基于生物信息學篩選非肌層浸潤性膀胱癌復發(fā)關鍵基因并驗證*

郭 江,張克勤

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院泌尿腎病中心 400065)

膀胱尿路上皮癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，近15年增加了68.29%[1]。膀胱尿路上皮癌按病理類型可分為非肌層浸潤性膀胱癌(non-invasive bladder cancer，NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(invasive bladder cancer，MIBC)。NMIBC易于復發(fā)，且部分復發(fā)患者易進展為MIBC，MIBC患者5年生存率僅為50%～60%[2]。因此找到新的治療NMIBC的方法具有重要意義。近年來隨著芯片技術、生物信息學、基因工程等生物技術的快速發(fā)展，為腫瘤發(fā)病機制的闡明和對腫瘤的診治提供了新的思路[3]。本次實驗利用生物信息學分析正常膀胱黏膜與復發(fā)性NMIBC差異表達基因，從中找到有價值的關鍵分子并進行實驗驗證，并探索靶分子在復發(fā)性NMIBC中的重要作用及臨床意義，為復發(fā)性NMIBC的診療提供潛在的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1生物信息學材料

從美國國家生物技術信息中心(National Centerfor Biotechnology Information,NCBI)公共數據平臺(Gene Expression Omnibus,GEO)下載基因芯片數據GSE13507(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgiacc=GSE13507)，該數據于2010年5月6日公開，最后更新于2020年5月20日。

1.1.2臨床標本和細胞株

收集2018年1月至2019年12月本院泌尿外科手術切除的復發(fā)性NMIBC及對應癌旁組織13例，所有腫瘤組織標本均經病理學證實為膀胱尿路上皮癌，病例排除標準：治療前接受放療或介入治療的患者。本實驗通過本院倫理委員會批準(批號2017-4-190)。人膀胱尿路上皮癌細胞株(T24、5637、J82、UM-UC-3),人膀胱尿路上皮細胞SV-HUC-1儲存于本院泌尿腎病中心實驗室。

1.2 方法

1.2.1差異表達基因的篩選

使用GEO2R(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對GSE13507芯片中正常膀胱黏膜與復發(fā)性NMIBC數據進行差異表達分析，分析結果按差異表達倍數(logFC)及P值升序選取前250個(Top250)基因作為分析對象，對基因進行基因本體(Go)分析和京都基因組百科全書(kegg)通路分析，涉及的生物學功能和信號通路使用Metascape數據庫(www.metascape.org)進行注釋和可視化，Min overlap≥3且P≤0.01被認為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2.3關鍵基因篩選

在Top250基因中按P<0.05且|logFC|>2篩選獲得顯著差異表達基因并在GEPIA2數據庫(http://gepia2.cancer-pku.cn)中做生存分析，獲得顯著降低膀胱癌患者生存率的基因，并選擇P值最小的基因作為關鍵基因，進行下一步試驗驗證。

1.2.4細胞培養(yǎng)

用F-12K專用培養(yǎng)基培育SV-HUC-1細胞，T24、5637、J82、UM-UC-3細胞在含10%胎牛血清(美國Hyclone)的RPMI-1640(美國Hyclone)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.5免疫組織化學

采用標準免疫過氧化物酶染色法進行免疫組織化學檢測。組織切片的陽性染色率和染色強度由2名實驗員依照免疫組織化學評分標準獨立評估，按中位評分分為高表達組和低表達組。

1.2.6shRNA轉染

shRNA干擾靶點如下： EFNB2-shRNA(敲低組),5′-CGA CAA CAA GTC CCT TTG TAA-3′;EFNB2-shRNA-control(對照組),5′-GTT CTC CGA ACG TGT CAC GTT-3′。按shRNA-mate(上海吉瑪制藥技術有限公司)說明書步驟轉染以上序列入T24細胞株。

