AS患者sLAIR-1和LAIR-1 mRNA的表達及其與疾病活動度的關系

何亞亞， 陳閃閃， 李永勝， 劉 娟

（1.南京醫(yī)科大學附屬淮安市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 淮安 223300；2.南京醫(yī)科大學附屬淮安市第一人民醫(yī)院風濕免疫科，江蘇 淮安 223300）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性、多系統(tǒng)的炎癥性自身免疫性疾病，主要影響中軸關節(jié)[1]。有研究結果顯示，AS的發(fā)病過程與T細胞功能障礙密切相關，AS患者外周血輔助性T細胞（T helper cell，Th）17占CD4+T細胞的比例顯著增加[2]。此外，固有免疫活化在AS的發(fā)病機制中同樣發(fā)揮著重要作用。來自腸道細菌的脂多糖可通過激活單核細胞和巨噬細胞上的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4顯著增強人白細胞抗原B27（human leukocyte antigen B27，HLA-B27）未折疊蛋白誘發(fā)的細胞因子分泌能力?；罨木奘杉毎泊龠M了白細胞介素（interleukin，IL）-23的分泌和Th17細胞的激活。白細胞相關免疫球蛋白樣受體-1（leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1，LAIR-1）是在多種免疫細胞上表達的免疫球蛋白超家族成員，可通過發(fā)揮免疫抑制功能維持T細胞和巨噬細胞等免疫細胞的平衡[3]。LAIR-1可在多種自身免疫性疾病中異常表達，但在AS中是否存在表達異常尚未見相關報道。為此，本研究擬分析血清可溶性白細胞相關免疫球蛋白樣受體-1（soluble leukocyte-associated immunoglobulinlike receptor-1，sLAIR-1）和外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中LAIR-1 mRNA表達的變化，及其與AS患者疾病活動度之間的關系；并分析sLAIR-1和LAIR-1 mRNA在抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）生物制劑英孚利昔單抗治療前后的變化，探討將其定為AS生物標志物的可能性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年9月—2021年6月南京醫(yī)科大學附屬淮安市第一人民醫(yī)院AS患者81例（AS組），其中男67例、女14例，年齡（32.58±12.94）歲。AS診斷依據國際強直性脊柱炎協(xié)會（the Assessment of Spondyl Arthritis International Society，ASAS）2010年發(fā)布的診斷標準[4]。排除標準：合并冠心病、活動性感染、糖尿病、多囊卵巢綜合征、肝臟疾病、腎臟疾病和腫瘤等。另選取南京醫(yī)科大學附屬淮安市第一人民醫(yī)院健康體檢者80名（正常對照組），其中男68名、女12名，年齡（31.98±9.65）歲。排除標準：有慢性系統(tǒng)性疾病、任何類型的自身免疫性疾病、感染或惡性腫瘤；有類固醇、細胞毒性藥物和免疫抑制劑等用藥史。2個組之間年齡和性別差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。收集81例AS患者中17例活動期患者英孚利昔單抗（西安楊森制藥有限公司）治療6周后的sLAIR-1和LAIR-1 mRNA檢測結果，分析治療前后LAIR-1水平的變化。本研究經南京醫(yī)科大學附屬淮安市第一人民醫(yī)院倫理委員會審批，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集所有對象的一般資料[年齡、性別、吸煙史、體質量指數（body mass index，BMI）等]。收集AS患者的詳細病史資料[病程、治療方案、強直性脊柱炎疾病活動評分（ankylosing spondylitis disease activity score，ASDAS）等]和入院后首次實驗室檢測結果[白細胞（white blood cell，WBC）計數、淋巴細胞絕對數（the absolute value of lymphocyte，LYMPH#）、中性粒細胞絕對數（the absolute value of neutrophil，NEUT#）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、血小板（platelet，PLT）計數、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和HLA-B27]。詢問患者是否有炎癥性背痛、骶髂關節(jié)炎，并評估其抗TNF-α治療療效。疾病活動指標包括晨僵的持續(xù)時間、醫(yī)生的整體評估（0～10分）、患者的整體評估（0～10分）、ASDAS、CRP及關節(jié)壓痛和腫脹計數。ASDAS是評價AS疾病活動度新的綜合指標[5]，包括5項：（1）總體腰背痛程度；（2）患者總體評價；（3）外周關節(jié)疼痛腫脹程度；（4）晨僵持續(xù)時間；（5）ESR或CRP。ASDAS分為基于ESR（ASDAS-ESR）和基于CRP（ASDAS-CRP）2種評分方式，其中準確性更高的是ASDAS-CRP，計算公式為：ASDAS-CRP=0.12×腰背痛評分+0.06×晨僵持續(xù)時長+0.11×患者總體評價+0.07×外周關節(jié)腫脹/疼痛+0.58×ln（CRP+1）[6]。

