手性金屬有機籠MOC-PA作為毛細(xì)管電泳手性固定相

秦該照，唐明華，賴亞琳，袁黎明

（云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,昆明 650500）

構(gòu)成生命體的DNA、氨基酸、糖和蛋白質(zhì)等均具有手性，手性在自然界中無處不在［1，2］.長期以來，藥學(xué)一直都是手性分離的熱點［3］；手性藥物的每一種對映體通常會表現(xiàn)出顯著不同的藥理、代謝、治療或毒理學(xué)作用，對于許多外消旋藥物來說，只有一種對映體具有所需的生物活性，而另一種對映體可能顯示出不同的作用，甚至表現(xiàn)出副作用［4，5］.因此，對映體的分離具有重要研究價值，而色譜技術(shù)是一種分離對映體的有效方法.在過去的幾十年里，色譜技術(shù)［如高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和毛細(xì)管電泳（CE）］被廣泛應(yīng)用于對映體分離中［6～9］.CE（如毛細(xì)管區(qū)電泳、膠束電動色譜和毛細(xì)管電色譜）由于其靈敏度較高、分離效率高及成本低的分離優(yōu)點等［10～18］，成為傳統(tǒng)色譜技術(shù)的有力替代方法.然而，由于所形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)不同，使得毛細(xì)管電泳過程中產(chǎn)生了不同電滲流，最終導(dǎo)致電泳遷移率也不同.

CE是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法，其原理就是分析物在電場中通過產(chǎn)生不同的電滲流從而產(chǎn)生不同的遷移速度進行的分離.如今，隨著高效液相色譜分離手性藥物的興起，CE也被作為一種色譜分離技術(shù)用于手性藥物拆分.CE的分離效率與固定相的選擇性相結(jié)合，在最佳條件下，分析物沿著填充在由電場驅(qū)動的毛細(xì)管中的手性固定相遷移.即，由于CE能改進峰形且電解質(zhì)消耗量低，以及手性固定相選用范圍廣等優(yōu)點，使其在手性化合物的分離分析中具有廣闊前景［19，20］.

金屬有機籠（MOCs）由多個氧化還原活性金屬陽離子中心與配位連接的光活性配體構(gòu)成，因其特有的形狀和空腔及適當(dāng)?shù)募{米尺寸等特點而得到開發(fā)應(yīng)用［20，21］，為發(fā)展色譜分離技術(shù)的手性固定相奠定了基礎(chǔ).作為一種離散類超分子復(fù)合物，它們通常極易溶于有機溶劑中，并且在分子識別、分離、離子交換、氣體吸附、有機和光催化及藥物傳遞等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值［22，23］.近年來，手性MOCs研究已成為超分子化學(xué)和材料科學(xué)中最有吸引力的課題之一［24］.但是，手性MOCs作為固定相應(yīng)用于毛細(xì)管電泳中的研究鮮見報道.

本文制備了一種手性MOC［Cu12（LPA）12（H2O）12］，每個手性MOC-PA籠分子由12個配體分子和12個水分子構(gòu)成，籠分子中包含204個烷基，由它們裝飾著球形籠的整個外表面.每個MOC-PA手性籠分子內(nèi)含6個雙金屬槳輪Cu-Cu結(jié)構(gòu)，且每個Cu—Cu鍵的兩端各連有1個水分子，1個指向多面體的內(nèi)部腔，另1個與其呈180°指向相反方向.在手性MOC-PA作為一種新型的立體選擇性固定相應(yīng)用于毛細(xì)管電泳之前，該材料已經(jīng)被應(yīng)用于氣相色譜中且對手性藥物有較好的拆分效果，并且在大多數(shù)有機溶劑中都有較好的懸浮性.本實驗采用動態(tài)涂覆法，將［Cu12（LPA）12（H2O）12］懸浮在無水乙醇中，然后進行超聲，將懸浮液涂覆在已粗糙化過的石英毛細(xì)管中，通過毛細(xì)管電泳技術(shù)進行分離.研究結(jié)果表明，該材料對手性藥物具有良好的拆分效果.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1，4，5 ，8-萘四羧二酐、乙酸、三水合硝酸銅和硫脲，分析純，上?；S；L-苯丙氨酸，分析純，山東化工廠；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和異丙醇（IPA），分析純，天津化工廠；1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻，分析純，比利時Acros Organics化工廠；硝基苯酚，分析純，上海Aladdin化工廠；生物緩沖劑三羥基氨基甲烷（Tris），分析純，北京化工廠.

