基于ITS序列分析傳統(tǒng)輪作對參田土壤真菌群落組成及多樣性的影響

郭瑞齊，管仁偉，李紅霞，林慧彬

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南 250014)

西洋參(PainaxquinquefoliumL.)為五加科人參屬多年生宿根植物，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津等功效。西洋參忌地性極強(qiáng)，是阻礙其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素，因此重茬土壤修復(fù)再利用已成為西洋參研究的重點(diǎn)問題。前期研究表明，自毒物質(zhì)積累、土壤理化性狀轉(zhuǎn)變、土壤微生物群落變化以及土傳病害的增加，皆是導(dǎo)致西洋參連作障礙的關(guān)鍵因素。其中土壤微生物群落的變化是導(dǎo)致西洋參連作障礙的主要因素，連作引起土壤微生物多樣性及組成發(fā)生變化，進(jìn)而影響土壤生產(chǎn)力[1]。

土壤微生物影響西洋參生長的關(guān)鍵生態(tài)過程，其生長過程中土壤類型從“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢婢汀?，土壤中滋生大量的土傳病害及拮抗因子[2]。真菌在西洋參種植土壤環(huán)境、土傳病害等方面至關(guān)重要，然而關(guān)于參田土壤的處理再利用，提高土壤轉(zhuǎn)換率以及大田土壤真菌群落變化的研究較少。因此，本研究采用高通量測序技術(shù)，分析新茬大田土壤、傳統(tǒng)輪作1年大田土壤、傳統(tǒng)輪作2年大田土壤、未種植西洋參大田土壤中真菌組成變化，闡述傳統(tǒng)輪作狀態(tài)下老參田土壤真菌群落的變化，以期為老參田土壤改良修復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品于2019年12月27日采集自山東省威海市文登區(qū)大水泊鎮(zhèn)西水坡村西洋參種植基地(122°14′11.82″ E，37°10′38.17″ N)。樣品分為4組：新茬地采收后的參田土(A組)；傳統(tǒng)輪作小麥、玉米1年的大田土(B組)；傳統(tǒng)輪作小麥、玉米2年的大田土(C組)；未種西洋參的空白對照大田土壤(D組)。每組分別在不同的位置采集3份樣品作為試驗(yàn)重復(fù)。用五點(diǎn)取樣法采集參田土壤，去除表層土壤，采集10～20 cm深度土樣，混合，用四分法分取部分樣品，裝入無菌聚乙烯封口袋內(nèi)，加入干冰4 ℃條件下貯藏，封口，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 基因間隔序列(ITS)基因文庫構(gòu)建和高通量測序

基于已提取并驗(yàn)證合格的土壤總DNA為模板，針對真菌ITS區(qū)選擇 PCR 擴(kuò)增通用引物對ITS1F和ITS2R(ITS1F：5′-C T T G G T C A T T T A G A G G A A G T AA-3′；ITS2R：5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C-3′)為引物對ITS區(qū)真菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，高通量測序工作在Illumina Miseq PE300平臺(tái)上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌ITS測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及操作分類單元(OTU)分析

經(jīng)過MiSeq測序和質(zhì)控后，4組土壤樣品共得到651 234條優(yōu)化序列。土壤樣本稀釋曲線能夠充分反映土壤中群落所包含的微生物物種組成[3]。當(dāng)檢測的數(shù)量達(dá)到一定深度時(shí)，樣本的稀釋曲線均基本趨于平緩，說明測序數(shù)量足夠(圖1)。按照 97%的相似度進(jìn)行OTU 聚類，4組樣本共929個(gè)OTU。其中A組注釋到11門27綱 60目116科210屬476個(gè)OTU，B組注釋到14門31綱65目129科224屬511個(gè)OTU，C組注釋到10門26綱60目117科216屬453個(gè)OUT，D組注釋到11門30綱62目114科204屬435個(gè)OTU。

對4組樣品真菌群落OTU進(jìn)行分析，Venn圖(圖2)可直觀反映出不同土壤樣品中OTU的分布情況。4組樣品共有的 OTU有 929個(gè)。A組與B組共有的 OTU有266個(gè)，與C組共有OTU 243個(gè)，與D組共有的 OTU 256個(gè)。B組和C組共同含有267個(gè)OTU，B組和D組共同含有273個(gè)OTU。C組和D組共同含有268個(gè)OTU。其中A組與B組共有OTU比A組與C組共有OTU增多9.47%；而B組與D組共有OTU比C組與D組共有增多1.87%。隨著老參田土壤傳統(tǒng)輪作時(shí)間的延長，共有的OTU漸次減少，而特有的真菌OTU漸次增加，最終導(dǎo)致老參田土壤真菌群落組成分布發(fā)生改變[4]。

2.2 土壤樣品中真菌α-多樣性指數(shù)