1.2.2 樣本采集 采集所有患者入院治療前、正常對照者體檢當日的清晨空腹靜脈血6 mL，其中3 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，用于LAIR-1 mRNA檢測；另外3 mL置于干燥管中，離心分離血清后，保存于-80 ℃冰箱，用于血清sLAIR-1、IL-6及IL-17檢測。

1.2.3LAIR-1 mRNA檢測 采用熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測LAIR-1 mRNA。取1.0 mL乙二胺四乙酸抗凝血，與等體積磷酸鹽緩沖液混勻，緩慢加入Ficoll淋巴細胞分離液，密度梯度離心（400×g離心30 min），收集的中間層細胞即為PBMC。采用Trizol試劑（美國ThermoFisher Scientific公司）提取PBMC總RNA，采用iScript cDNA Synthesis kit（美國伯樂公司）將RNA逆轉錄為cDNA。采用SYBR Green PCR kit（美國伯樂公司）及ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）進行PCR擴增。反應條件：預變性95 ℃30 s，變性95 ℃ 5 s，40個循環(huán)；退火60 ℃30 s。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算LAIR-1 mRNA的相對表達量。嚴格按儀器和試劑盒說明書進行操作。 引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 sLAIR-1、IL-6及IL-17檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清sLAIR-1和IL-17水平，試劑盒購自美國R&D公司（貨號分別為DY2664-05、D1700）。采用cobas e602全自動電化學發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測血清IL-6水平。嚴格按儀器和試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 活動期AS患者英孚利昔單抗治療前后sLAIR-1和LAIR-1 mRNA的變化 從81例AS患者中選取17例活動期患者，均為男性，年齡（27.71±5.89）歲。采用抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）生物制劑英孚利昔單抗治療6周。分析治療前后sLAIR-1和LAIR-1 mRNA的變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用Spearman相關分析評估sLAIR-1、LAIR-1 mRNA與各項指標的相關性。AS患者英孚利昔單抗治療前后各項指標比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AS組和正常對照組臨床資料比較

AS組病程為8.00（3.50～61.00）個月，醫(yī)生整體評價為（5.35±2.04）分，患者整體評價為（6.28±2.11）分，晨僵時長為33（16～47）min，壓痛關節(jié)數為（2.25±1.58）個，腫脹關節(jié)數為（2.18±1.93）個，ASDAS-CRP為（2.98±1.30）分。81例AS患者中，22例（27.16%）有家族史，36例（44.44%）伴外周關節(jié)累及，28例（34.57%）合并葡萄膜炎，14例（17.28%）合并肌腱炎。AS組WBC計數、LYMPH#、PLT計數、CRP和ESR高于正常對照組（P＜0.05），2個組之間BMI、吸煙史和NEUT#差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 AS組與正常對照組臨床資料比較

2.2 AS組和正常對照組sLAIR-1、LAIR-1 mRNA 、IL-17及IL-6水平比較

AS組血清sLAIR-1、IL-17及IL-6水平顯著高于正常對照組（P＜0.001），而LAIR-1 mRNA水平則顯著低于正常對照組（P＜0.001）。見表3。

表3 AS組與正常對照組sLAIR-1、LAIR-1 mRNA 、IL-17及IL-6水平比較

2.3 AS患者sLAIR-1和LAIR-1 mRNA與各項指標之間的相關性

Spearman相關分析結果顯示，sLAIR-1與IL-17、IL-6、CRP、ASDAS-CRP呈正相關（r值分別為0.482 4、0.475 3、0.391 6、0.565 7，P＜0.01），與LAIR-1 mRNA呈負相關（r=-0.446 6，P＜0.001）；LAIR-1 mRNA與IL-17、IL-6、CRP、ASDAS-CRP呈負相關（r值分別為-0.399 6、-0.227 8、-0.265 1、-0.366 8，P＜0.05）。sLAIR-1、LAIR-1 mRNA與WBC計數、LYMPH#、PLT計數及ESR均無相關性（P＞0.05）。

2.4 活動期AS患者采用英孚利昔單抗治療前后sLAIR-1和LAIR-1 mRNA的變化

與治療前比較，AS患者采用英孚利昔單抗治療6周后，血清sLAIR-1水平顯著下降（P=0.000 2），LAIR-1 mRNA水平顯著升高（P=0.001 1）。見圖1、圖2。