所有手性藥物的分離均在CL 1020+CL 101型高效毛細(xì)管電泳儀（CE）上進行，配備的紫外檢測器檢測波長為190～700 nm，北京華陽利民儀器有限公司；D8 Advance型X粉末衍射儀（PXRD），德國Bruker公司；Spectrum100型傅里葉變換紅外光譜儀（FIIR），美國PerkinElmer公司；AV ANCEⅢHD400型核磁共振波譜儀（NMR），德國Bruker公司；Noav NanoSEM450型掃描電子顯微鏡（SEM），美國FEI公司；SDT650型熱重分析儀（TGA），上海云譜儀器有限公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 配體H2LPA的合成參照文獻［25］方法合成配體H2LPA，步驟如Scheme 1所示，將3.0 g（11.2 mmol）1，4，5，8-萘四羧二酐和4.797 g（23.5 mmol）L-苯丙氨酸充分溶解在80 mL乙酸中，所得混合溶液在120℃下回流36 h，反應(yīng)結(jié)束后，加入200 mL超純水，得到棕色沉淀，過濾，用一定量的超純水洗滌濾餅，于80℃下真空干燥，得到淡黃色固體H2LPA.

Scheme 1 Synthesis step of ligand H2LPA

1.2.2 手性金屬有機籠MOC-PA的合成如Scheme 2所示，采取一鍋合成法，將28.1 mg配體H2LPA（0.05 mmol）和12.1 mg三水合硝酸銅分別溶于2 mL DMF和1 mL IPA中，再將它們混合在高壓反應(yīng)釜中，密閉條件下加熱至90℃，反應(yīng)48 h，然后冷卻至室溫，依次用乙醇和高純水洗滌3次，于85℃真空干燥箱中干燥，得到綠色MOC-PA晶體.

Scheme 2 Synthesis step of chiral MOC-PA

1.2.3 手性金屬有機籠MOC-PA毛細(xì)管色譜柱的制備石英毛細(xì)管柱的粗糙化處理：首先用1 mol/L氫氧化鈉沖洗石英毛血管柱1.5 h，再用高純水沖洗至中性，而后用1 mol/L的鹽酸沖洗1.5 h，再用高純水沖至中性，最后用氮氣將毛細(xì)管柱于120℃下吹干，備用.

稱取一定量研磨后的MOC-PA固體懸浮在無水乙醇中，濃度為3 mg/mL，超聲10～20 min.將懸浮液用氮氣緩慢地吹入粗糙化后的毛細(xì)管柱中，待充滿整個毛細(xì)管柱后，再將氮氣的氣流調(diào)小，持續(xù)吹3 h，直至溶液吹干并繼續(xù)對其進行老化，以2℃/min的升溫速度在GC中程序升溫至120℃，保持120 min.

1.2.4 毛細(xì)管色譜柱的實驗條件采用Tris-H3PO4緩沖體系，電滲流標(biāo)記物為硫脲.截取一段手性MOC-PA開管毛細(xì)管色譜柱（60 cm×75 μm），在距末端10 cm處開窗，色譜柱的有效分離長度為50 cm.初次使用該色譜柱前，用高純水、緩沖溶液依次沖洗毛細(xì)管色譜柱直至基線穩(wěn)定.實驗過程中，樣品的紫外檢測波長均為254 nm，進樣時間為5～6 s.

2 結(jié)果與討論

2.1 手性MOC-PA晶體的表征

2.1.1 X射線粉末衍射和紅外光譜采用X射線粉末衍射儀對手性MOC-PA進行了表征，探究其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示.其在2θ=5°～10°處的特征衍射峰與文獻［25］報道基本一致，表明已合成手性MOC-PA.

