改良Carba Np試驗(yàn)和mCIM/eCIM快速鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌表型的臨床應(yīng)用

包海林， 花鴻燕， 孫恒亮， 劉 華， 吉順年， 秦陳浩， 杜 鴻

（1.海安市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 海安 226600；2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院微生物科，江蘇 蘇州 215004）

Carba NP試驗(yàn)和改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）是美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）先后推薦的用于檢測(cè)和鑒別腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵菌碳青霉烯酶的確證試驗(yàn)，CLSI推薦聯(lián)合乙二胺四乙酸碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)（ethylenediaminetetraacetic acid-carbapenem inactivation method，eCIM）用于產(chǎn)酶腸桿菌科細(xì)菌的檢測(cè)和酶型分析[1]。Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)低水解活性的碳青霉烯酶OXA-48時(shí)敏感性較低，僅為55.7%～70.9%[2]，且操作相對(duì)復(fù)雜，影響因素偏多。mCIM/eCIM需孵育2次，且美羅培南紙片在待測(cè)菌懸液中浸泡4 h，易因紙片總藥物含量降低而致假陽(yáng)性，不能達(dá)到快速檢測(cè)的目的[3]。本研究通過(guò)改良Carba NP試驗(yàn)，分別采用他唑巴坦和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）作為A和B類(lèi)酶抑制劑，以區(qū)分A、B、D類(lèi)酶，將mCIM/eCIM的2次孵育時(shí)間分別縮短至2和9 h，探討2種改良方法在檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2019年12月—2020年9月海安市中醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)腸桿菌科細(xì)菌136株，其中耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem resistantEnterobacteriaceae，CRE）86株[亞胺培南或美羅培南最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL]，碳青霉烯類(lèi)敏感菌株50株（亞胺培南、美羅培南均敏感）。標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705）和肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）均購(gòu)自我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 主要儀器與試劑

VITECK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀及配套鑒定藥敏卡板（法國(guó)生物梅里埃公司），ALL SHENG Auto-Pure 96磁珠法核酸提取儀（杭州奧盛公司），C1000 Thermal cycler PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc XR+凝膠成像儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），CP-31DN電泳儀（北京六一公司），血平板、MH瓊脂平板和亞胺培南西司他?。绹?guó)默沙東制藥有限公司），胰酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基[（tryptic soy broth，TSB），杭州百思生物技術(shù)有限公司]，10 μg美羅培南藥敏紙片（溫州康泰生物技術(shù)有限公司），DNA mark D2000，2×Taq master mix[生工生物工程（上海）有限公司]，MagMax-96DNA Multi-Sample Kit（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 改良Carba NP試驗(yàn) 在37 ℃培養(yǎng)24 h的MH平板上用1 μL接種環(huán)挑取1滿環(huán)受試菌株，加入裝有100 μL細(xì)菌總蛋白抽提液（Tris-HCl，20 mmol/L）的eppendorf管中，劇烈振蕩30 s，分裝于5個(gè)管，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，每管底物成分見(jiàn)表1；將pH值調(diào)至7.8±0.1，37 ℃孵育2 h。如菌株產(chǎn)碳青霉烯酶，會(huì)水解亞胺培南西司他丁，并釋放H+，使pH值降低，酚紅指示劑變色（紅變黃）；反之指示劑不變色。他唑巴坦管（Ⅲ）不變色為A類(lèi)酶， EDTA管（Ⅳ)不變色為B類(lèi)酶，2個(gè)管均變色 （Ⅴ）為D類(lèi)酶。陽(yáng)性對(duì)照菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705），陰性對(duì)照菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）。

