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    MUC16對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

    2022-11-15 06:20:52李名武王勤志孫法瑞
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:兔抗人膽囊癌上皮

    李名武, 王勤志, 孫法瑞

    (鄂東醫(yī)療集團(tuán)市 黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院骨科,湖北 黃石 435000)

    骨肉瘤好發(fā)于兒童和青少年人群,隨著治療方法的不斷改進(jìn),患者生存率有所提高[1],但由于骨肉瘤的侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、易早期發(fā)生遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移,使得患者總體預(yù)后仍然較差[2]。黏蛋白16(mucin 16,MUC16)是黏蛋白家族成員,在上皮保護(hù)和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用,與信號(hào)通路傳導(dǎo)調(diào)控及免疫應(yīng)答關(guān)系密切[3]。有研究發(fā)現(xiàn),MUC16參與了卵巢癌[4]、膽囊癌[5]、子宮內(nèi)膜癌[6]、肺癌[7]等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。然而,關(guān)于MUC16與骨肉瘤關(guān)系的研究較少。為此,本研究擬探討MUC16對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS增殖和侵襲能力的影響。

    1 材料和方法

    1.1 儀器與試劑

    人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS購(gòu)自上海通派生物科技有限公司,McCoy's 5A培養(yǎng)液購(gòu)自上海研生生物技術(shù)科技有限公司,胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。MUC16干擾序列和對(duì)照序列由上海美軒生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和Trizol提取試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,MUC16和內(nèi)參引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購(gòu)自上海科華生物工程股份有限公司,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)自北京博潤(rùn)萊特科技有限公司,Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司,基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。兔抗人MUC16單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,兔抗人上皮型鈣黏蛋白(epithelial-cadherin,E-Cad)多克隆抗體、兔抗人神經(jīng)型鈣黏蛋白(neuropathic-cadherin,N-Cad)單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司,DP-6100型酶標(biāo)儀購(gòu)自北京亞歐德鵬科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)U2OS細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后,用胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用胰蛋白酶消化,接種于6孔板,密度為2.5×106/孔,待細(xì)胞融合度為80%以上時(shí),按Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染。(1)sh-MUC16組:轉(zhuǎn)染MUC16干擾序列sh-1(5'-ACAGCAGCATCAAGAGTTATT-3')、si-2(5'-GGAGCAAGTCTTTCTAGATAA-3');(2)sh-Control組:轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列(5'-GGAATCTCATTCGATGCATAC-3');(3)空白組:不作任何處理。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

    1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MUC16 mRNA表達(dá) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細(xì)胞,胰蛋白酶消化,加入細(xì)胞裂解液,采用Trizol提取試劑提取總RNA,采用UV-1801紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)檢測(cè)純度和濃度,以吸光度(A)260nm/A280nm比值>1.80為合格。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA),以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,74 ℃ 30 s,36個(gè)循環(huán);74 ℃延長(zhǎng)3 min。每份樣本設(shè)6個(gè)復(fù)孔。MUC16上游引物為5'-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA- 3',下游引物為5'-ACCAGTGGGCATTCCAGAAAGAGA-3';β-actin上游引物為5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3',下游引物為5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

    1.2.3 U2OS細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)U2OS細(xì)胞增殖活性。取各組U2OS細(xì)胞,胰蛋白酶消化,接種于96孔板,密度為5 000個(gè)/孔,繼續(xù)培養(yǎng),分別于12、24、48、72和96 h時(shí)每孔加入20 μL MTT液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心棄去培養(yǎng)液,加入150 μL DMSO,充分振蕩5 min,使結(jié)晶充分溶解后,采用DP-6100型酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處的A值。重復(fù)3次。

    1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細(xì)胞,胰蛋白酶消化,磷酸鹽緩沖液沖洗3次,離心取沉淀,用不含血清的培養(yǎng)液重懸,取200 μL(約1×105個(gè)細(xì)胞)置于Transwell小室的上室,下室加入含血清的完全培養(yǎng)液600 μL,培養(yǎng)24 h,去除散落細(xì)胞,用甲醛固定,結(jié)晶紫染色,用CKX53型顯微鏡(日本 OLYMPUS公司)觀察,隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

    1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取基質(zhì)膠50 μL,稀釋后均勻涂抹在Transwell小室上室,過(guò)夜風(fēng)干備用。其他實(shí)驗(yàn)步驟同“細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)”。

    1.2.6 U2OS細(xì)胞MUC16、E-Cad和N-Cad表達(dá) 采用免疫印跡法檢測(cè)U2OS細(xì)胞的蛋白表達(dá)。取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細(xì)胞,胰蛋白酶消化,收集U2OS細(xì)胞并置于裂解液中,提取總蛋白,采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法定量測(cè)定。取50 μg總蛋白,采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%脫脂奶粉封閉60 min,分別加入兔抗人MUC16單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人E-Cad多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人N-Cad單克隆抗體(1∶800稀釋),4 ℃過(guò)夜孵育,三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液沖洗3次,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(青島捷世康生物科技有限公司),室溫孵育120 min,采用化學(xué)發(fā)光法顯影,采用Image J圖像分析軟件(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)進(jìn)行分析,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參蛋白,計(jì)算MUC16、E-Cad和N-Cad的相對(duì)表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組MUC16 mRNA表達(dá)比較

    sh-MUC16組、sh-Control組和空白組之間MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=106.005,P<0.001)。sh-MUC16組MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.33±0.09)顯著低于sh-Control組(1.03±0.12)和空白組(1.00±0.07)(P<0.05),而sh-Control組與空白組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞增殖活性比較

    sh-MUC16組培養(yǎng)24、48、72和96 h細(xì)胞增殖活性(A值)低于sh-Control組和空白組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

