革蘭染色與MALDI-TOF MS在快速鑒定兒童陽(yáng)性血培養(yǎng)病原菌種類中的應(yīng)用

楊 溪， 宋文琪， 董 方， 孟慶盈， 甄景慧， 周 為

（國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100045）

血流感染是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病，病死率高、預(yù)后差。全球每年約有300萬的新生兒患有敗血癥，死亡率為11%～19%[1]。2016年，我國(guó)因敗血癥死亡的≤5歲兒童占總死亡例數(shù)的2.5%[2]。及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷兒童血流感染非常重要。目前，臨床診斷兒童血流感染的重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)仍為血培養(yǎng)結(jié)果，該方法需將報(bào)陽(yáng)后的血培養(yǎng)轉(zhuǎn)種至固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h，甚至更長(zhǎng)時(shí)間后，分離出單個(gè)菌落，再進(jìn)行細(xì)菌鑒定，結(jié)果報(bào)告周期長(zhǎng)。而將陽(yáng)性血培養(yǎng)物直接進(jìn)行革蘭染色鏡檢可了解病原菌的初步判斷結(jié)果，但是不能鑒定出具體菌種。有研究發(fā)現(xiàn)，將無菌體液樣本中的病原菌進(jìn)行富集處理后，再使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）進(jìn)行快速鑒定，可以大大縮短細(xì)菌鑒定時(shí)長(zhǎng)。本研究以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)革蘭染色鏡檢和MALDI-TOF MS直接快速鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，為臨床提供快速、準(zhǔn)確的兒童血流感染實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集2019年2月—2020年10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院臨床送檢的陽(yáng)性兒童需氧血培養(yǎng)瓶。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）和大腸埃希菌（ATCC 25922）、糞腸球菌（ATCC 19433）、光滑念珠菌（ATCC MYA-2950）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.2 儀器和試劑

美國(guó)BD公司兒童需氧血培養(yǎng)瓶（BD BACTEC Peds Plus/F Culture Vials）和BACTEC FX全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)，鄭州安圖公司哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板（不加抗菌藥物），法國(guó)生物梅里埃公司MALDI-TOF MS儀、MS-DS靶板、α-氰基-4-羥基肉桂酸（alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA）基質(zhì)、甲酸和革蘭染色液，德國(guó)布魯克公司Sepsityper Kit，日本奧林巴斯公司BX53（LED）生物顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 轉(zhuǎn)種培養(yǎng) 用1 mL一次性無菌注射器從陽(yáng)性兒童需氧血培養(yǎng)瓶中抽取0.5 mL液體，同時(shí)接種于哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板（不加抗菌藥物），分區(qū)劃線，置于35 ℃ 5%～10% CO2孵箱中孵育18～24 h。再用MALDI-TOF MS儀對(duì)培養(yǎng)出的單個(gè)菌落進(jìn)行鑒定，嚴(yán)格按照儀器說明書操作。

1.3.2 革蘭染色鏡檢 用1 mL一次性無菌注射器從陽(yáng)性兒童需氧血培養(yǎng)瓶中抽取0.5 mL液體進(jìn)行革蘭染色涂片鏡檢。

1.3.3 MALDI-TOF MS快速鑒定 從陽(yáng)性兒童需氧血培養(yǎng)瓶中抽取1 mL液體，采用Sepsityper Kit進(jìn)行前處理。具體操作方法為：將1 mL陽(yáng)性兒童需氧血培養(yǎng)瓶中的液體注入eppendorf管中，加200 μL Lysis Buffer，漩渦震蕩15 s，混勻后16 200×g離心2 min，棄上清，在沉淀中加入1 mL Washing Buffer，漩渦震蕩30～60 s至沉淀完全溶解，16 200×g離心1 min，棄上清，取沉淀。將沉淀物點(diǎn)入MS-DS靶板，加1 μL MSCHCA基質(zhì)（若為真菌，則先加0.5 μL甲酸，再加1 μL MS-CHCA基質(zhì)），自然干燥后上機(jī)鑒定。嚴(yán)格按儀器說明書要求進(jìn)行操作。結(jié)果判斷：MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果分為3種顏色，綠色表示唯一的鑒定結(jié)果，可信概率為60.0%～99.9%；黃色表示低分辨率結(jié)果，可信概率＞60.0%，需要進(jìn)一步通過補(bǔ)充試驗(yàn)確認(rèn)；紅色表示不能鑒定，可信概率＜60.0%，與數(shù)據(jù)庫(kù)的任何質(zhì)譜數(shù)據(jù)均不匹配。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用例或率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果

共收集166例陽(yáng)性兒童血培養(yǎng)樣本，其中單一菌樣本162例（97.6%），2種菌樣本4例（2.4%）。162例單一菌樣本中，檢出革蘭陽(yáng)性菌95株（58.6%），以凝固酶陰性葡萄球菌最多（61.1%）；革蘭陰性菌63株（38.9%），以腸桿菌科細(xì)菌最多（76.2%）；酵母樣真菌4株（2.5%），包括3株白念珠菌和1株近平滑念珠菌；見表1。4例2種菌樣本轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果見表2。