表1 改良Carba NP試驗(yàn)底物成分

1.3.2 mCIM/eCIM試驗(yàn) 制備2管TSB肉湯（2 mL），其中1管含EDTA（終濃度為5 mmol/L）。用1 μL接種環(huán)刮取1滿環(huán)于血平板培養(yǎng)24 h的待測(cè)菌，分別加入含2 mL TSB肉湯的eppendorf管中，振蕩混勻。將美羅培南藥敏紙片（10 μg）浸入菌液中，35 ℃溫育2 h，制備成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希菌（ATCC 25922）懸液，均勻涂布在MH瓊脂平板上，反扣平板干燥5 min。用10 μL接種環(huán)將美羅培南紙片貼于試管內(nèi)壁，去除多余菌液后取出，再貼到同一MH瓊脂平板上。35 ℃溫箱孵育9 h，測(cè)量抑菌圈直徑。結(jié)果判斷：（1）美羅培南藥敏紙片的抑菌圈直徑為6～15 mm，或直徑為16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，判定為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株；抑菌圈直徑≥19 mm為陰性；（2）mCIM陽(yáng)性和eCIM抑菌圈直徑的差值≥5 mm，判定為產(chǎn)金屬酶；若差值≤4 mm，判定為產(chǎn)絲氨酸酶。mCIM陰性時(shí)，eCIM無(wú)需再判斷；eCIM抑菌圈內(nèi)散在的針尖樣菌落可以忽略不計(jì)。陽(yáng)性對(duì)照菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1705），陰性對(duì)照菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA1706）。

1.3.3 碳青霉烯酶基因擴(kuò)增與檢測(cè) 采用磁珠法提取待測(cè)菌基因組DNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。參照文獻(xiàn)[4-5]設(shè)計(jì)碳青霉烯酶基因bla、bla、bla、bla和bla[2]引kpc-2NDM-1IMP-4VIM-1OXA-48物（表2）。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增體系：上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq master mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s；56 ℃退火60 s；72 ℃ 5 min，32個(gè)循環(huán)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，用凝膠成像儀拍照。

表2 PCR引物序列及目的片段長(zhǎng)度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例或率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

86株CRE菌株中，有81株檢出碳青霉烯酶基因，其中43株攜帶blakpc-2，32株攜帶blaNDM-1，4株攜帶blaIMP-4，2株共同攜帶blakpc-2和blaNDM-1基因；5株未檢出耐藥基因。有53株肺炎克雷伯菌檢出耐藥基因，其中39株攜帶blakpc-2基因，9株攜帶blaNDM-1，3株攜帶blaIMP-4，2株同時(shí)攜帶blakpc-2和blaNDM-1。有20株大腸埃希菌耐藥基因陽(yáng)性，其中18株攜帶blaNDM-1，2株攜帶blakpc-2。50株碳青霉烯敏感腸桿菌科細(xì)菌均未檢出耐藥基因。見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 blakpc-2基因電泳結(jié)果

圖2 blaNDM-1基因電泳結(jié)果

圖3 blaIMP-4基因電泳結(jié)果

2.2 2種方法碳青霉烯酶表型篩查結(jié)果

86株CRE中，改良Carba NP試驗(yàn)陽(yáng)性82株，陰性4株；mCIM陽(yáng)性78株，陰性8株。改良Carba NP試驗(yàn)與mCIM陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.65，P＞0.05）。eCIM陽(yáng)性36株，陰性42株（有8株mCIM陰性，eCIM無(wú)需解釋結(jié)果）。50株碳青霉烯類(lèi)敏感菌株中，改良Carba NP試驗(yàn)、mCIM/eCIM均陰性。43株A類(lèi)碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中，改良Carba NP試驗(yàn)陽(yáng)性42株，陰性1株；mCIM陽(yáng)性41株，陰性2株；eCIM陽(yáng)性3株，陰性38株，無(wú)效2株。36株B類(lèi)碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中，改良Carba NP試驗(yàn)、mCIM均為陽(yáng)性，3株eCIM陰性。2株同時(shí)攜帶blakpc-2和blaNDM-1的菌株改良Carba NP試驗(yàn)、mCIM/eCIM均為陰性。部分CRE菌株改良Carba NP試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。部分菌株mCIM/eCIM結(jié)果見(jiàn)圖5?；驒z測(cè)和表型篩查結(jié)果見(jiàn)表3。

