基于HPLC指紋圖譜結合化學計量學評價山西藜麥的質量

胡秋霞，康 樂，何建昇，趙智勇，郭俊俊

(山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，山西太原 030012)

藜麥屬于藜科藜屬植物，是典型的假谷物代表，因其營養(yǎng)豐富、全面，被認為是唯一一種能滿足人體全部營養(yǎng)需求的谷物，亦被稱為最具有發(fā)展前景的“黃金健康食品”之一[1-3]。研究表明，藜麥中含有氨基酸、蛋白質、脂肪類、淀粉、維生素、礦物元素及多酚類、黃酮類和皂苷類等活性成分，具有很高的食用、保健、醫(yī)療、觀賞等價值，越來越受到人們的關注[4-8]。

藜麥的種植歷史悠久，源于南美，因其豐富的營養(yǎng)價值和種植的抗旱性、耐鹽堿性、耐寒性、耐貧瘠性且適應性強等特點，在許多國家得以推廣種植[9-10]。目前我國亦有十余省份正在推廣種植，尤其是山西省，作為雜糧王國，藜麥是雜糧之“特”，山西省靜樂縣更是被譽為“藜麥之鄉(xiāng)”[11]。山西的藜麥缺乏科學客觀的質量評價指標，品牌優(yōu)勢尚未形成，一些精深產品加工企業(yè)和高端產品生產企業(yè)都有采購外省原料的意向，這對山西省藜麥產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產生了消極影響。建立山西藜麥的科學客觀評價體系和產品評價標準，對山西藜麥的標準化和工業(yè)化生產具有重要的推動作用，因此，評價山西藜麥質量情況成為了一項重要工作。

為了辨別山西藜麥與其他地區(qū)藜麥是否存在差異，發(fā)現(xiàn)更多山西藜麥質量評價指標，從而更全面地評價山西藜麥質量，本研究收集了山西省不同地區(qū)不同品種藜麥試樣30余種，采用高效液相色譜(HPLC)建立了山西藜麥指紋圖譜；利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)對其進行相似度評價；基于指紋圖譜結合化學計量學，運用SPSS 22.0軟件對其進行主成分分析(PCA)和系統(tǒng)聚類分析研究(HCA)，利用SIMCA 14.1軟件對其進行偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，從而為山西藜麥質量評價提供全面的指導和理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 藜麥：從各種流通渠道購買，并與廠家核實后采購，均產自2020年，樣品編號為 S1～S31，詳見表1。

對照品(純度≥98%)：蕓香苷(批號：20210507)、根皮苷(批號：20201106)、表沒食子兒茶素(批號：20200903)、綠原酸(批號：20210531)、柚皮苷(批號：20201106)、沒食子酸(批號：20200317)、原兒茶酸(批號：20201120)、咖啡酸(批號：20201106)，均購自北京北方偉業(yè)計量技術研究院；對羥基苯甲酸(批號：PCS-210611)、異葒草素(批號：PCS-201109)、阿魏酸(批號：PCS-210803)、異阿魏酸(批號：PCS-210309)、藜蘆酸(批號：PCS210309)、肉桂酸(批號：PCS-210412)、山柰酚(批號：PCS-200710)、香蘭素(批號：PCS-210419)、香草酸(批號：PCS-201205)，均購自北京世紀奧科生物技術有限公司。

試劑：甲醇和甲酸均為色譜純，水為超純水。

1.1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀(e2695)，購自沃特世上海科技有限公司；十萬分之一分析天平(CP225D)，購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；超聲波清洗器(KQ-500E)，購自昆山市超聲儀器有限公司；刀式混合研磨儀(GM 200)，購自弗爾德萊馳(上海)貿易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備 將干燥過后的藜麥樣品研磨過0.25 mm篩，精確稱量1.000 g，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，搖勻并精確稱量后，超聲處理1 h(功率500 W，頻率40 kHZ)，取出冷卻后再補足甲醇質量，搖勻，靜置30 min，取上層清液過0.22 μm濾膜，所得濾液即為供試品液。

1.2.2 混合對照品溶液的制備 精確稱取蕓香苷、根皮苷、表沒食子兒茶素、綠原酸、柚皮苷、沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、異葒草素、阿魏酸、異阿魏酸，藜蘆酸、肉桂酸、山柰酚、香蘭素和香草酸適量，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成對照品母液，按比例稀釋得2、4、8、12、16、20 mg/L的混合對照品貯備液，經 0.22 μm 濾膜過濾后，進行HPLC分析。

1.2.3 色譜條件 安裝PE色譜柱(Quasar AQ C18柱250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長247 nm，進樣量：10 μL。流動相：甲醇(A)、0.2%甲酸溶液(B)，梯度洗脫程序見表2。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 精密度試驗 取樣品S1適量，按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進行測定，記錄指紋圖譜，以分離度較好、峰面積較大、峰位相對居中的異阿魏酸峰為參照峰，計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的相對標準偏差(RSD)。

