不同給藥途徑在噬菌體治療中的研究進展*

舒飛鴻 綜述，王達利，黃廣濤,2△ 審校

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院燒傷整形外科,貴州遵義 563000;2.深圳大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科,廣東深圳 518037)

噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。雖然噬菌體一百多年前就被用于治療感染性疾病，但早期噬菌體臨床試驗很多未采用循證醫(yī)學的一些準則，并未受到廣泛認可。由于抗生素使用方便，治療效果好，噬菌體治療逐漸被忽視[1]。伴隨抗生素的廣泛應用，細菌耐藥性日益嚴重，抗生素的研發(fā)速度趕不上細菌耐藥的變異速度，耐藥細菌的治療正在面臨巨大的挑戰(zhàn)。2017年，世界衛(wèi)生組織根據(jù)目前細菌耐藥情況發(fā)布了一份最危險耐藥菌的名單。面對耐藥菌的威脅，科學家再次把目光轉(zhuǎn)移至噬菌體治療[2]。

噬菌體治療具有以下優(yōu)點：(1)特異性高，只裂解目標菌，不會影響其他細菌和正常菌群；(2)噬菌體分布極廣、容易獲取，凡是有細菌的場所，就可能有噬菌體的存在。以臨床菌株為宿主菌在自然環(huán)境中進行噬菌體分離，一般情況下成功率較高；(3)能使細菌恢復對抗生素的敏感性[3]。目前，噬菌體治療已被報道用于治療多種感染性疾病，如銅綠假單胞菌引起的慢性肺部感染[4]、腸桿菌科所引起的燒傷創(chuàng)口感染[5]、尿路感染[6]等。此外，噬菌體還可以作為預防制劑，誘發(fā)機體的特異性細胞免疫，達到保護效果，從而預防病毒[7]、真菌[8]的感染和癌癥[9]。除此之外，噬菌體的展示技術(shù)也給噬菌體治療帶來了靶向治療的方向，通過噬菌體展示技術(shù)，篩選出具有特異性作用的小分子肽，可使特殊疾病的情況得到改善。噬菌體治療展現(xiàn)了巨大的發(fā)展?jié)摿?。但是目前關(guān)于噬菌體治療的給藥途徑報道不一，本文綜述了噬菌體的不同給藥途徑，為今后開展噬菌體治療的基礎和臨床研究提供參考。

根據(jù)噬菌體與細菌的相互關(guān)系，噬菌體分為：裂解性噬菌體和溫和性噬菌體。裂解性噬菌體在宿主菌內(nèi)的增殖過程包括吸附、穿入、生物合成、成熟與釋放等階段。裂解噬菌體與細菌表面的受體結(jié)合后，借尾部的溶菌酶溶解細菌的細胞壁，然后通過尾鞘的收縮，將核酸注入菌體內(nèi)。核酸進入后，將通過生物合成階段合成自身成熟前所需物質(zhì)，在菌體內(nèi)進行裝配，待子代噬菌體超過一定數(shù)目時，可裂解菌體釋放子代噬菌體。如此往復，達到治療細菌感染的效果。溫和噬菌體可將其核酸整合于宿主菌的基因組中，該種整合于宿主菌基因組上的噬菌體基因稱為前噬菌體。前噬菌體可隨宿主菌的染色體復制而復制，并可隨宿主菌的分裂而傳給下一代，不引起細菌裂解。前噬菌體也可偶爾受外界誘因的影響，從宿主菌基因組中自發(fā)地脫離下來，進入溶菌性周期，產(chǎn)生成熟的子代噬菌體，導致細菌裂解。

1 注射給藥

1.1 肌肉注射

NAGHIZADEH等[10]通過鵪鶉感染模型，證實肌肉注射噬菌體比對照組有著更低的死亡率。同時，該團隊證實了噬菌體雞尾酒治療在鵪鶉體重恢復和對減緩大腸埃希菌降低生長的效果優(yōu)于單一使用噬菌體。

SELLERS等[11]利用噬菌體展示技術(shù)篩選出一種能直接輸送到脊髓運動神經(jīng)元的短肽。該肽通過肌肉注射后，可將具有生物活性的Cre重組酶和辣根過氧化物酶運送到脊髓，也能標記人體中的運動神經(jīng)元。非病毒介導的功能蛋白轉(zhuǎn)運到脊髓證明了該肽在退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病靶向治療中的潛力。

1.2 腹腔注射

在急性小鼠肺部洋蔥伯克霍爾德菌感染模型中，對比了鼻吸入和腹腔注射2種給藥途徑對細菌負荷量和肺部炎癥的影響。腹腔注射噬菌體的小鼠肺部細菌數(shù)量、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和巨噬細胞炎性蛋白(MIP-2)水平均顯著降低，治療效果優(yōu)于鼻吸入噬菌體[12]，這可能與細菌的特性和血液循環(huán)有關(guān)。