圖4 部分CRE改良Carba NP試驗(yàn)結(jié)果

圖5 部分菌株mCIM/eCIM碳青霉烯酶表型篩查結(jié)果

表3 2種方法基因檢測(cè)和表型篩查結(jié)果

2.3 改良Carba NP試驗(yàn)和mCIM檢測(cè)CRE的效能

改良Carba NP試驗(yàn)和mCIM檢測(cè)CRE的敏感性分別為96.3%和91.4%，特異性均為92.7%，與PCR檢測(cè)結(jié)果的一致性均較高。見(jiàn)表4。

表4 改良Carba NP試驗(yàn)和mCIM表型檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 改良Carba NP試驗(yàn)碳青霉烯酶分型檢測(cè)效能

82株改良Carba NP試驗(yàn)陽(yáng)性菌株中，42株（97.7%）檢出A類(lèi)碳青霉烯酶，36株（43.9%）檢出B類(lèi)碳青霉烯酶菌株。見(jiàn)表5。

表5 改良Carba NP試驗(yàn)與PCR分型結(jié)果比較

2.5 eCIM檢測(cè)金屬碳青霉烯酶的效能

eCIM檢測(cè)金屬碳青霉烯酶的敏感性和特異性分別為91.2%和90.4%，檢測(cè)絲氨酸碳青霉烯酶的敏感性和特異性分別為93.0%和94.3%。與PCR結(jié)果一致性較好（kappa值＞0.75）。見(jiàn)表6。

表6 eCIM與PCR檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物在治療腸桿菌科細(xì)菌感染性疾病中的應(yīng)用，CRE的檢出率逐年上升[6]。碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌感染導(dǎo)致的死亡患者例數(shù)增加得最多[7]。有研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為26.6%和27.2%[6]。目前，臨床判斷細(xì)菌是否對(duì)碳青霉烯耐藥主要依靠體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，但一些CRE的MIC可能低于美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)或歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)確定的耐藥折點(diǎn)，主要原因是一些產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的水解能力較弱，導(dǎo)致體外試驗(yàn)結(jié)果為敏感的菌株實(shí)際臨床表現(xiàn)為耐藥；同時(shí)，抗菌藥物對(duì)不同產(chǎn)酶類(lèi)型菌株的治療效果有很大區(qū)別[8]。因此，鑒別菌株產(chǎn)酶類(lèi)型非常重要。

目前，碳青霉烯酶的檢測(cè)方法通常為表型檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR或多重PCR、二代測(cè)序等。表型檢測(cè)簡(jiǎn)便、快捷，其中Carba NP試驗(yàn)和mCIM是有望在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室推廣使用的2種方法，但存在某些碳青霉烯酶表型檢測(cè)敏感性差、耗時(shí)長(zhǎng)、不利于臨床常規(guī)開(kāi)展等缺點(diǎn)。本研究在Carba NP試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別增加了他唑巴坦和EDTA作為A類(lèi)和B類(lèi)碳青霉烯酶抑制劑，以此來(lái)區(qū)分A、B、D類(lèi)酶。若含亞胺培南西司他丁管變色即為陽(yáng)性；含他唑巴坦管不變色即為產(chǎn)A類(lèi)酶菌株，含EDTA管不變色即為產(chǎn)B類(lèi)酶菌株，含他唑巴坦和EDTA管都變色即為產(chǎn)D類(lèi)酶菌株。值得注意的是，Carba NP試驗(yàn)的原理是利用細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶水解亞胺培南產(chǎn)生H+，使pH值下降，指示劑變色，所以pH值必須調(diào)節(jié)在7.8±0.1才能靈敏地發(fā)生顏色變化。