1.2.4.2 重復性試驗 稱取樣品S1適量，平行取6份，按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液，按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進行測定，記錄指紋圖譜，以異阿魏酸峰為參照峰，計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD。

1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 稱取樣品S1適量，分別于制備后0、2、4、8、12、16、24 h，按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液，按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進行測定，記錄指紋圖譜，以32.065 min共有色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD。

1.2.4.4 加標回收率試驗 取藜麥樣品S1 6份，每份 1.00 g，置于100 mL容量瓶中，加入混合標準對照品溶液1 mL，用70%甲醇溶液定容至100 mL，同時按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液，按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進行測定，記錄表沒食子兒茶素、對羥基苯甲酸、綠原酸、異葒草素、阿魏酸、異阿魏酸、蕓香苷、根皮苷的加標回收率和RSD。

1.3 數(shù)據分析

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)繪制山西藜麥指紋圖譜，并進行相似度分析；利用統(tǒng)計分析軟件IBM SPSS 22.0對31份藜麥樣品進行聚類分析和主成分分析；利用SIMCA 14.1軟件對其進行偏最小二乘判別分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

精密度試驗結果相似度在0.999以上，各共有峰的相對保留時間RSD小于0.048%，相對峰面積RSD小于1.896%；重復性試驗中，以異阿魏酸峰為參比峰，相似度在0.999以上，各共有峰的相對保留時間RSD小于0.053%，相對峰面積RSD小于1.304%；穩(wěn)定性試驗中，相似度在0.999以上，各共有峰的相對保留時間RSD小于0.048%，相對峰面積RSD小于1.083%；加樣回收率結果相似度在0.999以上，表沒食子兒茶素、對羥基苯甲酸、綠原酸、異葒草素、阿魏酸、異阿魏酸、蕓香苷、根皮苷的回收率分別為103.95%、101.85%、102.50%、101.83%、102.10%、100.13%、101.02%、102.22%，RSD分別為4.67%、3.98%、2.84%、3.01%、2.68%、1.76%、3.83%、2.08%。結果表明，HPLC儀器精密度良好，試驗方法的重復性和穩(wěn)定性準確度良好，供試品溶液在室溫下 24 h 內穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的要求。

2.2 指紋圖譜的構建

分別取31批山西藜麥樣品，按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液，另取12 mg/L的混合對照品溶液，按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進行測定，記錄供試品和混合對照品的色譜圖。將得到的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)，選擇色譜峰分離度較好、峰面積占比較高且比較穩(wěn)定的S16為參照圖譜，中位數(shù)對照圖譜生成方式，時間窗寬度選0.15 min，然后采用多點校正進行全峰自動匹配，生成山西藜麥HPLC對照指紋圖譜，確定了22個共有峰，可以構成指紋圖譜的共有模式，結果見圖1、圖2。通過與已知標準品對照得知，圖2中6號峰是表沒食子兒茶素，7號峰是對羥基苯甲酸，9號峰是綠原酸，14號峰是異葒草素，15號峰是阿魏酸，16號峰是異阿魏酸，18號峰是蕓香苷，19號峰是根皮苷。

2.3 相似度評價

將31批藜麥樣品指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)，進行相似度分析，確定了22個共有峰。圖3為31批樣品匹配后的疊加色譜圖，相似度計算結果見表3。由表3可以看出，31批樣品的相似度除S8和S9以外其余均大于0.84，說明山西各產地藜麥有較好的一致性，可以用于綜合評價山西藜麥的整體質量。

表3 31批藜麥樣品相似度分析結果

2.4 藜麥中8種有效成分含量的測定

取31批藜麥樣品，按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液，在“1.2.3”節(jié)中的色譜條件下，測定8種有效成分的含量，測定結果見表4。

2.5 化學計量學分析結果

2.5.1 聚類分析 將31批藜麥樣品的22個共有峰的峰面積導入SPSS 22.0，利用系統(tǒng)聚類分析法，選取組間連接、平方歐氏(Euclidean)距離進行聚類分析，結果見圖4。結果顯示，當閾值T=10時，31批樣品可大致分為4類，其中S1～S6、S12、S14～S16、S18～S22、S24、S26和S27聚為一類，S7、S10、S11、S13、S23、S25、S28～S31聚為一類，S8和S9各單獨成一類。說明山西省各地之間的藜麥也存在一定的差異，尤其是品種不同差異較大。

表4 8種成分含量測定結果

表4(續(xù))

2.5.2 主成分分析 將31批藜麥樣品中22個共有峰的峰面積導入SPSS 22.0，進行PCA標準化處理，計算得到相關系數(shù)矩陣、主成分特征值、方差貢獻率和主成分綜合得分等。

2.5.2.1 相關性分析 相關系數(shù)矩陣見表5。結果顯示9號色譜峰(綠原酸)和10號色譜峰相互之間有較大的正相關性；11號色譜峰和13號色譜峰相互之間有較大的正相關性。