1.2.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

先用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA，再反轉錄為cDNA。最后使用TaqManUniversal Master MixⅡ試劑盒在Bio-Rad系統(tǒng)上進行qRT-PCR。引物序列：EFNB2正向5′-TAT GCA GAA CTG CGA TTT CCA A-3′；反向5′-TGG GTA TAG TAC CAG TCC TTG TC-3′；GAPDH正向 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′；反向5′-TAG CAC AGC CTG GAT AGC AA-3′。每個試驗獨立重復3次，采用2-ΔΔct法分析數據結果，GAPDH作內參，計算EFNB2 mRNA的表達水平。

1.2.8蛋白免疫印跡(Western blot)

使用RIPA裂解液裂解各組細胞，將提取的蛋白加入EP管中，煮沸10 min。BCA法檢測蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗EFNB2(1∶400)、Tubulin(1∶800)置4 ℃冰箱孵育24 h，隨后取出常溫下放置1 h，PBS洗滌3次，加入對應二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，滴加ECL發(fā)光液(重慶葆光生物科技有限公司)，置LI-COR曝光儀內進行曝光顯影，以Tublin為內參，使用ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

1.2.9集落形成實驗

將轉染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24細胞接種到6孔板(8×102/孔)，在含5% CO2、37 ℃的孵箱里培養(yǎng)11 d后，用結晶紫溶液對菌落進行染色，計數細胞克隆數，觀察細胞增殖情況。

1.2.10CCK-8實驗

將轉染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24細胞接種于96孔板(2.5×103/孔)，每孔加入含有10 μL CCK-8試劑(重慶葆光生物科技有限公司)的完全培養(yǎng)基100 μL。在5% CO2、37 ℃孵箱中分別培養(yǎng)4、12、20、28、36 h后，在450 nm處測定吸光度(A)值，檢測細胞增殖能力。

1.2.11劃痕實驗

將細胞接種于6孔板(2.5×103/孔)，轉染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control后培養(yǎng)細胞長至約90%以上，用200 μL無菌吸管頭輕輕劃傷細胞形成創(chuàng)面，然后用PBS沖洗角質形成細胞和碎片，并用無血清RPMI-1640替代完全培養(yǎng)基，在劃痕后0 h和24 h拍照，評估創(chuàng)面面積,創(chuàng)面面積大小反應腫瘤細胞的遷移能力。

1.2.12Transwell細胞遷移及侵襲檢測

將轉染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24細胞重懸稀釋至1.0×106/μL，接種到Transwel小室(美國BD Biosciences,FranklinLakes)上室，下室加入含20%血清的培養(yǎng)基誘導細胞遷移，孵育48 h，收集遷移到下室的細胞并染色計數，評估遷移能力；根據Transwell侵襲實驗步驟，在上室底涂上基質膠(Matrigel，北京索萊寶科技有限公司)并加入轉染的T24細胞，培養(yǎng)48 h后，收集下室細胞并染色計數以評估其侵襲性。染色計數方法：先棉簽擦除上室細胞，再用無水甲醇固定15 min，結晶紫(北京索萊寶科技有限公司)染色20 min，最后每孔隨機抽取5個區(qū)域進行細胞計數。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 差異表達基因的篩選

GSE13507芯片數據中有9個正常膀胱黏膜樣本，23個復發(fā)性NMIBC樣本，從差異表達基因Top250中篩選出前54個(Top54)顯著差異表達基因，包括14個上調基因和40個下調基因，見圖1、表1。

表1 Top54基因差異倍數及P值

續(xù)表1 Top54基因差異倍數及P值

續(xù)表1 Top54基因差異倍數及P值

2.2 差異表達基因Top250富集分析

富集分析顯示差異表達基因主要參與有絲分裂細胞周期調控、細胞分裂DNA生物合成、染色質結合蛋白泛素化的正調控等，上述細胞功能均與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，見圖2。

2.3 關鍵基因的篩選

顯著差異表達基因Top54在GEPIA2數據庫作生存分析獲得顯著降低膀胱癌患者生存率的基因(圖3)并按P值排序(表2)，選取P值最小基因 EFNB2為關鍵基因，進行下一步試驗驗證。