Chao指數(shù)、ACE指數(shù)常用來分析土壤樣品群落豐富度。二者數(shù)值越大，表明土壤中真菌群落豐富度越大。由表1可知，A、B、C、D組中Chao指數(shù)平均值分別是222.74、241.79、236.82、242.48；ACE指數(shù)平均值分別為221.67、240.40、235.59、242.34。Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)常用來分析土壤微生物群落的多樣性和均勻度。Shannon指數(shù)越高，表明土壤真菌群落的多樣性越高；而Simpson指數(shù)與其相反[5]。A、B、C、D組中shannon指數(shù)依次為2.78、3.30、3.42、3.03；Simpson指數(shù)依次為0.18、0.08、0.06、0.11。與A組相比，B、C、D等3組土壤真菌群落的多樣性、豐富度指數(shù)上升，推測隨著輪作年限延長，土壤真菌多樣性及均勻度發(fā)生變化。

2.3 真菌群落組成分析

對西洋參傳統(tǒng)輪作大田土壤及空白土壤真菌在門分類水平進(jìn)行群落組成分析，4組土壤樣品真菌中主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢菌門(Mortierellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和未知真菌5類(圖3)。子囊菌門在各組土壤中平均相對豐度為51.26%，是最具有優(yōu)勢的物種，在C組中相對豐度最高；其次是擔(dān)子菌門、被孢菌門、壺菌門，平均相對豐度分別為23.46%、20.57%、3.63%；未知真菌平均相對豐度約為0.77%。在門分類水平上，4組樣品之間的群落豐度有一定的區(qū)別。

表1 各土壤樣品真菌多樣性指數(shù)

在屬水平，4組土壤樣品中真菌覆蓋333屬，豐度排名前20的物種，各組土樣中真菌群落組成與結(jié)構(gòu)明顯不同。各組大田土壤中真菌分別有19、20、19、17個(gè)優(yōu)勢屬。其相對豐度的總和均大于80%，A組為87.64%、B組為83.81%、C組為81.62%、D組為88.93%。被孢霉屬(Mortierella)、毛殼菌屬(Chaetomium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、Saitozyma、unclassified_f_Chaetomiaceae、Solicoccozyma、裸節(jié)菌屬(Talaromyces)、Lophotrichus、青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)為樣本共有的優(yōu)勢屬(表2)。毛殼菌屬、青霉屬的豐度在C組最高、B組次之，A組最低；鐮刀菌屬在空白土壤中的豐度最高(11.01%)，在新茬大田土中的豐度最低(1.90%)；而木霉屬相反，在新茬大田土中的豐度最高(4.24%)，在傳統(tǒng)輪作2年大田土中的豐度最低(0.02%)。

表2 屬水平優(yōu)勢種群豐度

2.4 土壤樣品中真菌的 β-多樣性分析

高通量測序中，常用β-多樣性分析不同樣本群落結(jié)構(gòu)組成的相似性[6]。在屬水平上，對老參田土壤真菌組成進(jìn)行主坐標(biāo)(PCoA)分析，數(shù)據(jù)中的比例分別為20.17%、16.90%(圖4)?？梢钥闯觯?組樣品組內(nèi)分布距離較近，樣品組內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高；而樣本組間距離相對較遠(yuǎn)，表明4組土壤樣品組間真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯差別。此結(jié)果與4組樣品的層級(jí)聚類結(jié)果類似。

在屬分類單元水平上，運(yùn)用 weighted-UniFrac對各組樣本進(jìn)行相似性(ANOSIM)分析以及距離熱圖(heatmap)的分析(圖5)。ANOSIM(R=0.802 5，P=0.001)分析結(jié)果表明，4組樣本的組間差異大于組內(nèi)。而4組樣本距離熱圖顯示，新茬西洋參大田與空白大田土壤之間差異最大，傳統(tǒng)輪作大田土壤之間差異最小。以上結(jié)果顯示，樣本類型是影響大田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素，其中新茬地與傳統(tǒng)輪作大田土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)差異依次增大。

2.5 真菌功能預(yù)測

運(yùn)用FUNGuild軟件，對4組大田土壤樣品真菌群落進(jìn)行真菌功能預(yù)測分析。選擇可能(probable)和很可能(highly probable)等2個(gè)置信水平，得到土壤真菌營養(yǎng)型在不同樣本中的豐度信息[7]。預(yù)測結(jié)果(圖6-a)顯示，土壤樣本中的真菌類群[8]主要包括腐生營養(yǎng)型(saprotroph)、病理營養(yǎng)型(pathotroph)、共生營養(yǎng)型(symbiotroph)、病理-腐生營養(yǎng)型(pathotroph-saprotroph)等營養(yǎng)類型。其中腐生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型、病理-腐生營養(yǎng)型的相對豐度較高，腐生營養(yǎng)型(A>C>B>D)、病理營養(yǎng)型(B>A>C>D)、病理-腐生營養(yǎng)型(A>B>C>D)呈現(xiàn)漸次差異。