表1 162例單一菌樣本3種方法鑒定結(jié)果比較

表2 4例2種菌樣本3種方法鑒定結(jié)果

2.2 革蘭染色鏡檢結(jié)果

與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果比較，162例單一菌樣本中，革蘭染色鏡檢結(jié)果符合率為97.5%（158/162），其中革蘭陽(yáng)性菌符合率為97.9%（93/95），革蘭陰性菌符合率為96.8%（61/63），酵母樣真菌鑒定符合率為100.0%（4/4）；4例2種菌樣本革蘭染色鏡檢結(jié)果與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后結(jié)果一致。見表1、表2。

2.3 MALDI-TOF MS快速鑒定結(jié)果

與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果比較，162例單一菌樣本中，MALDI-TOF MS快速鑒定結(jié)果符合率為85.2%（138/162），其中革蘭陽(yáng)性菌鑒定符合率為81.1%（77/95），革蘭陰性菌鑒定符合率為92.1%（58/63），酵母樣真菌鑒定符合率為75.0%（3/4）；4例2種菌樣本MALDI-TOF MS快速鑒定只能鑒定出其中1種菌。MALDITOF MS快速鑒定法對(duì)革蘭陰性菌的鑒定符合率明顯高于革蘭陽(yáng)性菌，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、表2。

2.4 不同報(bào)陽(yáng)時(shí)長(zhǎng)（time to positivity，PPT）MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果比較

162例單一菌樣本平均TTP為21 h，其中革蘭陽(yáng)性菌樣本平均TTP為23 h，革蘭陰性菌樣本平均TTP為18 h，酵母樣真菌樣本平均TTP為28 h。TTP≥21 h與TTP＜21 h比較，MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果符合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同TTP條件下，MALDI-TOF MS鑒定革蘭陰性菌的符合率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），鑒定革蘭陽(yáng)性菌的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同PPT質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表3、表4。

表3 不同TTP MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果比較 例

表4 不同TTP革蘭陰性菌樣本MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果比較 例

3 討論

在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作中，當(dāng)出現(xiàn)血培養(yǎng)陽(yáng)性時(shí)，需將陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本從血培養(yǎng)儀中取出進(jìn)行革蘭染色鏡檢，并在2 h內(nèi)將革蘭染色結(jié)果報(bào)告給臨床，同時(shí)將報(bào)陽(yáng)樣本轉(zhuǎn)種至固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)18～24 h或長(zhǎng)出單個(gè)菌落時(shí)，再進(jìn)行菌種鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)，該過程一般耗時(shí)1～2 d。革蘭染色鏡檢可在短時(shí)間內(nèi)獲知有無細(xì)菌，以及細(xì)菌大致的類型（革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陰性菌或真菌），但是革蘭染色鏡檢影響因素較多，易導(dǎo)致結(jié)果的誤判誤報(bào)[3-4]。而MALDI-TOF MS可以直接將陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中的病原菌鑒定到種，樣本前處理方法包括去污劑選擇裂解法、滲透壓選擇裂解法、分離膠分離法、濾膜過濾分離法，操作簡(jiǎn)單、方便快捷，均可在1 h內(nèi)獲得細(xì)菌鑒定結(jié)果[5-6]。

本研究收集的162例單一菌兒童需氧血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本中最常見的病原菌為革蘭陽(yáng)性菌，占58.6%，革蘭陰性菌占38.9%，酵母樣真菌占2.5%，與多數(shù)兒科醫(yī)院血流感染病原菌分布[7-11]結(jié)果相似，均是以革蘭陽(yáng)性菌為主，最常見的是凝固酶陰性葡萄球菌（48.21%～55.7%）。但相關(guān)文獻(xiàn)顯示，2018—2019年全國(guó)血流感染病原菌以革蘭陰性菌（72.1%）為主，最常見的為大腸埃希菌（37.2%）和肺炎克雷伯菌（17.0%），可能與就診患者年齡差異有關(guān)[7-11]，提示兒童血流感染病原菌與成人有所不同。

本研究以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，革蘭染色鏡檢結(jié)果符合率為97.5%（158/162），有4例樣本與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后結(jié)果不一致，1株屎腸球菌與1株唾液鏈球菌被誤報(bào)為革蘭陰性桿菌，2株鮑曼不動(dòng)桿菌被誤報(bào)為革蘭陽(yáng)性菌，考慮可能與細(xì)菌形態(tài)不典型、染色偏差和鏡檢者缺乏臨床經(jīng)驗(yàn)有關(guān)[3-4]；MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果符合率（85.2%）低于革蘭陰性菌（92.1%），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[5，12-14]基本一致。本研究結(jié)果顯示，MALDITOF MS快速鑒定除凝固酶陰性葡萄球菌外的革蘭陽(yáng)性菌的符合率可達(dá)89.2%（33/37）。MALDI-TOF MS快速鑒定革蘭陽(yáng)性菌的符合率較低，可能與樣本前處理方法不當(dāng)或與數(shù)據(jù)庫(kù)局限性有關(guān)。CORDOVANA等[14]發(fā)現(xiàn)，可以通過改良Sepsityper Kit中樣本前處理的步驟來提高M(jìn)ALDI-TOF MS對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的鑒定符合率，如將Lysis Buffer的用量減半，或在使用Lysis Buffer和Washing Buffer的間隙增加一步水洗的過程，從而提高革蘭陽(yáng)性菌的鑒定符合率。也有研究發(fā)現(xiàn)，可以通過提取法和優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)等方法提高M(jìn)ALDI-TOF MS對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的鑒定符合率[15-17]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)TTP＜21 h時(shí)，MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定符合率較高（P＜0.05），與相關(guān)研究結(jié)果[13，18]一致；當(dāng)TTP＜21 h時(shí)，MALDI-TOF MS鑒定革蘭陰性菌的符合率更高；但不同TTP條件下，MALDITOF MS快速鑒定革蘭陽(yáng)性菌與傳統(tǒng)血培養(yǎng)符合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

