EUCAST和CLSI微量肉湯稀釋法白念珠菌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果比較

張亞茹， 凌麗燕， 陳 敏

（1.平湖市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 平湖 314201；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，上海 200003）

近年來(lái)，深部真菌感染的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，患者病死率占住院患者病死率的40%～60%，深部真菌感染引起的侵襲性真菌病（invasive fungal disease，IFD）已成為威脅免疫功能低下患者生命安全的主要因素之一[1-2]。念珠菌病是由念珠菌屬，尤其是白念珠菌（Candida albicans）引起的一種真菌病，該病原菌既可侵犯皮膚和黏膜，又能累及內(nèi)臟，引發(fā)侵襲性或深部器官念珠菌病，如念珠菌血癥、慢性播散性或肝脾念珠菌病、心內(nèi)膜炎[3]。另外，由于廣譜抗菌藥物、抗癌藥物、免疫抑制劑的泛用和侵入性診療操作、器官移植的廣泛開(kāi)展，以及人口老齡化等原因，念珠菌病的發(fā)病率大大增高，已成為臨床常見(jiàn)侵襲性真菌感染性疾病，該病進(jìn)展迅速、診斷困難，患者預(yù)后差，非治療患者死亡率＞90%，由白念珠菌引起的侵襲性念珠菌病已成為院內(nèi)獲得性感染的第四大病因[4]。目前，臨床對(duì)念珠菌病的治療依然是首選使用藥物[5-7]。在念珠菌病高危和發(fā)病人群中，使用抗真菌藥物進(jìn)行預(yù)防和經(jīng)驗(yàn)治療，在某些情況下，因抗真菌藥物之間存在交叉耐藥性，使得真菌耐藥情況日益嚴(yán)重，是臨床治療失敗的主要原因之一[8-9]。隨著被感染患者的增多，抗真菌藥物使用范圍的擴(kuò)大，以及真菌耐藥性的變遷，對(duì)念珠菌進(jìn)行與臨床相關(guān)的、可重復(fù)的抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)的需求日益增多。念珠菌體外藥物敏感性試驗(yàn)方法主要有微量肉湯稀釋法、比色法、紙片擴(kuò)散法和濃度梯度擴(kuò)散法等。2020年，美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST ）均發(fā)布了最新的微量肉湯稀釋法用于酵母菌體外藥物敏感性試驗(yàn)[10-13]。2種方法在操作上存在一些差異，但對(duì)念珠菌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果有無(wú)差異，鮮有報(bào)道。本研究分別采用EUCAST方法和CLSI方法檢測(cè)白念珠菌對(duì)8種常用抗真菌藥物的敏感性，分析2種方法檢測(cè)結(jié)果的差異，為臨床實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株收集和鑒定

收集2018—2019年上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌株庫(kù)保存的42株分離自臨床送檢肺泡灌洗液、穿刺液、引流液和清潔中段尿等體液樣本的白念珠菌非重復(fù)株。所有菌株均采用發(fā)法國(guó)生物梅里埃公司基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行鑒定和復(fù)核，不一致結(jié)果采用真菌ITS DNA序列分析進(jìn)行確認(rèn)。質(zhì)控菌株近平滑念珠菌（ATCC 22019）和克柔念珠菌（ATCC258）標(biāo)準(zhǔn)菌株由上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌庫(kù)提供。

1.2 方法

1.2.1 制備菌懸液 將保存于-80 ℃的目標(biāo)菌株復(fù)蘇，于PDA平板[PDA培養(yǎng)基（粉末）購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司]35 ℃培養(yǎng)48 h后傳代，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h。選取直徑≥1 mm的菌落5個(gè)，懸浮于5 mL滅菌0.9%NaCl溶液中，渦旋震蕩15 s，調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，制備成濃度為?～5）×106CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 制備接種懸液 （1）EUCAST方法：將制備的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙河煤?%葡萄糖的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）1∶5稀釋，制備成2倍終濃度為（2～10）×105CFU/mL的接種懸液。（2）CLSI方法：將制備的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙河煤?.2%葡萄糖的RPMI-1640培養(yǎng)基1∶100稀釋，再1∶10稀釋，制備成2倍終濃度為（1～5）×103CFU/mL的接種懸液。