SCHOOLEY等[13]用噬菌體雞尾酒通過腹腔注射和靜脈注射治療了1例播散性耐藥鮑曼不動桿菌感染患者。患者通過經(jīng)皮導管引流假囊腫腔、膽囊、第三腹腔，再通過腔內(nèi)注射噬菌體雞尾酒，每6～12小時重復給藥1次。此外，該患者還通過靜脈注射噬菌體使治療得到了加強和擴大。經(jīng)過噬菌體雞尾酒治療，患者最終回到了工作崗位。

1.3 靜脈注射

CAPPARELLI等[14]建立了腸道沙門氏菌感染的BALB/C小鼠模型，感染后立即進行靜脈注射噬菌體，可使小鼠存活率高達100%。此外，該團隊還證實噬菌體抗性細菌具有無毒、體內(nèi)存活時間短、毒性小等特點。

2018年，1例患者因患銅綠假單胞菌菌血癥而接受了噬菌體靜脈注射治療，遺憾的是噬菌體并未能真正根除菌血癥，這與無法控制感染的源頭有關(guān)[15]。

2019年2月19日，美國首個靜脈注射噬菌體臨床試驗獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準，該臨床試驗的1期、2期主要是評估噬菌體的安全性、有效性及耐受性，試驗由加州大學生圣地亞分校醫(yī)學院和AmpliPhi Bioscience公司合作進行。同年，利用工程噬菌體通過靜脈注射治療結(jié)核分枝桿菌導致的膿腫也在臨床試驗中取得了一定的效果。DEDRICK等[16]用3種工程噬菌體雞尾酒在15歲的囊性纖維化者胸骨進行局部試驗，24 h后，用濃度為1×109pfu/mL 3種工程噬菌體雞尾酒開始靜脈注射治療，12次/小時，至少持續(xù)32周，患者除在早期具有輕微反應外，無其他癥狀，9 d后患者出院，并繼續(xù)靜脈注射雞尾酒噬菌體，最終患者的臨床癥狀得到了持續(xù)改善。這是文獻報道的第1次利用工程噬菌體治療結(jié)核分枝桿菌感染，這對噬菌體的臨床治療是一個具有里程碑的存在。

1.4 皮下注射

噬菌體除具有特異性外，還有免疫原性，不需佐劑的輔助就能用作免疫原。通過噬菌體展示技術(shù)，使噬菌體具有HIV-1的gp120和gp41構(gòu)象表位的抗原模擬物，誘發(fā)機體的免疫反應，起到一定的保護作用[17]。這為以后噬菌體疫苗的設計提供了一種新策略。RYAN等[18]利用了顯微注射的方法將噬菌體注入到了真皮層和皮下組織。這將盡可能使噬菌體應用于燒傷程度較深的部位，從而提高治療療效。

2 局部給藥

噬菌體局部治療已報道的有皮膚局部給藥、眼部局部給藥、耳局部給藥、口腔局部給藥、鼻部局部給藥或霧化吸入、尿路給藥、直腸給藥等。

2.1 皮膚局部給藥

嚴重的皮膚損傷會導致皮膚屏障受損，增加細菌感染的可能。目前，細菌耐藥性越來越強，導致傷口長期不愈合，治療效果不佳，嚴重時可危及患者生命。因豬的皮膚和人的皮膚有著相似之處，故MILHO等[19]在豬皮傷口感染和生物膜模型中利用噬菌體療法并進行了抗菌評估，結(jié)果表明噬菌體對鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和奇異假單胞菌等細菌感染的傷口有治療效果。

在人體試驗中，1例患有Netherton綜合征的患兒皮膚感染了金黃色葡萄球菌，經(jīng)大部分抗菌治療無效后，家屬選擇噬菌體治療。治療后，患兒四肢皮膚緊繃的情況得到改善，炎癥的局部表現(xiàn)減輕，范圍變小[20]。

近來，噬菌體局部治療有著形式各樣的藥品。清洗液、軟膏等噬菌體制劑能夠促進傷口的愈合速度[21-22]，此外，噬菌體制劑還有粉末[23]、敷料[24]、面霜[25]、霧化[26]等。2019年，JAULT等[27]利用噬菌體雞尾酒敷料給燒傷患者治療(PhagoBurn試驗)，結(jié)果表明噬菌體治療組治療速度低于標準護理組，但噬菌體治療組傷口的淺表化膿程度低于標準護理組。盡管局部噬菌體在治療皮膚創(chuàng)面感染中證明其具有一定的療效，但是對于全身感染所引起的皮膚局部感染，用靜脈注射噬菌體會優(yōu)于局部噬菌體給藥的效果。