TORRES等[19]發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性血培養(yǎng)的革蘭染色結(jié)果可以作為臨床早期調(diào)整經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療的依據(jù)，但是通過MALDI-TOF MS快速鑒定可以明顯提高最終接受正確抗菌藥物治療的患者比例（P=0.008）。NIWA等[20]的研究結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)種培養(yǎng)相比，通過MALDITOF MS快速鑒定血培養(yǎng)樣本中的病原菌，并將結(jié)果及時(shí)通知臨床，可以更早地指導(dǎo)臨床調(diào)整用藥方案，如將廣譜抗菌藥物改為有針對(duì)性的窄譜抗菌藥物、停止不恰當(dāng)或過度的抗菌藥物治療，從而將患者得到有效和最優(yōu)化的抗感染治療方案的時(shí)間分別縮短13.3和38.4 h；肝毒性、腎毒性和血小板減少等不良事件的發(fā)生率（分別為3.8%、1.1%和0%）與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)法（分別為12.2%、5.0%和4.4%）相比明顯降低（P＜0.05）；同時(shí)，臨床治療失敗率也由33.3%降至14.0%（P＜0.05）。對(duì)于兒科患者來說，陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中革蘭陰性桿菌的TTP是患兒住院死亡率、敗血癥休克的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)于兒科患者來說，陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中革蘭陰性桿菌的TTP是其患敗血癥休克的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，TTP越短，患兒的住院死亡率越高，住院費(fèi)用也會(huì)相應(yīng)增加[21-22]。所以，快速鑒定兒童陽(yáng)性血培養(yǎng)病原菌有重要的臨床意義。

革蘭染色鏡檢可以在短時(shí)間內(nèi)告知臨床病原菌的類別，但不能具體到種屬；而采用MALDI-TOF MS可以直接將陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中的病原菌鑒定到種。本研究采用Sepsityper Kit進(jìn)行樣本前處理僅需要幾分鐘，操作簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化。檢驗(yàn)人員在報(bào)告革蘭染色鏡檢結(jié)果的同時(shí)，通過MALDI-TOF MS可直接報(bào)告細(xì)菌鑒定的結(jié)果。本研究中，有4株菌革蘭染色鏡檢結(jié)果與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的結(jié)果不一致，但是經(jīng)過MALDI-TOF MS快速鑒定，此4株菌均被正確鑒定到種。對(duì)于MALDI-TOF MS未能鑒定出結(jié)果的樣本，革蘭染色鏡檢結(jié)果均與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果相符。但是，雖然MALDI-TOF MS能快速地將陽(yáng)性血培養(yǎng)中的病原菌鑒定到種，但也存在局限性，如對(duì)于沙門菌只能鑒定到屬，無法區(qū)分志賀菌與大腸埃希菌，真菌鑒定率低，對(duì)于2種菌樣本大多數(shù)只能鑒定出其中1種菌。本研究只收集到4例含酵母樣真菌的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本，MALDI-TOF MS鑒定符合率為75.0%（3/4）。而有研究共收集到194例含酵母樣真菌的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本，鑒定符合率僅為37.1%（72/194），但是通過優(yōu)化樣本前處理，可將其鑒定符合率提高至89.5%（68/76）[14]。許春燕等[5]的研究結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS真菌的種鑒定率也僅為32.4%（12/37）。本研究共收集到4例含有2種菌的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本，MALDI-TOF MS均只能鑒定出其中1種菌。但有研究發(fā)現(xiàn)，含2種菌的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中有12.5%～32.8%的樣本使用MALDI-TOF MS快速鑒定法能同時(shí)鑒定出其中所有的病原菌[12，14]。有學(xué)者通過將含2種菌的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本進(jìn)行短時(shí)培養(yǎng)，再用MALDITOF MS進(jìn)行快速鑒定，可將鑒定符合率提高至86.0%（43/50）[23]。

綜上所述，革蘭染色可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)兒童陽(yáng)性血培養(yǎng)中病原菌的類別做出初步判斷，而MALDI-TOF MS快速鑒定可以將其鑒定到種。革蘭染色與MALDI-TOF MS均可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)兒童陽(yáng)性血培養(yǎng)中的病原菌做出快速判斷，從而為臨床及時(shí)診治兒童血流感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，降低血流感染患兒病死率。