1.2.3 體外藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)EUCAST和CLSI相關(guān)文件[10-13]，選用8種抗真菌藥物（兩性霉素B、阿尼芬凈、卡泊芬凈、氟康唑、伊曲康唑、米卡芬凈、泊沙康唑和伏立康唑）進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。（1）EUCAST要求：用含2%葡萄糖的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋抗真菌藥物至2倍終濃度（氟康唑?yàn)?.125～64 mg/L，其他7種抗真菌藥均為0.008～4 mg/L）。（2）CLSI要求：用RPMI-1640培養(yǎng)基將抗真菌藥物稀釋至上述濃度；鋪96孔板（美國(guó)Costor公司），每橫排為1種藥物，按照2倍濃度梯度稀釋抗真菌藥物，每孔各加入100 μL抗真菌藥物和100 μL菌懸液，每種藥物至少進(jìn)行1次重復(fù)。設(shè)定陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔。EUCAST方法使用平底96孔板，CLSI方法使用U形底96孔板進(jìn)行孵育。

1.2.4 結(jié)果判讀 將包被好的96孔板置于微生物培養(yǎng)箱，35 ℃培養(yǎng)24 h。EUCAST方法結(jié)果根據(jù)450 nm處最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）進(jìn)行判讀，CLSI方法結(jié)果通過(guò)肉眼觀察到的真菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行判讀。所有試驗(yàn)均重復(fù)2次，以保證數(shù)據(jù)的有效性。判讀標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)比生長(zhǎng)對(duì)照，兩性霉素B判讀點(diǎn)為完全抑制或顯著減少（抑制率≥50%）；其他7種藥物MIC為對(duì)應(yīng)的MIC值，MIC超出試驗(yàn)范圍的按最高試驗(yàn)濃度2倍記錄，低于試驗(yàn)范圍則按最低試驗(yàn)濃度記錄。

1.2.5 結(jié)果分析 比較2種方法的基本一致性（essential agreement，EA）、分類一致性（categorical agreement，CA）、極重大誤差率（very major error，VME）和重大誤差率（major error，ME）。EA指2種方法結(jié)果相差不超過(guò)2個(gè)濃度梯度的菌株占所有菌株的百分比；CA指2種方法結(jié)果（耐藥/中介/敏感）相同的菌株占所有菌株的百分比；VME指2種方法中一種為耐藥，另一種為敏感的菌株占所有菌株的百分比；ME是指2種方法中一種為中介，另一種為敏感或耐藥的菌株占所有菌株的百分比。以EA≥90%、CA≥95%、VEM≤1.5%、ME≤3%為標(biāo)準(zhǔn)，判定為2種方法結(jié)果具有一致性[14-15]。

2 結(jié)果

2.1 2種方法MIC值分布

采用EUCAST方法和CLSI方法分別對(duì)42株白念珠菌進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，對(duì)照孔中的白念珠菌在U形底和平底96孔板中均生長(zhǎng)良好，兩性霉素B、阿尼芬凈、卡泊芬凈、氟康唑、伊曲康唑、米卡芬凈、泊沙康唑和伏立康唑的MIC均具有典型性。除EUCAST方法卡泊芬凈MIC值高于CLSI方法外，其他7種抗真菌藥物EUCAST方法的MIC結(jié)果均比CLSI方法的MIC結(jié)果低1～2個(gè)稀釋倍數(shù)。EUCAST方法和CLSI方法的總體EA分別為95.2%（氟康唑）、97.6%（米卡芬凈）和100.0%（兩性霉素B、阿尼芬凈、卡泊芬凈、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑）。見(jiàn)表1。

表1 2種方法檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 2種方法一致性分析

CLSI方法尚無(wú)白念珠菌兩性霉素B、伊曲康唑和泊沙康唑的臨床折點(diǎn)，參考流行病學(xué)折點(diǎn)區(qū)別野生型和非野生型[16]。根據(jù)EUCAST和CLSI公布的白念珠菌臨床折點(diǎn)（表2），對(duì)2種方法檢測(cè)白念珠菌藥物敏感性的一致性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，兩性霉素B、阿尼芬凈和米卡芬凈2種方法CA為100%；氟康唑EUCAST方法有4株耐藥，2株中介，而CLSI方法這6株菌均為耐藥；伏立康唑有1株EUCAST方法為耐藥，CLSI方法為中介；泊沙康唑EUCAST方法有4株耐藥、1株中介，CLSI方法這5株菌均為耐藥；伊曲康唑有8株2種方法均為耐藥。見(jiàn)表3。