為了進一步證明已合成手性MOC-PA，對其進行了紅外光譜表征，選用KBr壓片法分別對H2LPA和手性MOC-PA進行測試.如圖2所示，配體H2LPA在766和691 cm-1處的強峰表明有苯上的C—H鍵的彎曲振動；1582和1445 cm-1處的強峰與苯的骨架振動相對應(yīng)；1716和1662 cm-1處的峰分別是由叔酰胺和羧酸的C=O鍵伸縮振動引起.在手性MOC-PA的譜圖中，H2LPA配體中C=O鍵對應(yīng)的峰分別移至1654，1407和1335 cm-1，這可能是由于形成的雙金屬槳輪Cu—Cu鍵與水分子的相互作用.該結(jié)果與文獻［26］報道基本一致.

Fig.1 XRD patterns of chiral MOC-PA crystal powder(a)and the reported one(b)

Fig.2 IR spectra of H2LPA(a)and chiral MOC-PA(b)

2.1.2 熱重分析進行毛細(xì)管電泳測試時，毛細(xì)管色譜柱內(nèi)部兩端會有高達幾千伏甚至幾萬伏的電壓，電流通過管壁時會與緩沖溶液產(chǎn)生大量的焦耳熱.因此，毛細(xì)管電泳的手性固定相必須要有一定的熱穩(wěn)定性.為了考察手性MOC-PA的熱穩(wěn)定性，對其進行了熱重分析.以10℃/min的速率將MOC-PA材料從25℃升溫到800℃，從其熱重曲線圖（圖3）可以看出，手性材料MOC-PA在350℃以前具有一定的熱穩(wěn)定性，從約350℃開始失重，并在450℃時達到最大分解，因此在色譜柱中產(chǎn)生的焦耳熱對其沒有太大的影響.

Fig.4 SEM image of chiral MOC-PA

2.1.3 SEM表征 圖4為MOC-PA的SEM照片，可見該材料由片狀四邊形結(jié)構(gòu)堆疊而成，納米片厚度約為20 nm，長為50～700 nm，寬為60～800 nm.

Fig.5 SEM images of capillary column uncoated(A)and coated(B)chiral MOC-PA

手性MOC-PA固定相是否均勻地涂覆在毛細(xì)管內(nèi)壁是實驗成功的關(guān)鍵之一，因此，對涂覆好的毛細(xì)管色譜柱進行了SEM分析，并與未涂覆的毛細(xì)管柱進行對比.由圖5可見，內(nèi)壁涂覆了一層均勻的手性MOC-PA材料的涂覆柱的毛細(xì)管內(nèi)壁不光滑，而未涂覆的毛細(xì)管柱內(nèi)壁則較光滑.

2.2 手性MOC-PA色譜柱的電滲流

為了測試手性MOC-PA色譜柱的手性識別能力，對其進行了性能探究.首先采用緩沖體系為pH=7.5，濃度為100 mmol/L的流動相探究了電壓與產(chǎn)生的電流之間的關(guān)系，將電壓由6 kV逐步增加到22 kV，以得到的電壓和電流繪制線性圖，發(fā)現(xiàn)二者呈線性關(guān)系，經(jīng)計算R=0.999，說明產(chǎn)生的電流隨著電壓的增加而增大.

另外，對于毛細(xì)管電泳，除了考察電壓與電流的關(guān)系，其手性識別能力與產(chǎn)生的電滲流也有重要關(guān)系.電滲流的大小與手性固定相是否涂覆在毛細(xì)管內(nèi)壁密切相關(guān)，因此需要測試未涂覆毛細(xì)管柱與已涂覆的毛細(xì)管在不同的pH值下所產(chǎn)生電滲流的大小.選用硫脲作為電滲流標(biāo)記物，如圖6所示，在pH=3.5～8.5范圍內(nèi)，分別多次測量空柱與涂覆柱的電滲流，并在曲線中添加相應(yīng)的誤差棒.圖中未涂覆柱產(chǎn)生的電滲流略大于涂覆柱，是因為硅羥基的解離程度不同，未涂覆的毛細(xì)管柱由于內(nèi)壁沒有涂覆物，導(dǎo)致硅羥基解離程度大于涂覆柱，產(chǎn)生的電滲流大于涂覆柱產(chǎn)生的電滲流，表明手性MOC-PA已涂覆在毛細(xì)管內(nèi)壁.