本研究結(jié)果顯示，改良Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)CRE的敏感性為96.3%、特異性為92.7%，與PCR結(jié)果一致性較好。有研究發(fā)現(xiàn)，黏液性菌株可致Carba NP試驗(yàn)假陰性[9]。本研究中，有3株肺炎克雷伯菌改良Carba NP試驗(yàn)假陰性，這3株肺炎克雷伯菌均為黏液性菌株。本研究結(jié)果顯示，改良Carba NP試驗(yàn)對(duì)于單獨(dú)攜帶blakpc-2基因或blaIMP-4基因的菌株比較敏感，而對(duì)于同時(shí)攜帶這2種基因的菌株敏感性較差?？傮w來(lái)看，改良Carba NP試驗(yàn)可以快速地為臨床提供產(chǎn)酶菌株的分型結(jié)果。

本研究將mCIM孵育時(shí)間由4 h縮短至2 h，將美羅培南紙片轉(zhuǎn)種至MH平板孵育時(shí)間縮短至9 h，結(jié)果顯示，mCIM檢測(cè)碳青霉烯酶的敏感性為92.6%，特異性為94.5%，與PCR結(jié)果一致性較高。本研究結(jié)果顯示，基因檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株中有2株大腸埃希菌和2株弗勞地枸櫞酸桿菌mCIM結(jié)果為陰性，可能與美羅培南紙片孵育時(shí)間或MH平板孵育時(shí)間過(guò)短、碳青霉烯酶陽(yáng)性菌株酶釋放過(guò)少，或藥物敏感性試驗(yàn)中菌株培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致的假陰性有關(guān)，后續(xù)將調(diào)整孵育時(shí)間，改進(jìn)試驗(yàn)方法；有2株碳青霉烯類(lèi)耐藥大腸埃希菌基因檢測(cè)和mCIM均陰性，可能與其耐藥機(jī)制[10]有關(guān)；改良Carba NP試驗(yàn)假陰性的3株肺炎克雷伯菌mCIM陽(yáng)性，mCIM假陰性的2株大腸埃希菌和2株弗勞地枸櫞酸桿菌改良Carba NP試驗(yàn)陽(yáng)性，原因可能為eCIM利用EDTA抑制金屬酶來(lái)區(qū)分產(chǎn)金屬酶和絲氨酸酶的耐藥菌株，而本研究eCIM篩選金屬碳青霉烯酶的敏感性為91.2%，特異性為90.4%，低于相關(guān)研究[11-13]結(jié)果，可能與菌株數(shù)過(guò)少或孵育時(shí)間過(guò)短有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，eCIM檢測(cè)結(jié)果亦與EDTA的濃度有關(guān)，EDTA濃度為30 mmol/L時(shí)，檢測(cè)陽(yáng)性率最高[14]。對(duì)于同時(shí)攜帶blakpc-2基因和blaIMP-4基因的菌株，mCIM無(wú)法鑒別。

有研究結(jié)果顯示，第三代頭孢菌素與新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合劑，如頭孢他啶-阿維巴坦，對(duì)產(chǎn)KPC酶和OXA-48酶CRE具有高度的抑制作用，但對(duì)產(chǎn)NDM類(lèi)金屬酶CRE則無(wú)效[15]。對(duì)于產(chǎn)金屬酶的致病菌株，可采用氨曲南-阿維巴坦或頭孢地爾治療[16]。有研究結(jié)果顯示，泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌僅對(duì)替加環(huán)素、多黏菌素和頭孢他啶-阿維巴坦敏感[17]，因此應(yīng)盡早開(kāi)展耐碳青霉烯類(lèi)細(xì)菌的表型檢測(cè)和藥物敏感性試驗(yàn)，為臨床提供有效的治療依據(jù)。

綜上所述，改良Carba NP試驗(yàn)通過(guò)觀察顏色變化判斷結(jié)果，直觀且可靠，可快速鑒定碳青霉烯酶表型；mCIM/eCIM也可在1 d內(nèi)完成分型報(bào)告。2種改良方法可優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高分型準(zhǔn)確率和效率，及時(shí)為臨床用藥提供參考。