2.5.2.2 主成分特征值和方差貢獻率 計算得到的主成分特征值和方差貢獻率見表6，碎石圖見圖5。以基于特征值>1為提取標準，得到主成分分析結果。由表6可知，前7個主成分的累計貢獻率為85.301%，說明所提取的前7個主成分即可代表山西藜麥指紋圖譜中的22個成分量的信息，從而評價山西藜麥的質量情況。由圖5可以看出，在主成分8處開始出現(xiàn)明顯拐點，前7個主成分可以對藜麥質量進行評價，該結果與表6中的結果一致。

初始因子載荷矩陣見表7，載荷圖見圖6，它們反映了各變量對主成分的貢獻程度。由表7和圖6可知，第1主成分主要反映9、10、16和17號峰的主要信息；第2主成分主要反映3、5、11、13、15和18號峰的主要信息；第3主成分主要反映6、8和14號峰的主要信息；第4主成分主要反映19號峰的主要信息；第5主成分主要反映1和2號峰的主要信息；第6主成分主要反映7、20和21號峰的主要信息；第7主成分主要反映4、12和22號峰的主要信息。其中已標定的峰9(綠原酸)和峰16(異阿魏酸)落在第1主成分，峰15(阿魏酸)和峰18(蕓香苷)落在第2主成分，峰6(表沒食子兒茶素)和峰14(異葒草素)落在第3主成分，峰19(根皮苷)落在第4主成分，說明已標定的幾個色譜峰在山西藜麥中比較穩(wěn)定，對山西藜麥主成分的貢獻率比較大，在決定不同批次間山西藜麥質量差異上有著重要作用。

表5 相關系數(shù)矩陣

2.5.2.3 主成分綜合評價得分 以7個主成分得分與其方差貢獻率乘積之和，得出不同產地藜麥31個樣品的主成分綜合評價得分(綜合評價得分方程為F=25.002%F1+17.399%F2+12.982%F3+9.865%F4+7.996%F5+5.466%F6+6.591%F7)及排序，得分越高說明該樣品在代表性主成分中綜合質量越好。由表8可知，31個樣品中S24、S21、S16、S23、S6、S2、S1和S20的質量相對較優(yōu)。

表6 主成分特征值和方差貢獻率

2.5.2.4 正交偏最小二乘判別分析 以藜麥樣品22個共有峰峰面積為變量系數(shù)，將其導入SIMCA 14.1軟件進行OPLS-DA，比較31個藜麥樣品之間的差異，得到VIP預測值，篩選出差異性化合物[12]。由圖7可以看出，以 VIP>1.0為閾值，篩選出6個峰，分別是色譜峰16(異阿魏酸)、14(異葒草素)、1、17、19(根皮苷)、15(阿魏酸)，可作為山西藜麥質量控制的標志物，同時這幾個成分對區(qū)分山西藜麥樣品的產地貢獻也較大。

3 討論與結論

本研究用甲醇超聲提取藜麥樣品，對色譜條件進行了優(yōu)化選擇，確定了最佳的色譜條件，選取在247 nm波長處對山西藜麥樣品指紋圖譜進行了精密度、重復性、穩(wěn)定性和回收率的方法學考察?；贖PLC技術建立了山西藜麥指紋圖譜并進行分析，31批山西藜麥樣品中確定了22個共有峰，通過與已知標準對照品比對，指認了8個色譜峰。通過對31批山西藜麥樣品進行了相似度評價，結果表明除S8和S9以外其余樣品的相似度均在0.84以上，說明山西各產地藜麥成分有較高的相似度，各成分差異不太明顯，各共有峰相對保留時間比較接近，相對峰面積差異較大，說明山西不同產地藜麥各成分含量存在差異。因黑藜麥和紅藜麥采集樣較少，代表性不足，下一步將重點進行研究。

以22個共有峰面積為變量進行化學計量學分析，HCA 和PCA結果顯示31批山西藜麥樣品聚為4類，且同一地區(qū)藜麥樣品也不一定歸為一類，這可能與藜麥品種、產地、氣候環(huán)境等多種因素有關，尤其是品種不同，差異較大。主成分分析提取到7個主成分，累計貢獻率為85.301%，可代表山西藜麥指紋圖譜中主要成分含量信息。主成分綜合評價結果顯示，樣品S24、S21、S16、S23、S6、S2、S1和S20的得分比較靠前，說明其質量相對較優(yōu)。OPLS-DA結果顯示，通過VIP預測值排序，篩選出差異性化合物6種成分，分別是色譜峰16(異阿魏酸)、14(異葒草素)、1、17、19(根皮苷)、15(阿魏酸)，可作為山西藜麥質量控制的標志物，同時這幾個成分對區(qū)分山西藜麥樣品的產地貢獻也較大。

綜上，本研究基于HPLC建立了山西省不同地區(qū)藜麥HPLC指紋圖譜，結合化學計量學對31批樣品進行相似度分析、HCA、PCA和OPLS-DA，研究結果可為山西藜麥產地溯源和質量控制提供有力的參考依據。

表7 初始因子載荷矩陣

表8 主成分得分、綜合得分及排序