Fig.6 Variation of column electroosmotic flow of chiral MOC-PA chiral column with pH(A)and error bar(B)

2.3 手性MOC-PA色譜柱對位置異構(gòu)體的拆分

首先通過拆分位置異構(gòu)體對手性MOC-PA色譜柱進行性能測試.以電壓為15 kV，pH=7.5，100 mmol/L的Tris-H3PO4緩沖液作為拆分條件，成功拆分了硝基苯酚，說明該手性固定相與硝基苯酚存在相互作用，由于硝基苯酚的分子結(jié)構(gòu)和大小不同，導(dǎo)致與固定相接觸產(chǎn)生的作用力不同，最終使得硝基苯酚達到基線分離.由表1可知，硝基苯酚得到不同程度的分離，硝基苯酚間位和對位的分離度為2.65，間位和鄰位的分離度為9.03，說明手性MOC-PA色譜柱具備良好的分離性能.

Table 1 Resolution of enantiomers on chiral MOC-PA column

2.4 手性MOC-PA色譜柱對手性藥物的拆分

以100 mmol/L Tris-H3PO4緩沖溶液作為流動相，4種手性藥物1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻在手性MOC-PA色譜柱上得到了一定程度的分離，表明該材料具有良好的手性識別能力.實驗中手性MOC-PA作為手性固定相，它是一種具有四面體結(jié)構(gòu)的有機籠狀多孔材料，每個有機籠分子都有手性.電泳分離時，手性藥物與有機籠分子之間可能存在立體構(gòu)型匹配作用、偶極-偶極作用、π-π鍵和氫鍵等作用，當(dāng)手性藥物經(jīng)過毛細(xì)管色譜柱內(nèi)壁時，在諸多作用下手性藥物得到了一定程度的分離.然而，由于手性藥物分離的過程是一個十分復(fù)雜的問題，很難完全闡明手性分離的機理.表2列出了4種手性藥物的遷移時間（tR）、理論塔板數(shù)（N）、分離因子（α）和分離度（Rs）.4種手性藥物的分離條件為15 kV，100 mmol/L，pH=7.5，拆分譜圖如圖7所示.

Table 2 Resolution of chiral drugs on chiral MOC-PA column

Fig.7 Separation spectrograms of chiral drugs on chiral MOC-PA column（A）1，2-Diphenylethylene glycol；（B）Zopiclone；（C）4-methyldiphenylmethanol；（D）Anise.

2.4.1 分離電壓對手性藥物的拆分影響選用濃度為100 mmol/L，pH=7.5的Tris-H3PO4緩沖體系，通過改變分離電壓分別探究了分離1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4種手性藥物的最佳電壓值，結(jié)果如表3所示.

Table 3 Resolution of chiral compounds at different separation voltages

由表3數(shù)據(jù)可知，1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4種手性藥物的最佳分離電壓均為15 kV.由于工作電壓的增加，手性色譜柱內(nèi)的電滲流也隨之增大.當(dāng)電壓從13 kV增加到15 kV，1，2-二苯基乙二醇的分離度從1.35增加至1.39，佐匹克隆的分離度從3.20增加至4.92，4-甲基二苯基甲醇的分離度從1.74增加至1.83，茴香偶姻的分離度從2.00增加至2.10，可見分離度隨著電壓的增加而增大.隨著電壓由15 kV增加到17 kV時，1，2-二苯基乙二醇的分離度從1.39降至1.14，佐匹克隆的分離度從4.92降至3.57，4-甲基二苯基甲醇的分離度從1.83降至1.78，茴香偶姻的分離度也從2.10降至1.52.從出峰時間的長短來看，分離電壓不僅影響手性藥物的分離效率和分離度的大小，而且影響出峰時間，電壓越大，出峰時間越短，表明電壓對毛細(xì)管電泳的分離效果具有重要影響.