    表1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性(A值)比較

    圖1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性(A值)比較

    2.3 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

    sh-MUC16組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于sh-Control組和空白組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2和圖3。

    表2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

    圖2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞遷移情況(×200)

    圖3 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞侵襲情況(×200)

    2.4 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組MUC16、E-Cad和N-Cad表達(dá)比較

    sh-MUC16組MUC16和N-Cad相對(duì)表達(dá)量均低于sh-Control組和空白組(P<0.05),E-Cad相對(duì)表達(dá)量高于sh-Control組和空白組(P<0.05)。sh-Control組與空白組之間MUC16、E-Cad和N-cad相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖4。

    表3 3個(gè)組MUC16、E-Cad和N-Cad相對(duì)表達(dá)量比較

    圖4 3個(gè)組MUC16、E-Cad和N-Cad表達(dá)免疫印跡圖

    3 討論

    骨肉瘤是一種起源于間充質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤,臨床目前以手術(shù)切除輔以化療的綜合治療方案為主,但復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,從分子生物學(xué)角度尋找與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的敏感基因,為腫瘤的早期診療及改善預(yù)后提供了新的方向。

    黏蛋白作為一種高相對(duì)分子質(zhì)量、高度糖基化的蛋白,參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展,且與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[9]。MUC16蛋白是黏蛋白家族中最大的一種,定位于人染色體19p13.2,其陽(yáng)性表達(dá)可促進(jìn)膽囊癌的發(fā)生,與膽囊癌的惡性程度和浸潤(rùn)程度密切相關(guān),可作為膽囊癌的標(biāo)志物[10]。另外,MUC16還與多種腫瘤相關(guān),可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[11],也可作為卵巢癌重要的免疫治療靶基因[12]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染干擾序列的方法特異性沉默U2OS細(xì)胞中MUC16基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,sh-MUC16組MUC16 mRNA和蛋白表達(dá)量均低于sh-Control組和空白組(P<0.05),說(shuō)明sh-MUC16組MUC16表達(dá)被成功抑制。有研究結(jié)果顯示,MUC16過(guò)表達(dá)可賦予上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞抗凋亡的能力[13]。本研究結(jié)果顯示,sh-MUC16組培養(yǎng)24、48、72和96 h細(xì)胞增殖活性低于sh-Control組和空白組(P<0.05),說(shuō)明沉默U2OS細(xì)胞的MUC16基因表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖活性,提示MUC16可能參與了骨肉瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程。KANWAL等[14]發(fā)現(xiàn),MUC16基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示,sh-MUC16組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于sh-Control組和空白組(P<0.05),說(shuō)明沉默U2OS細(xì)胞中的MUC16基因表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移和侵襲,提示MUC16與骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)。

    目前,關(guān)于MUC16參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究較多。SHEN等[15]的研究結(jié)果顯示,MUC16通過(guò)Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化介導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2表達(dá)增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。李新等[16]的研究結(jié)果表明,MUC16通過(guò)磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路調(diào)節(jié)膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移。MUC16的C'端通過(guò)與β-連環(huán)蛋白的相互作用激活Wnt信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲中發(fā)揮了重要作用[18],而在這個(gè)過(guò)程中,上皮標(biāo)志物E-Cad表達(dá)減少,間充質(zhì)標(biāo)志物N-Cad表達(dá)增多,從而使骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力更強(qiáng)[19]。本研究結(jié)果顯示,sh-MUC16組N-Cad相對(duì)表達(dá)量低于sh-Control組和空白組(P<0.05),而E-Cad相對(duì)表達(dá)量高于sh-Control組和空白組(P<0.05),說(shuō)明沉默U2OS細(xì)胞中的MUC16基因表達(dá)可抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

    本研究尚有不足之處:(1)未設(shè)計(jì)干擾后恢復(fù)表達(dá)的實(shí)驗(yàn);(2)僅選用了1株細(xì)胞,未用第2株骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證;(3)未深入探討MUC16的具體作用過(guò)程及涉及的信號(hào)通路。下一階段將開(kāi)展多株骨肉瘤細(xì)胞的研究,同時(shí)對(duì)可能涉及的機(jī)制開(kāi)展進(jìn)一步的驗(yàn)證性研究。

    綜上所述,沉默U2OS細(xì)胞中的MUC16基因表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖活性,減少細(xì)胞遷移和侵襲,其機(jī)制可能與抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

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