仿生樹葉模型的制作及在瓊脂糖微流控芯片中的應(yīng)用

王方圓，張奮嫻，李毅，高建華，牛顏冰，申少斐

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室,太谷 030801）

近年來，微流控芯片技術(shù)越來越成熟［1～5］，由于其具有分析速度快、成本低和通量高等特點，已成為前沿技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域.微流控芯片更易模擬體內(nèi)的生理環(huán)境［6～9］，在自然環(huán)境中，樹葉的脈序在尺寸［10，11］、形態(tài)［12～14］和功能［15～17］等方面與人體內(nèi)的血管組織類似，用樹葉脈序制得的微流控芯片對研究細胞或細菌行為具有重要意義［18］.

使用自然環(huán)境中的樹葉會受到季節(jié)的限制，若在樹葉掉落之前沒有完成實驗，則實驗的后續(xù)操作會受到阻礙.且每片樹葉脈序的形狀都不一致，制作出來的微流控芯片通道也會因樹葉的不同而改變.因此，制備出仿生樹葉模型具有重要意義，不僅可以解決上述問題，節(jié)約實驗時間，還為實驗的順利進行提供了保障.目前，已有將微流控芯片仿生樹葉模型用于生物分析方面的研究報道［12～16］.Wu等［12，13］采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）構(gòu)建了樹葉型微流控通道，對其生物相容性進行了研究；Mao等［14，15］利用光刻模具制作出PDMS芯片模擬了血管系統(tǒng).然而，目前仿生樹葉模型大多集中在PDMS芯片研究，利用仿生模型構(gòu)建簡單、經(jīng)濟、易操作的瓊脂糖微流控芯片鮮見報道.

本文利用仿生樹葉模板制作的瓊脂糖微流控芯片對大腸桿菌的趨化性進行了研究.建立一級、二級、三級脈序，最大脈序尺寸值可達1038.02 μm，最小脈序尺寸為36.32 μm，寬度不一的通道構(gòu)建為細菌趨化性實驗提供了穩(wěn)定可靠的梯度空間.此外，構(gòu)建瓊脂糖微流控芯片具有巨大優(yōu)勢.由于瓊脂糖通道具有毛細力，瓊脂糖具有親水性，不需要借助外力就可以讓細菌順利地進入瓊脂糖微流控芯片，實現(xiàn)對細菌趨化性的定性檢測，與傳統(tǒng)檢測方法相比，可以更好地對細菌生存的微環(huán)境進行控制.瓊脂糖微流控芯片相較于PDMS微流控芯片顯著降低了微流控芯片的制作成本，提高了效率，可以在不傷害動物體、對環(huán)境無害的前提下，快速準確地進行藥物機理、藥物作用途徑等方面的研究.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

新鮮桑樹葉；75%（體積分數(shù)）乙醇溶液，河北康濟藥械有限公司；RTV615型聚二甲基硅氧烷（PDMS，A膠）和RTV615型PDMS固化劑（B膠），美國Momentive公司；三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；瓊脂，B.R.級，北京索萊寶生物科技有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物，B.R.級，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司.

2X2-2 型真空泵和DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏試驗設(shè)備有限公司）；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；JA2003型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；KW-4型勻膠機（中國科學(xué)院微電子中心研究部）.

1.2 實驗過程

1.2.1 仿生樹葉模型陰膜的制作將采摘的新鮮樹葉置于75%乙醇溶液中煮沸進行消毒處理，取出后用濾紙擦干；按m（A膠）∶m（B膠）=10∶1的比例混合制得PDMS聚合物；將樹葉背面作為陽模，首先將雙面膠粘在玻璃板上，然后將樹葉正面貼在雙面膠帶上，在陽模表面覆蓋一層PDMS聚合物［12，13，16］，置于真空干燥箱中抽真空完全除氣泡20 min，排出氣泡，確?；旌先芤涸诿荛]環(huán)境下聚合形成水凝膠，之后于恒溫恒濕條件干燥，于80℃固化45 min，最后將已經(jīng)固化的仿生樹葉模型陰模從樹葉表面撕掉，得到仿生樹葉模型陰模結(jié)構(gòu).