2.4.2 緩沖溶液濃度對手性藥物的拆分影響為了探究緩沖溶液的濃度對手性藥物的拆分影響，選用pH=7.5，電壓為15 kV和不同濃度的Tris-H3PO4緩沖溶液體系進行實驗.

如表4所示，緩沖溶液濃度不同時，對手性藥物的分離度也不同.當(dāng)濃度為50 mmol/L時，茴香偶姻沒有得到分離；當(dāng)濃度從50 mmol/L升高到100 mmol/L時，1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分離度隨之增加.但將緩沖溶液濃度從100 mmol/L升高到150 mmol/L時，分離的手性物拆分效果卻有所降低.由此得出100 mmol/L是分離4種手性藥物的最佳緩沖液濃度，其分離度分別為1.39，4.92，1.83和2.10.從出峰時間來看，濃度越高，出峰時間變得越長.緩沖溶液黏度會隨著濃度的增加而增大，導(dǎo)致電滲流減小，分離度和分離因子得以提高.但濃度過高時，反而會降低手性藥物的分離度和分離因子.

Table 4 Resolution of chiral drugs in different buffer solutions

2.4.3 緩沖溶液pH值對手性藥物拆分的影響緩沖溶液pH值對毛細(xì)管的表面特性影響較大，在pH=4～6時，Si—OH基團的電離非常敏感，也影響毛細(xì)管中電滲流的大小.pH值越高，Si—OH基團的電離度越大，甚至趨于飽和，電滲流也隨之變大；pH值降低時，電離受到抑制，電滲流也會降低，甚至趨近于零.由此可知，pH值影響著電滲流和出峰時間，出峰時間隨著pH值的升高而減小，不同pH值對手性藥物的拆分程度也不同.在濃度為100 mmol/L，電壓為15 kV的不同pH值的Tris-H3PO4緩沖體系中進行實驗，篩選最佳的溶液pH值.圖8為4種手性藥物在不同pH值下的拆分譜圖.可見，當(dāng)pH值從6.5增至8.5時，佐匹克隆的分離度降低；當(dāng)pH值從6.5增至7.5時，1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分離度都增大；再將pH值增至8.5時，茴香偶姻的分離度降低，1，2-二苯基乙二醇和4-甲基二苯基甲醇無法被拆分.結(jié)果表明，在pH=6.5時，佐匹克隆的分離度最高；在pH=7.5時，1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的分離度最高.

Fig.8 Electrochromatograms of chiral compounds at different pH values on chiral MOC-PA column（A）1，2-Diphenylethylene glycol；（B）Zopiclone；（C）4-methyldiphenylmethanol；（D）Anise.

2.5 手性MOC-PA毛細(xì)管色譜柱的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性評價

以佐匹克隆為測試物，選用電壓為15 kV，pH=6.5的100 mmol/L的緩沖溶液，考察了手性MOC-PA毛細(xì)管柱的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性.結(jié)果表明，連續(xù)5次進樣，佐匹克隆保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.3%.分別制備了3根毛細(xì)管柱R1，R2和R3，在同樣的色譜條件下進樣，計算出其保留時間的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.4%.以上結(jié)果說明手性MOC-PA柱有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

采用一鍋法分別合成了配體H2LPA和手性MOC-PA，利用手性MOC-PA制備了手性毛細(xì)管電泳柱，考察了其對手性藥物的拆分能力.結(jié)果表明，該柱對1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4種手性藥物和位置異構(gòu)體硝基苯酚具有一定的拆分能力.通過探索1，2-二苯基乙二醇、佐匹克隆、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻4種手性藥物的最佳分離條件，得出1，2-二苯基乙二醇、4-甲基二苯基甲醇和茴香偶姻的最佳分離條件為15 kV，100 mmol/L，pH=7.5；佐匹克隆最佳分離條件為15 kV，100 mmol/L，pH=6.5.它們的分離度（Rs）分別為1.39，11.82，1.83和2.10.綜上所述，手性MOC-PA是一種極具潛力的毛細(xì)管電泳手性固定相，在手性分離領(lǐng)域有較好的發(fā)展前景.