2.2 眼部局部給藥

2021年，3種新分離的噬菌體候選物phiEF7H、phiEF14H1、phiEF19G通過玻璃體體內(nèi)注射給藥，治療糞腸球菌感染的眼內(nèi)炎小鼠模型。結(jié)果顯示，3種噬菌體均使小鼠眼內(nèi)活菌數(shù)量及中性粒細胞浸潤減少[28]。1項試驗用噬菌體眼藥水成功治療了1例患有角膜炎的患者，證實了噬菌體眼部局部給藥的安全性和有效性[29]。

2.3 耳局部給藥

在動物實驗模型中，在患有銅綠假單胞菌性中耳炎的狗中，通過局部噬菌體制劑給藥，使狗的中耳炎情況得到改善，且在治療3個月期間無相關(guān)不良反應產(chǎn)生[30]。但噬菌體直接一次性給入具有侵入性，間接輸入噬菌體可避免該問題，KURABI等[31]則就利用大鼠體內(nèi)的噬菌體展示技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一種罕見的肽，通過實驗結(jié)果顯示這種肽能非侵入性的將藥物遞送也能介導噬菌體通過小梁網(wǎng)的運輸。一項治療銅綠假單胞菌性中耳炎的臨床試驗結(jié)果顯示，噬菌體治療組的效果顯著而安慰組無效，且患者無中毒現(xiàn)象出現(xiàn)，說明噬菌體耳局部給藥是安全的[32]。

2.4 鼻腔局部給藥

鼻部感染，如慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)，細菌會在炎癥部位形成生物膜，為鼻竇的給藥及恢復帶來一定的困難，而噬菌體在清除生物膜方面具有一定的優(yōu)勢。DRILLING等[33]利用噬菌體雞尾酒懸液對綿羊的鼻腔進行沖洗，每天2次，連續(xù)沖洗20 d。結(jié)果顯示，噬菌體不會導致炎癥浸潤及鼻黏膜損傷。這項實驗說明了利用噬菌體在鼻腔局部給藥是安全的。

2019年，OOI等[34]利用噬菌體治療了金黃色葡萄球菌導致的CRS患者，以此來判斷噬菌體治療在鼻腔的安全性和耐受性。該團隊對患者用濃度為3×109pfu/mL的噬菌體進行灌洗，9例患者治療前、后無體溫變化，只有部分患者有輕度不良反應，有2位患者根除了細菌感染。故該臨床試驗中表明，噬菌體在鼻腔內(nèi)部的灌洗具有安全性和耐受性。部分患者具有不良反應可能與自身免疫力有關(guān)。

2.5 霧化給藥

肺部細菌感染因感染位置較深，給藥途徑不便等效果影響，一般的給藥途徑治療肺部感染的療效較差。因此，通過霧化噬菌體，增加噬菌體與感染部位接觸面積，可能會改善肺部感染的狀況。

動物模型中，噬菌體氣霧劑給藥于小鼠，接著再給小鼠使用從結(jié)核病小鼠模型分離培養(yǎng)制成的H37RV氣霧劑，結(jié)果顯示，這種情況下，能在小鼠體內(nèi)建立肺部感染的細菌較少。故噬菌體氣霧劑在這種情況下起到了預防肺部感染細菌的作用[35]。1份病例報告顯示，將噬菌體噴霧用于治療患有肺部囊性纖維化的女性患兒。該患兒肺部有銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的慢性感染，通過9次的噬菌體霧化治療，銅綠假單胞菌濃度下降明顯，但金黃色葡萄球菌下降并不明顯，于是在原來噬菌體的基礎上加入噬菌體Sb-1，然后通過霧化器將該種噬菌體雞尾酒用于患者5次。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌濃度也急劇下降，且無不良反應發(fā)生[36]。

2.6 尿路局部給藥

尿路感染是最普遍的疾病之一，嚴重影響患者的身體健康。有研究表明，單次置尿?qū)Ч軐е赂腥镜牟±?%～2%，而開放式的引流系統(tǒng)置管在3～4 d內(nèi)會導致患者尿液中100%含有細菌[37]。

