勞特菌屬、羅斯菌屬等產(chǎn)丁酸菌的相對(duì)豐度增加，認(rèn)為可通過增加產(chǎn)丁酸菌的豐度促進(jìn)免疫耐受的建立[15]。其作用機(jī)制可能為丁酸鹽可促進(jìn)黏蛋白表達(dá)、影響緊密連接蛋白的功能，從而加固腸道上皮屏障[18-19]；可誘導(dǎo)Foxp3基因的表達(dá)，影響樹突狀細(xì)胞的功能，最終促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化和產(chǎn)生[20-21]。除了報(bào)道過的布勞特菌屬，本研究在耐受組中還觀察到包括瘤胃球菌屬、普氏糞植桿菌屬在內(nèi)的其他幾種產(chǎn)丁酸菌群相對(duì)豐度逐漸增加。

值得注意的是，在過敏組中也存在產(chǎn)丁酸菌群的增多。本研究過敏組中瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度反而高于耐受組，這種差異出現(xiàn)在隨訪后期。瘤胃球菌是革蘭陽性厭氧菌，可以代謝產(chǎn)生丁酸鹽并且刺激黏蛋白的產(chǎn)生和降解，這對(duì)維持完整腸道上皮屏障至關(guān)重要，能夠降低過敏性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[22-23]?？梢?，單純產(chǎn)丁酸菌群的富集無法使CMPA 患兒對(duì)牛奶蛋白產(chǎn)生免疫耐受，還存在其他因素與產(chǎn)丁酸菌群共同參與到這個(gè)復(fù)雜的過程中。值得注意的是，兩組兒童都存在產(chǎn)丁酸菌群的富集，但僅在耐受組中觀察到雙歧桿菌屬的顯著增多。這表明雙歧桿菌與產(chǎn)丁酸菌群可能在調(diào)節(jié)免疫耐受方面存在潛在協(xié)同作用。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌能通過使T細(xì)胞極化向Th1和Treg傾斜來減少嬰兒腸道炎癥[24]；能調(diào)節(jié)腸道菌群組成，增加益生菌屬的比例，最終減輕嬰幼兒牛奶過敏癥狀[25]。因此，本研究提示產(chǎn)丁酸菌可以誘導(dǎo)免疫耐受，但還需要與雙歧桿菌等其他因素起協(xié)同作用，其具體機(jī)制有待闡明。

本研究借助高通量測(cè)序動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CMPA兒童在診治過程中腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)了CMPA 與腸道微生態(tài)的密切聯(lián)系，并對(duì)雙歧桿菌及產(chǎn)丁酸菌群在牛奶蛋白耐受過程中的變化趨勢(shì)及潛在作用機(jī)制進(jìn)行分析，為誘導(dǎo)牛奶蛋白耐受、縮短CMPA治療時(shí)間提供更可靠的思路。但本實(shí)驗(yàn)樣本量偏少，隨訪時(shí)間較短，今后可進(jìn)行大樣本及多中心研究?？赏ㄟ^宏基因組測(cè)序和代謝組學(xué)等方法更深入地探究腸道菌群及其代謝產(chǎn)物參與CMPA轉(zhuǎn)歸的具體作用機(jī)制。