表2 CLSI和EUCAST微量肉湯稀釋法白念珠菌抗真菌藥物敏感性折點(diǎn)

表3 CLSI和EUCAST方法白念珠菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果一致性分析

3 討論

本研究分別采用EUCAST和CLSI推薦的微量肉湯稀釋法分析了42株白念珠菌對(duì)8種臨床常用抗真菌藥物的藥物敏感性，結(jié)果顯示，除卡泊芬凈外，7種抗真菌藥物EUCAST方法的MIC值比CLSI方法的MIC值低1～2個(gè)稀釋倍數(shù)（卡泊芬凈EUCAST方法的MIC高于CLSI的MIC），幾何均數(shù)EUCAST方法也低于CLSI方法，與PFALLER等[16]的研究結(jié)果一致，本研究卡泊芬凈的結(jié)果與PHILIPS等[17]的研究結(jié)果差異較大，可能與不同研究選擇的方法不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，2種方法的總體EA和CA均為95.2%～100%，提示2種方法的一致性較好；氟康唑的ME為4.8%，泊沙康唑的VME為2.4%，藥物敏感性符合率較差。PFALLER等[16]的研究結(jié)果顯示，114株白念珠菌2種方法的EA和CA均＜95.2%，伊曲康唑和泊沙康唑的VME分別為7.9%和6.4%，而本研究只有泊沙康唑的VME高于要求的1.5%，相比之下，本研究的一致性更好。

EUCAST和CLSI均已將其抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化，為協(xié)調(diào)這2種方法的臨床折點(diǎn)做出了巨大努力，調(diào)整了念珠菌氟康唑的臨床折點(diǎn)，減少了2種方法結(jié)果的差異[18]；泊沙康唑在體外對(duì)白念珠菌的敏感性高于氟康唑，適合用于治療口咽念珠菌病，但不適用于治療侵襲性念珠菌病，BEREDAKI等[19]在侵襲性念珠菌病的體外藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)（pharmacokinetics/pharmacodynamics，PK/PD）模型中探索了泊沙康唑?qū)Π啄钪榫寞熜?，發(fā)現(xiàn)其流行病學(xué)界值為0.06 mg/L。而EUCAST公布的臨床折點(diǎn)也為0.06 mg/L。本研究中，2種方法氟康唑和泊沙康唑的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果符合率較差，可能與2種藥物在結(jié)果判讀時(shí)使用了相同的折點(diǎn)有關(guān)。EUCAST要求的菌濃度為（1～5）×105CFU/mL，CLSI要求的菌濃度為（0.5～2.5）×103CFU/mL，最大濃度相差1 000倍，當(dāng)使用相同折點(diǎn)判讀時(shí)，由于培養(yǎng)基成分、微孔板類型，以及判讀方式不同，很容易使結(jié)果有差異。

卡泊芬凈EUCAST折點(diǎn)尚未公布，由于3種棘白菌素之間存在高度交叉耐藥性，對(duì)阿尼芬凈和米卡芬凈均為敏感的分離株應(yīng)被視為對(duì)卡泊芬凈敏感。對(duì)阿尼芬凈和米卡芬凈（如阿尼芬凈敏感和米卡芬凈耐藥）分類不一致的分離株，應(yīng)通過(guò)耐藥基因測(cè)序進(jìn)一步分析[20]。本研究中，阿尼芬凈和米卡芬凈的敏感性均為100%，與上海地區(qū)白念珠菌對(duì)棘白菌素類藥物的敏感性一致[21]。近年來(lái)，有指南[22]已將新型棘白菌素類藥物列入念珠菌血癥的初始用藥（強(qiáng)烈推薦）。

綜上所述，盡管EUCAST和CLSI方法對(duì)白念珠菌孢子濃度、培養(yǎng)基成分、微孔板類型，以及判讀方式有所不同，但本研究結(jié)果顯示，2種方法白念珠菌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果具有較好的一致性，但氟康唑和泊沙康唑的藥物敏感性符合率未達(dá)到要求，可能與本研究參考的折點(diǎn)有關(guān)系。不同的臨床分離株使用不同的方法對(duì)常見(jiàn)抗真菌藥物的耐藥性基本一致，但少數(shù)仍然需要協(xié)調(diào)，正確的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果能夠幫助臨床實(shí)現(xiàn)對(duì)念珠菌感染的合理用藥，為臨床有效診斷、治療真菌病提供參考。