圖1 活動期AS患者英孚利昔單抗治療前后血清sLAIR-1的變化

圖2 活動期AS患者英孚利昔單抗治療前后LAIR-1 mRNA的變化

3 討論

LAIR-1屬于免疫抑制性受體家族成員，可調節(jié)免疫系統(tǒng)平衡，防止免疫反應過度可能導致的組織損傷或自身免疫功能紊亂[7]。LAIR-1在大多數免疫細胞中均有表達，包括自然殺傷細胞、T細胞、B細胞、單核細胞和CD34+造血祖細胞[3]，LAIR-1活化已被證明可抑制此類免疫細胞的功能[8]。膠原蛋白是LAIR-1的功能性配體，在體外可直接抑制免疫細胞的激活。此外，LAIR-1還能識別具有膠原蛋白結構的蛋白質，如經典補體途徑成分C1q[9]。LAIR-1交聯(lián)會抑制T細胞受體介導的信號傳遞，B細胞產生IgG、IgE，自然殺傷細胞對靶細胞的裂解[10]。此外，LAIR-1交聯(lián)和C1q刺激還可抑制漿細胞樣樹突狀細胞釋放α干擾素以及單核細胞經TLR9刺激后產生細胞因子[11-12]。在健康人和類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的血漿和尿液中均可檢測到sLAIR-1。OLDE NORDKAMP等[13]的研究結果顯示，RA患者尿液LAIR-1水平顯著高于健康人（P＜0.001），并與炎癥標志物ESR明顯相關。過度表達LAIR-1可降低包括IL-6、IL-8和基質金屬蛋白酶-13在內的炎癥因子的表達[14]。由此可見，LAIR-1在RA中主要發(fā)揮抗炎作用。RA患者CD4+T細胞LAIR-1水平下降，對T細胞激活的抑制不足，促進了自身免疫性疾病的進展[15]。在膠原蛋白的刺激下，CD4+T細胞LAIR-1表達明顯上調，用刺激性LAIR-1單克隆抗體共培養(yǎng)時，CD4+T細胞分泌的IL-2、γ干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）和IL-17水平顯著下降[15]。動物實驗結果表明，用刺激性LAIR-1單克隆抗體治療可減弱LAIR+/+小鼠由膠原蛋白誘發(fā)的關節(jié)炎[15]。本研究結果顯示，AS患者sLAIR-1顯著升高（與RA患者情況相同[16]），LAIR-1 mRNA則顯著下降，并且這2種形式的LAIR-1與炎癥因子均顯著相關，與疾病活動度高度相關，提示sLAIR-1或能作為AS疾病活動度評價的潛在指標。

AS的發(fā)病機制目前尚不清楚，LAIR-1異常表達的原因可能是：（1）LAIR-1調控免疫細胞介導的炎癥反應，可抑制IL-6、IL-17等促炎細胞因子的分泌，而LAIR-1mRNA表達下降可能會導致這種平衡被打破，促進AS發(fā)展；（2）AS特有的炎癥微環(huán)境可顯著改變LAIR-1的表達，異常變化的LAIR-1失去了調控功能，導致免疫失衡加劇。在未來的研究中，建議對AS動物模型給予LAIR-1的阻斷型抗體或重組蛋白，抑制其表達，以驗證其是否可以作為AS的治療靶點。此外，本研究還發(fā)現，AS患者sLAIR-1顯著上調，而LAIR-1 mRNA顯著下降。LAIR-1 mRNA下降可能是由CD4+T細胞、CD8+T細胞和單核細胞等表面LAIR-1表達下調引起，這與先前在多種自身免疫性疾病中的研究結果[17-18]一致。sLAIR-1表達上調雖在RA中也有發(fā)現，但原因尚不清楚，推測可能是因為PBMC中呈游離狀態(tài)的LAIR-1與非游離狀態(tài)的LAIR-1競爭結合型配體，進一步削弱PBMC中非游離狀態(tài)LAIR-1的免疫抑制信號和生物功能，加劇了炎癥反應和免疫失衡。目前尚未見sLAIR-1是否可以同樣發(fā)揮炎癥抑制作用的相關報道。在下階段的研究中，我們將利用LAIR-1刺激體外分離的AS患者的PBMC，分析細胞因子的分泌情況。另外，本研究發(fā)現，活動期AS患者經英孚利昔單抗治療后，sLAIR-1水平顯著下降，趨于正常化，但其中有3例患者治療前后無差異，甚至有所上調。分析這3例患者的臨床資料后發(fā)現，患者治療后疾病活動度并無顯著變化，推測可能是英孚利昔單抗治療的耐受患者。

本研究還有一些不足之處：（1）納入隨訪的病例相對較少，且未追蹤1個完整療程（30周）后LAIR-1的表達情況；（2）未研究AS患者炎癥組織中LAIR-1的表達情況；（3）PBMC中LAIR-1 mRNA下調，但本研究未采用流式細胞術分析各細胞表面LAIR-1的表達情況；（4）未分析17例英孚利昔單抗治療6周后患者LAIR-1表達水平與炎癥指標和臨床指標的相關性；（5）本研究為單中心前瞻性研究，結果尚需多中心大樣本研究加以驗證；（6）受限于治療隨訪數，未分析sLAIR-1是否可作為預測英孚利昔單抗治療反應性的標志物。

綜上所述，LAIR-1水平與AS疾病活動度密切相關，提示其或可作為臨床評估AS患者疾病活動度的輔助指標。本研究也為未來深入研究LAIR-1與AS發(fā)病機制的關系奠定了一定基礎。