青錢柳葉片總黃酮含量測定及代謝組學(xué)分析

肖藝欣，朱錦懋，陳由強(qiáng)，陳建楠

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；福建師范大學(xué)南方海洋研究院，福建 福州 350117 )

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)，又名青錢李、山麻柳、山化樹等，是胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya)的喬木，在安徽、浙江、福建、湖南等地較常見[1]．青錢柳葉為奇數(shù)羽狀復(fù)葉，呈長橢圓狀卵形，常被曬干制成茶，其水提物對降血糖有較顯著的作用[2-3]．將青錢柳葉磨成細(xì)粉與茶葉混配，不僅在降血糖方面的功效倍增，還能改善人體的耐糖量，具有養(yǎng)生功效[4]．近年來，青錢柳的天然保健功能逐漸受到人們重視，葉片中的黃酮類化合物作為主要藥用成分之一，在抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)腸道菌群以及抗炎等方面發(fā)揮一定的作用[5-10]．

黃酮類化合物是一類自然界中廣泛存在的多酚類物質(zhì)．按照母核結(jié)構(gòu)的不同，主要有黃酮、黃酮醇及其苷、二氫黃酮及其苷、二氫黃酮醇及其苷、黃烷類化合物、花青素類化合物、查爾酮、二氫查爾酮、橙酮類化合物以及雙黃酮類化合物[11]．常用的提取方法有超聲輔助提取、酶輔助提取、溶劑提取等[12-15]．總黃酮含量的常用檢測方法為紫外分光光度法，該種方法簡單且高效．為了進(jìn)一步確定其具體化學(xué)成分，可將粗提后的提取液進(jìn)行分離純化，采用高效液相色譜、超高效液相法、核磁共振法鑒定分析[16-19]．

福建安溪桃舟的土壤適宜青錢柳生長，青錢柳樹葉含有豐富的皂苷、黃酮等代謝物成分，能有效降低血糖．代謝物是生物體表型的基礎(chǔ)，其能更直觀、有效地了解生物學(xué)過程及其機(jī)理[19]．由于產(chǎn)地環(huán)境不同，青錢柳生理進(jìn)程存在差異，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的種類與含量發(fā)生變化，適宜采收的時期也有所不同．例如，湖南江華和江西廬山的最佳采收期為7月，而浙江是4—5月[20-21]．本研究檢測福建安溪青錢柳采摘季(4—11月)葉片總黃酮的含量，分析不同月份青錢柳葉片總黃酮含量的變化趨勢，旨在為該地區(qū)以黃酮為指標(biāo)的青錢柳相關(guān)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)．10月為安溪采摘青錢柳的月份，以10月不同生長階段的葉片為研究對象，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)檢測，比較該月份老葉(10M-OL)、中葉(10M-ML)和嫩葉(10M-YL)黃酮類代謝物的差異，為進(jìn)一步開發(fā)和生產(chǎn)青錢柳相關(guān)產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)．該方法對設(shè)備要求簡單，操作簡便且易于推廣普及．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青錢柳樣本取自福建泉州市安溪縣桃舟鄉(xiāng)(E117°45′42′，N25°22′48′)，該地屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，年平均降水量1 840 mm．采樣時間為2021年4—11月，在樣地選取4～6株植株高度一致且株型相似的植株，每株分別采摘100～300片中葉(長度為5～10 cm)混合為實驗樣本．2021年10月選取4～6株植株高度一致且株型大小相似的植株，每株分別采摘老葉(葉片長度大于10 cm)、中葉(葉片長度為5～10 cm)、嫩葉(葉片長度小于5 cm)各100～300片作為實驗樣品．樣品采集后放入自封袋，帶回實驗室于-80 ℃冰箱保存，待后續(xù)實驗使用．4—11月中葉樣品及10月老葉、中葉、嫩葉樣品1式3份作為生物學(xué)重復(fù)．