1.2.2 仿生樹葉模型的制作將1.2.1節(jié)制作的仿生樹葉模型陰模用雙面膠貼在培養(yǎng)皿的內(nèi)部上方，并在陰模的正下方用培養(yǎng)皿承載5滴修飾液體［三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷］，密封培養(yǎng)皿，以上操作均在通風(fēng)櫥內(nèi)完成，并在通風(fēng)櫥內(nèi)靜置5 h，待修飾液完全自然蒸發(fā)，從而在仿生樹葉模型陰模的表面形成一層隔離層；打開培養(yǎng)皿，取下陰模，再次倒入PDMS聚合物，抽真空完全除氣泡20 min后，放入80℃的恒溫箱內(nèi)12 h.修飾物的存在使得前后兩次加入的PDMS相互隔離，有一道明顯的隔離層，揭下即得到仿生樹葉模型結(jié)構(gòu)（圖1）.

1.2.3 PDMS芯片的制作將按m（A膠）∶m（B膠）=20∶1比例混合的PDMS聚合物倒在玻璃板上，置于勻膠機中覆蓋均勻，放入80℃烘箱3～5 min后取出，與仿生樹葉模型陰模結(jié)構(gòu)結(jié)合，使仿生樹葉模型陰模與玻璃板緊緊鍵合，即得到PDMS芯片.

1.2.4 瓊脂糖芯片的制作圖2為微流體芯片設(shè)計圖，芯片主要由加工有微流體通道的瓊脂糖薄層和玻璃基底組成.將融化的瓊脂糖倒在PDMS仿生樹葉模型陽模上，待冷卻凝固后，在揭起瓊脂糖芯片前將通道開口陣列切開［19］；將清洗干凈的瓊脂糖芯片和玻璃基底緊密貼合.

Fig.1 Production process of bionic leaf modela.Natural leaves are pasted on double-sided tape；b.PDMS prepolymer is poured into the glass plate；c.PDMS replica is stripped after curing；d.PDMS is decorated；e.PDMS prepolymer is poured into the culture plate；f.PDMS replica is stripped after curing.

Fig.2 Production process of agarose chipa.Agar is poured;b.PDMS replica stripped after curing;c.the channel opening array is cut;d.agar replicates are bonded to the substrate.

1.2.5 菌液樣品的制備在超凈工作臺中吸取少量菌液加入含液體LB培養(yǎng)基（含氨芐）的EP管中，混合均勻后，再抽取少量菌液均勻地涂布于固體LB培養(yǎng)基（含氨芐）平板上.然后，將接種后的培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，在超凈工作臺中挑選單菌落，將單菌落放入含LB培養(yǎng)基（含氨芐）的EP管中.將挑完單克隆的菌液放入37℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3～4 h后，取出放入4℃冰箱中貯存待用.實驗前，在超凈工作臺中取儲存在EP管中的菌液到含氨芐的LB培養(yǎng)基中，再振蕩培養(yǎng)20 h待用.GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的大腸桿菌（E.coli）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院高建華副教授提供.

1.2.6 大腸桿菌趨化性觀察用瓊脂糖微流控芯片培養(yǎng)并觀察大腸桿菌的運動狀況.將細菌懸液樣品加樣于瓊脂糖微流控芯片的入口處.由于毛細現(xiàn)象［19］，細菌懸液樣品會被動地流入微通道內(nèi).為對大腸桿菌的趨化性進行觀察，可在適當(dāng)時間點在入口處分別滴加PBS緩沖液和含氨芐的LB培養(yǎng)基.