LEITNER等[38]團隊設計了一個實驗，用來證明噬菌體進行尿路局部給藥是否對尿路感染具有一定的療效。試驗分為2個階段：第1階段為噬菌體適應，第2階段為患者接受改良的噬菌體治療；由于尿路梗阻感染多見于前列腺腫大，所以篩選出來的患者都預先進行了尿道前列腺電切術(shù)，術(shù)后進行低壓沖洗且放置恥骨上套針，術(shù)后第1天開始即通過恥骨上套管注射改良后的Pyo噬菌體20 mL，每次在膀胱中保留30～60 min，連續(xù)7 d，結(jié)果表明，大部分患者細菌的滴度下降，只有1例患者因銅綠假單胞菌感染而發(fā)熱，但給予抗菌藥物后，癥狀便得以恢復。

2020年12月，BAO等[39]用噬菌體聯(lián)合非活性的抗生素成功治療了1例因肺炎克雷伯菌引起的復發(fā)性尿路感染患者。在第1、2輪的治療中，噬菌體雞尾酒經(jīng)膀胱沖洗途徑給藥，但噬菌體的抗性菌株在幾天內(nèi)產(chǎn)生。第3輪治療中，噬菌體雞尾酒聯(lián)合磺胺甲惡唑-甲氧芐啶(sulfamethoxazole-trimethoprim,SMZ-TMP)給藥。結(jié)果顯示，噬菌體雞尾酒與中等或高劑量(150 μg/mL SMZ、50 μg/mL TMP 或 300 μg/mL SMZ 和 100 μg/mL TMP)的SMZ-TMP聯(lián)合應用后，完全抑制廣泛耐藥肺炎克雷伯菌(ERKP)的生長超過24 h，最終患者因該種聯(lián)合治療方式治愈。

2.7 直腸給藥

2020年，ROSTKOWSKA等[40]報告了1例用噬菌體治療患有尿路感染的60歲腎移植患者，患者在腎移植后經(jīng)歷過12次尿路感染，為了抑制尿路持續(xù)感染，經(jīng)直腸給藥噬菌體，希望能抑制尿路持續(xù)感染。結(jié)果顯示，直腸給藥噬菌體不僅未引起不良反應，且患者也未因尿路感染再次入院。

3 口服給藥

NIKKHAHI等[41]分離并篩選出可治療沙門菌感染小鼠的噬菌體，結(jié)果顯示，單次口服濃度為2×109pfu/mL的噬菌體可使小鼠免受感染，也可進行抗感染治療。

相比之下，OTERO等[42]將噬菌體包封在脂質(zhì)體中，再將其通過口服途徑給入小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明，通過脂質(zhì)體包封的噬菌體能長期在胃內(nèi)停留及在腸黏膜黏附?？诜删w治療細菌性腹瀉的患兒隨機試驗結(jié)果顯示，口服噬菌體能正常到達腸道，但不能在腸道中定植擴散和改善腹瀉[43]，可能與人體腸道內(nèi)菌群更為復雜、胃酸的釋放、噬菌體的用量、機體的免疫系統(tǒng)有關(guān)。為改善胃酸的影響，噬菌體及內(nèi)溶素包封系統(tǒng)可能是一種提高口服治療效果的策略[44]。同時，噬菌體展示技術(shù)篩出的抗胃蛋白酶短肽，可助于開發(fā)出耐胃蛋白酶的口服給藥肽[45]。

4 總 結(jié)

對于各個系統(tǒng)的感染性疾病，給藥方式是多種多樣(圖1)。噬菌體通過注射、局部、口服給藥可以調(diào)高動物模型的生存率并提供保護。何種給藥方式取決于患者的情況及何種方式的療效最快與最好。目前，多數(shù)采用噬菌體雞尾酒加上抗菌藥物來對付超級細菌[46]。但隨著細菌對噬菌體的耐藥，個性化的噬菌體治療也在不斷地興起，篩選出針對特定的感染株的噬菌體成了個性化治療的目標。改造噬菌體可在某些疾病中取得一定的療效，通過基因工程的方法，可能會拓寬噬菌體的宿主譜。此外，由噬菌體衍生而來的內(nèi)溶素具有穩(wěn)定性高，無細菌對其耐藥的優(yōu)點，從而可能會成為噬菌體的替代療法[47]。

但就目前的文獻表明，大多數(shù)的研究方向都為裂解噬菌體，很少研究溫和噬菌體，可能是因溫和噬菌體具有基因轉(zhuǎn)導這一環(huán)節(jié)，使其安全性不及裂解噬菌體。盡管如此，溫和噬菌體的治療潛力也不可忽視。

總的來說，噬菌體有著治療感染性疾病的潛力，溫和噬菌體在一定程度上也展示出了其治療疾病的潛力，但是由于噬菌體的某些缺點，噬菌體治療現(xiàn)在并未廣泛的用于臨床，只有通過科學的設計和長期的噬菌體治療試驗及經(jīng)驗，才可能推動噬菌體治療的新發(fā)展。