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；無水乙醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；硝酸鋁(分析純，西隴化工股份有限公司)；醋酸鉀(分析純，西隴化工股份有限公司)；甲醇(色譜純，美國Merck公司)；乙腈(色譜純，美國Merck公司)．

1.2.2 主要儀器

多功能微孔板檢測儀(Infinite 200 pro,TECAN上海貿(mào)易有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(LGJ-10,北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；全自動樣品快速研磨儀(JXFSTPRP-64,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE,昆山市超聲儀器有限公司)；超高效液相色譜(Nexera X2,日本SHIMADZU公司)；串聯(lián)質(zhì)譜(4500 QTRAP，美國Applied Biosystems公司); 奧豪斯電子天平(CP114,奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司)．

1.3 實驗方法

葉片中總黃酮含量的檢測主要參考中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T4592-2016出口食品中總黃酮的測定》．

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

稱取0.050 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液．稱取17.600 g九水合硝酸鋁，用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶，得到硝酸鋁溶液．稱取9.814 g醋酸鉀，蒸餾水溶解，并定容于100 mL容量瓶，得到醋酸鉀溶液．

從蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶，分別加入14.0、13.0、12.0、11.0、10.0 mL無水乙醇使容量瓶內(nèi)的液體體積補(bǔ)充至15.0 mL．再依次向各個容量瓶中加入1.0 mL硝酸鋁溶液、1.0 mL醋酸鉀溶液，最后蒸餾水定容至50.0 mL．室溫靜置1 h后，在波長420 nm下測定吸光度值．

1.3.2 總黃酮測定的樣品處理

將各月份的青錢柳中葉置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，稱取1.500 g凍干樣品，采用全自動樣品快速研磨儀粉碎．粉碎后的樣品置于100 mL錐形瓶，加入30.0 mL無水乙醇，40 ℃，以50%功率超聲1 h，每20 min搖晃均勻一次．超聲完畢將濾液回收過濾至50 mL容量瓶，無水乙醇定容．

從定容后的液體中移取1.0 mL于50 mL容量瓶，加入14.0 mL無水乙醇將容量瓶內(nèi)的液體補(bǔ)充至15.0 mL，樣品溶液測定步驟參照1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線測定．

1.3.3 UPLC-MS/MS的樣品處理

將10月青錢柳老葉(10M-OL)、中葉(10M-ML)和嫩葉(10M-YL)分為3組，每組樣品為3個生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行代謝研究．樣品置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，研磨儀研磨至粉末狀.稱取0.100 g粉末，溶解于1.2 mL體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇提取液中，每30 min渦旋一次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，樣本置于4 ℃冰箱過夜，離心取上清液，用微孔濾膜過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中.每個月份樣本3個生物學(xué)重復(fù)，用于UPLC-MS/MS分析．

1.3.4 UPLC-MS/MS的檢測條件

采集檢測儀器主要為超高效液相色譜(UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)．主要液相條件如下：色譜柱Agilent SB-C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱箱溫度40 ℃；進(jìn)樣體積為4 μL；流動相A為超純水(體積分?jǐn)?shù)0.1%色譜級甲酸)，B為乙腈(體積分?jǐn)?shù)0.1%色譜級甲酸)，流速0.35 mL·min-1．梯度洗脫：0～9 min，95%A；9～10 min，5%A；10～11 min，95%A；11～14 min，5%A．

主要質(zhì)譜條件如下：正、負(fù)離子模式；離子噴霧電壓(IS)分別設(shè)置為正離子模式5 500 V，負(fù)離子模式-4 500 V；離子源，渦輪噴霧電離；溫度550 ℃；離子源氣體I(GSI)、氣體Ⅱ(GSII)和簾氣(CUR)分別設(shè)置為344.750、413.700、172.375 kPa．