2 結(jié)果與討論

2.1 芯片材質(zhì)的選擇

制作了PDMS微流控芯片和瓊脂糖微流控芯片.通過對比2種材質(zhì)芯片的效果，后續(xù)實驗采用瓊脂糖微流控芯片.原因如下：（1）由于用PDMS制作的仿生樹葉模型尺寸較大，陰模結(jié)構(gòu)靠近中心位置和其它邊緣位置的承重力存在差異，導(dǎo)致陰模結(jié)構(gòu)與玻璃基底上的PDMS聚合物鍵合在一起時，容易出現(xiàn)貼合不均勻的現(xiàn)象，進而在自身重力作用下出現(xiàn)管道塌陷，如圖3所示；而瓊脂糖芯片只與玻璃基底結(jié)合，無其它物質(zhì)堵塞通道結(jié)構(gòu)，且通過后續(xù)用染料和熒光顯微鏡下的觀察驗證了各通道結(jié)構(gòu)均正常存在.（2）PDMS的成本遠高于瓊脂.（3）PDMS微流控芯片的制作時間要比瓊脂糖微流控芯片長很多.瓊脂糖微流控芯片可以實現(xiàn)對細菌趨化性的定性檢測，與傳統(tǒng)檢測方法相比，可以更好地對細菌生存的微環(huán)境進行控制［20］.綜上所述，最終實驗采用瓊脂糖微流控芯片.

Fig.3 PDMS microfluidic chip

2.2 瓊脂糖微流控芯片通道結(jié)構(gòu)的驗證

瓊脂糖是親水性物質(zhì)，所以樣品中的水分可以透過瓊脂糖層，利用這一性質(zhì)可以驗證用仿生樹葉模型制作出來的瓊脂糖微流控芯片各結(jié)構(gòu)通道是否正常存在.將用乙醇制備的藍色染料滴加在瓊脂糖微流控芯片的入口處，幾秒鐘之內(nèi)藍色染料分布于整個結(jié)構(gòu)中，顯現(xiàn)出一個完整樹葉形狀，如圖4所示，表明制得的瓊脂糖微流控芯片各結(jié)構(gòu)通道都正常存在.

Fig.4 Dyed agarose microfluidic chip

Fig.5 Schematic diagram of mulberry leaves and their pulse sequence

植物葉脈指的是葉片表面可見的紋絡(luò)，主要由貫穿在葉片內(nèi)部的維管組織及其周圍的薄壁組織、厚壁組織和厚角組織等組成，葉脈通過葉柄與莖內(nèi)的維管組織相連，起輸導(dǎo)和支持作用［21］.葉脈在葉片上呈現(xiàn)出各種有規(guī)律的脈紋分布，稱為脈序.脈序可分為3類：平行脈、網(wǎng)狀脈和叉狀脈.本文中后續(xù)實驗主要采用桑葉，但對叉狀脈的銀杏葉，平行脈的車前子葉、玉蘭葉，網(wǎng)狀脈的桑樹葉，毛泡桐葉都進行了制作，均可做出仿生樹葉模板.本實驗用到所有葉片主要為網(wǎng)狀脈，網(wǎng)狀脈序作為水分的運輸通道，能夠為葉肉細胞提供持續(xù)穩(wěn)定的水分供給［22～25］，這是因為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為水分輸送提供了多條路徑［26，27］.脈序又分為一級脈序、二級脈序和三級脈（圖5）.實驗結(jié)果表明，本文所構(gòu)建的仿生瓊脂糖微流控芯片具有以上3種脈序.

Fig.6 Distributions of Escherichia coli in various channel structures

此外，將大腸桿菌菌液注入瓊脂糖微流控芯片中，在熒光倒置顯微鏡下觀察了各通道結(jié)構(gòu)（圖6）.并對所構(gòu)建的仿生模型通道尺寸進行統(tǒng)計，一級脈序1條，尺寸最大值為1038.02 μm；二級脈序8條，尺寸最大值為335.07 μm，尺寸最小值為97.08 μm，大部分二級脈序的尺寸在200～280 μm之間；三級脈序76條，尺寸最大值為114.88 μm，尺寸最小值為36.32 μm，大部分三級脈序的尺寸在50～100 μm之間.所構(gòu)建的仿生模型通道寬度不一，更接近于人體的真實環(huán)境，大腸桿菌能夠順利進入各級脈序，產(chǎn)生梯度的分布.這些現(xiàn)象證明已構(gòu)建出仿生樹葉的瓊脂糖微流控芯片，為后續(xù)研究大腸桿菌的趨化性奠定了基礎(chǔ).