表2 生存分析P值及基因功能

2.4 EFNB2在臨床樣本及膀胱癌細胞系中的表達

用免疫組織化學法檢測了臨床樣本膀胱癌及對應癌旁組織中EFNB2的表達，去驗證其表達差異性。結果顯示膀胱癌組織中EFNB2的表達水平顯著高于對應癌旁組織，見圖4A。與臨床標本中的結果一致，T24、5637、J82和UM-UC-3細胞系中EFNB2的表達顯著高于SV-HUC-1細胞，見圖4C。同時發(fā)現，EFNB2在4種膀胱尿路上皮癌細胞中表達也存在差異性，其中T24細胞系中EFNB2的表達最高，5637，J82次之，而UM-UC-3表達最低(T24>5637>J82> UM-UC-3)，見圖4B、C。因此，選取T24細胞株進行后續(xù)實驗。

2.5 敲低EFNB2對T24細胞的增殖、遷移及侵襲的影響

與對照組比較，敲低組細胞增殖速度顯著減慢，細胞克隆數顯著減少，劃痕未覆蓋面積顯著增加，細胞遷移及侵襲數顯著減少，見圖5。

3 討 論

膀胱尿路上皮癌是我國常見惡性腫瘤，其中NMIBC易復發(fā)、進展，部分NMIBC易進展為MIBC,導致病情迅速發(fā)展、惡化，患者預后較差，成為當前我國腫瘤治療的難點。本研究通過揭示復發(fā)性NMIBC與正常膀胱黏膜之間的基因表達差異，篩選出關鍵基因并體外實驗驗證，尋找NMIBC新的治療靶點。

差異表達基因富集顯示其生物學行為與腫瘤的發(fā)生及進展密切相關。通過富集結果筆者推測EFNB2可能通過上述生物學過程促進腫瘤細胞生長，研究顯示EFNB2可促進多形性膠質母細胞瘤增殖和侵襲[4]，通過p53/p21和上皮間質轉化(EMT)促進胰腺導管腺癌中的細胞增殖、遷移和侵襲[5]。

Ephrins家族是受體酪氨酸激酶亞家族的配體，Ephrin通過與Eph受體結合發(fā)揮其生物學功能，其中EFNB2是最大的配體[6]。Ephrins不僅是配體，也是信號受體，除了Eph/Ephrin通路外，Ephrin還可以通過反向信號，不依賴Ephrin受體發(fā)揮生物學作用，當細胞質Ephrin結構域磷酸化，導致細胞信號通路激活時，就會發(fā)生反向信號傳遞[7-8]。Eph/Ephrin通路與癌癥的發(fā)生和進展有關[9]，已有研究表明，Ephrins過表達促進腫瘤細胞侵襲、遷移和血管生成[10]，EFNB2廣泛表達于腫瘤血管，通過促進血管內皮前體細胞黏附于腫瘤部位，參與腫瘤血管生成[11]。已有多項研究顯示，EFMB2高表達的卵巢癌[12]、子宮內膜癌[13]、食管鱗狀細胞癌[14]、頭頸部鱗狀細胞癌[15]等多種實體腫瘤預后較差。

本研究中，臨床人膀胱癌樣本免疫組織化學實驗顯示EFNB2在復發(fā)性NMIBC中表達顯著高于對應的癌旁組織，表明EFNB2可能參與了膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展。因此，筆者通過敲低EFNB2進一步探討了EFNB2在膀胱尿路上皮癌細胞增殖、遷移及侵襲中的作用及可能的機制。體外實驗CCK-8、集落形成實驗表明下調EFNB2可抑制膀胱尿路上皮癌細胞的增殖。此外，EFNB2的反向信號轉導證明在結直腸癌中驅動EMT，而EMT促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[16-17]。本研究劃痕實驗、Transwell實驗顯示EFNB2敲低后，細胞遷移及侵襲能力較對照細胞顯著下降，這進一步證實了EFNB2促進了腫瘤細胞的遷移與侵襲。

綜上所述，本研究通過生物信息學篩選，臨床樣本免疫組織化學分析及體外實驗驗證表明：EFNB2是促進NMIBC復發(fā)、進展的關鍵基因，EFNB2可能與復發(fā)性NMIBC的病理發(fā)生、發(fā)展密切相關，是一個潛在的復發(fā)性NMIBC治療靶點。