1.4 數(shù)據(jù)處理

總黃酮含量數(shù)據(jù)采用Excel作圖，以SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析，通過Duncan法進(jìn)行多重比較.代謝組數(shù)據(jù)利用Analyst 1.6.3軟件處理．采用TBtools、Origin2021、GraphPad Prism9.0作圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以50.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中蘆丁的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，測得回歸方程為y=0.382x+0.028，r2=0.999，計算樣品中的總黃酮提取率．

2.2 青錢柳葉片中總黃酮含量及變化規(guī)律

2021年4—11月，青錢柳葉片總黃酮含量最高為4月(11.84 mg·g-1)，最低為5月(6.95 mg·g-1)，含量表現(xiàn)出降低-增加-降低的雙峰特征，具體變化趨勢見圖1．由圖1可知，5—6月，總黃酮含量相較于其他幾個月更低，次生代謝物的積累較少，該時期多雨，對代謝物積累產(chǎn)生影響．7—10月，正屬于青錢柳的成熟結(jié)果期，在氣候適宜的福建，黃酮次生代謝物的積累相對較多，因此對7—10月的青錢柳葉片做進(jìn)一步研究更有意義．

圖1 不同月份青錢柳葉片總黃酮含量的變化趨勢

對4—11月總黃酮含量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示P=0.109 > 0.05，說明該方差為齊性．因此采用Duncan多重比較法，對8個不同月份的青錢柳葉片總黃酮含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2．由圖2可知，4月與6、9、10月無顯著差異，但是與8、11月差異顯著(P<0.05)，且與5月差異極顯著(P< 0.01)．5月與7月差異顯著(P<0.05)．結(jié)合多重比較分析，結(jié)果表明，4、7、10月為適宜采摘青錢柳葉片的時間．

*為差異顯著(P<0.05)，**為差異極顯著(P<0.01)

2.3 UPLC-MS/MS檢測結(jié)果

基于UPLC-MS/MS檢測平臺和自建數(shù)據(jù)庫，共檢測到10月老、中、嫩葉中751個代謝物，其中，物質(zhì)一級分類為黃酮類的代謝物有144個．對主要代謝物進(jìn)行定性和定量分析，老葉中含量排名前五的代謝物多集中于黃酮、黃酮醇這2類代謝產(chǎn)物；中葉多集中于花青素、黃酮、黃酮醇這3類代謝產(chǎn)物；嫩葉多集中于黃酮醇、黃酮這2類代謝產(chǎn)物．具體代謝物類型及比例見表1．不同生長階段葉片中均含有黃酮、黃酮醇這2類代謝產(chǎn)物；與嫩葉、老葉相比，中葉含有花青素類代謝產(chǎn)物．老葉的黃酮化合物總體含量較高；中葉的花青素化合物總體含量較高；嫩葉的黃酮化合物總體含量較高．其中，山奈酚、矢車菊素這2類代謝物在老、中、嫩葉中含量均較多．

表1 不同葉齡中含量排名前五的黃酮類代謝物

2.3.1 主成分分析

對質(zhì)控后的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)，將原始數(shù)據(jù)投射到新的坐標(biāo)系統(tǒng)中，第一主成分為第一坐標(biāo)軸，第二主成分為第二坐標(biāo)軸.第一主成分代表在原始數(shù)據(jù)中各變量經(jīng)過變換得到的新變量的變化區(qū)間；第二主成分代表在原始數(shù)據(jù)中各變量經(jīng)過變換得到的第二個變量的變化區(qū)間，PCA得分圖如圖3．在PCA得分圖中，葉片3個不同生長階段能夠明顯區(qū)分，即同一個生長階段的代謝產(chǎn)物生物學(xué)重復(fù)存在一定的相似性，而老葉、中葉、嫩葉這3個生長階段之間分為不同聚類，存在明顯的離散分組現(xiàn)象，表明3個組之間代謝物存在顯著差異(濃度、數(shù)量、種類等)．mix為質(zhì)控樣本，質(zhì)控樣本聚集在一起，表明檢測過程穩(wěn)定性好，數(shù)據(jù)可靠．