4組樣本預(yù)測得到15個(gè)生態(tài)共位群[9-10]，相對豐度如圖6-b所示，共有優(yōu)勢菌主要包括未定腐生菌(Undefined Saprotroph，45.39%、20.17%、31.05%、10.87%)、內(nèi)生植物-凋落物腐生體-土壤腐生體-未定義腐生體(Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph，15.36%、10.19%、13.58%、43.05%)、動(dòng)物病原體-糞便腐生體-內(nèi)生真菌-附生植物-植物腐生體-木材腐生體(Animal Pathogen-Dung Saprotroph-Endophyte-Epiphyte-Plant Saprotroph-Wood Saprotroph，8.84%、12.77%、18.55%、9.28%)、真菌寄生物-未定義腐生菌(Fungal Parasite-Undefined Saprotroph，6.67%、5.31%、2.14%、7.51%)、動(dòng)物病原體-內(nèi)生真菌-地衣寄生蟲-植物病原體-土壤腐生體-木材腐生體(Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph，1.9%、5.30%、7.26%、11.01%)。除共有優(yōu)勢菌以外，各組特有優(yōu)勢菌主要包括：新茬西洋參大田土(A組)中內(nèi)生菌(Endophyte，1.52%)；傳統(tǒng)輪作1年大田土(B組)中內(nèi)生植物病原體(Endophyte-Plant Pathogen，1.28%)、糞便腐養(yǎng)-外生菌根-土壤腐養(yǎng)-木材腐養(yǎng)(Dung Saprotroph-Ectomycorrhizal-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph，3.99%)、動(dòng)物病原體-糞便腐生菌-內(nèi)生菌-植物腐生菌-土壤腐生菌-木材腐生菌(Animal Pathogen-Dung Saprotroph-Endophyte-Plant Saprotroph-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph，1.37%)；傳統(tǒng)輪作2年大田土(C組)植物病原體(Plant Pathogen，5.83%)、動(dòng)物病原體-植物病原體未定義腐生菌(Animal Pathogen-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph，2.29%)、糞便腐生生物(Dung Saprotroph，1.3%)；而D組除共生菌外，無特有優(yōu)勢菌群。

3 討論

高通量測序技術(shù)可全面揭示土壤微生物組成變化[11]。重茬土壤中微生物通過其特有的代謝產(chǎn)物在一定程度上影響土壤養(yǎng)分及物理特性。本研究對傳統(tǒng)輪作、新茬地、空白對照大田土壤進(jìn)行測序分析，進(jìn)一步闡述傳統(tǒng)輪作方式對老參田土壤真菌結(jié)構(gòu)的影響。通過測序分析發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)輪作方式可改變老參田土壤真菌多樣性，在西洋參種植過程中土壤結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或施用生物菌肥導(dǎo)致土壤養(yǎng)分改變，最終影響了土壤真菌的豐度與多樣性。其次，西洋參種植過程中土壤中某些致病真菌大量增加，真菌群落之間相互拮抗，造成某些有益真菌減少甚至消失，這也是傳統(tǒng)輪作大田土壤真菌多樣性減少的因素之一[12]。

高通量數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，傳統(tǒng)輪作方式對老參田土壤真菌組成有一定的影響。隨著傳統(tǒng)輪作時(shí)間的延長，在屬分類水平，毛殼菌屬、青霉屬的豐度漸次增加。毛殼菌屬中的纖維素酶，能有效降解土壤中的纖維素和有機(jī)質(zhì)，可抑制土壤病原微生物的生長，故屬于拮抗菌；土壤中的青霉屬真菌是西洋參根際有益微生物，也是生防菌篩選的主要菌種，在栽參土壤中青霉屬的豐度表現(xiàn)為C組>B組>A組，可以推測隨傳統(tǒng)輪作時(shí)間的延長其豐度漸次增加[10]。木霉屬可引起人參屬植物葉斑病，屬內(nèi)大多數(shù)木霉菌對植物病原真菌、細(xì)菌及昆蟲具有拮抗作用[13]。木霉屬作為另外一種生防菌菌種來源，其在新茬大田土中豐度高達(dá)4.24%，在傳統(tǒng)輪作1年大田土中豐度為0.74%。結(jié)合威海市當(dāng)?shù)匚餮髤⒎N植中常施用生防菌木霉素，推測其豐度大小受到了施肥管理的影響。鐮刀菌屬是引起西洋參根腐病的主要致病菌之一，隨著傳統(tǒng)輪作時(shí)間延長，豐度在各組大田土豐度漸次增加，推測可能與西洋參種植過程中施加生物肥料有關(guān)[14]。從真菌功能預(yù)測結(jié)果可以看出，傳統(tǒng)農(nóng)田栽培模式對栽參土壤進(jìn)行改良中，人為添加大量的微生物菌劑和生物肥料，使原生微生物群落被破壞，新生的微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，各種微生物處于無限制繁殖階段，這也是農(nóng)田栽培模式土壤中大量的腐生真菌存在的原因[14]。而傳統(tǒng)輪作栽培模式農(nóng)田土壤真菌多樣性的差異是否存在廣泛性還有待進(jìn)一步研究。