2.3 大腸桿菌的趨化性

在自然環(huán)境中，適合細菌生長繁殖的場所都有一定的離子濃度和營養(yǎng)成分，細菌能夠感受周圍環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，并沿著化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度定向運動，這種性質(zhì)稱為趨化性［28］.為驗證所構(gòu)建的仿生樹葉模型制作出的瓊脂糖微流控芯片可以用于研究大腸桿菌的趨利性，設(shè)置了蒸餾水和培養(yǎng)液兩種不同生存環(huán)境的對照組.因芯片中的各結(jié)構(gòu)通道高度、寬度不一，所以當(dāng)把菌液滴在入口處時會出現(xiàn)毛細現(xiàn)象，將菌液吸入.由于毛細現(xiàn)象，所用大腸桿菌分布于各通道中，會優(yōu)先向生存空間充足的地方移動，即菌液會即刻把一級脈序、二級脈序充滿，之后再從二級脈序緩慢地移向三級脈序.芯片的入口只有一級脈序，細菌樣品首先接觸到一級脈序，接著在毛細現(xiàn)象的作用下逐漸接觸到其它脈序.從視頻S1（見本文支持信息）可以看出，若在入口處滴加幾滴PBS緩沖溶液，毛細現(xiàn)象會使PBS緩沖溶液被吸入通道中，PBS緩沖溶液與菌液之間具有一段空結(jié)構(gòu)通道，形成一段壓力柱，大腸桿菌會加快向原方向移動速度，且一段時間后也并未向入口處移動［圖7（A）和（B）］.

Fig.7 Movement of bacterial solution away from the inlet every 5 s in the channel structures after adding bacterial solution(A)or PBS solution(B)at the inlet and the movement of bacterial solution near the inlet every 5 s in the structural channel after adding the culture solution at the inlet(C)

圖7（C）所示為相同條件下，把菌液（1.5×108個/mL）滴在入口處，所用大腸桿菌分布于各通道中，此時在入口處滴加一滴含氨芐的LB培養(yǎng)液，大腸桿菌則會向相反方向移動，即向滴加培養(yǎng)液的入口處方向移動，視頻S2（見本文支持信息）可以印證這一現(xiàn)象.對各種溶液進入芯片后的移動距離進行了統(tǒng)計，若規(guī)定遠離入口處的方向為正向，加入菌液后15 s正向移動了6.95×102μm，加入PBS緩沖溶液后15 s正向移動了7.03×102μm，加入營養(yǎng)液后15 s反向移動了1.39×103μm.以上結(jié)果說明，在周圍生活環(huán)境所提供營養(yǎng)物質(zhì)相同時，大腸桿菌會順著所受外界力的方向移動，但是如果有更好的生活環(huán)境，大腸桿菌受到的外界力會遠小于大腸桿菌向更好生活環(huán)境移動的力.大腸桿菌的運動性包括游動和群集運動，它們受鞭毛的逆時針旋轉(zhuǎn)和順時針旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)，通常使用復(fù)雜的趨化信號系統(tǒng)來指導(dǎo)它們的運動.相關(guān)蛋白協(xié)調(diào)合作，相互影響，感知環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)濃度的變化，并將這些化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)信號，控制相關(guān)蛋白的表達，進而控制鞭毛運動，促進大腸桿菌向更好的生活環(huán)境移動.

3 結(jié)論

利用PDMS和三氯硅烷的特性制作了仿生樹葉模板，并進一步構(gòu)建了可進行細菌培養(yǎng)和觀察的瓊脂糖微流控芯片.仿生樹葉模板的制作使實驗的進行不受季節(jié)限制，可節(jié)約成本，保護環(huán)境.最重要的是由于脈序的高度、寬度、長度不一，為細菌趨化性實驗提供了穩(wěn)定可靠的梯度空間，對探索藥物篩選、微生物利害等研究具有重要意義.此外，瓊脂糖微流控芯片平臺的建立有利于對細菌的培養(yǎng)和觀察，植物和動物的內(nèi)部運輸通道雖然大相徑庭，但是在血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)方面非常相似，在一定程度上可以模擬血管的相關(guān)生理學(xué)特性，用于研究多種血細胞相互作用的機制和多種藥物對心肌細胞影響等.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220445.