10M-OL：老葉；10M-ML：中葉；10M-YL：嫩葉；mix：質(zhì)控樣本

2.3.2 聚類分析

對代謝物在不同樣本間的積累模式進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖4．由圖4可知，各階段的3個生物學(xué)重復(fù)之間代謝物的差異不大，但3個不同階段組分之間的代謝物存在差異．嫩葉中的代謝物種類主要集中在黃酮醇、黃酮、橙黃酮、二氫黃酮等；老葉中的代謝物種類主要集中在查爾酮、橙黃酮、黃酮、黃酮醇等；中葉中的代謝物種類主要集中在二氫黃酮、異黃酮、花青素、黃酮碳糖苷等．

不同顏色為相對含量標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的數(shù)值(紅色代表高含量，藍(lán)色代表低含量)；橫軸為分組名，縱軸為代謝物名稱

2.3.3 差異代謝物篩選

將老葉、中葉與嫩葉3個組分的黃酮類代謝物進(jìn)行兩兩組間差異篩選，選取fold change ≥ 2和fold change ≤ 0.5，OPLS-DA模型的VIP(variable importance in projection)值大于等于1的代謝物．篩選結(jié)果顯示中葉/老葉組篩選到54種差異代謝物：其中22種上調(diào)，即在老葉中相對含量較高，主要代謝產(chǎn)物類型為黃酮(11種)、黃酮醇(6種)；另外32種代謝物表現(xiàn)為下調(diào)，即在中葉中相對含量較高，主要代謝產(chǎn)物類型為黃酮(17種)、黃酮醇類(10種)．

嫩葉/中葉組篩選到50種差異代謝物:其中22種上調(diào)，即在中葉中相對含量較高，主要代謝產(chǎn)物類型為黃酮(16種)、黃酮醇(10種)；另外28種代謝物表現(xiàn)為下調(diào)，即在嫩葉中相對含量較高．主要代謝產(chǎn)物類型為黃酮(17種)、黃酮醇(15種)．

嫩葉/老葉組篩選到68個差異代謝物:其中29種上調(diào)，即在老葉中相對含量較高，主要代謝產(chǎn)物類型為黃酮(16種)、黃酮醇(10種)；另外39種代謝物表現(xiàn)為下調(diào)，即在嫩葉中相對含量較高，主要代謝產(chǎn)物類型為黃酮(17種)、黃酮醇(15種).具體分布情況見圖5和圖6．

10M-ML/10M-OL：中葉/老葉組；10M-YL/10M-ML：嫩葉/中葉組；10M-YL/10M-OL：嫩葉/老葉組

(a)10M-ML/10M-OL中葉/老葉組;(b)10M-YL/10M-ML嫩葉/中葉組;(c)10M-YL/10M-OL嫩葉/老葉組不同顏色為相對含量標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的數(shù)值(紅色代表高含量，藍(lán)色代表低含量)；橫軸為分組名，縱軸為代謝物名稱

通過韋恩圖的形式，展示各組差異代謝物之間的關(guān)系．圖7每個圈代表一個比較組，圈和圈重疊部分的數(shù)字代表比較組之間共有的差異代謝物個數(shù)，沒有重疊部分的數(shù)字代表比較組特有的差異代謝物個數(shù)．韋恩圖表明，與嫩葉、中葉的差異代謝物相比，老葉特有的差異代謝物較多．其中，3個不同生長階段葉片共有的差異代謝物有12種，嫩葉/老葉組、中葉/老葉組、嫩葉/中葉組分別有68、54、50種差異代謝物．

10M-ML/10M-OL：中葉/老葉組；10M-YL/10M-ML：嫩葉/中葉組；10M-YL/10M-OL：嫩葉/老葉組

KEGG數(shù)據(jù)庫有助于將基因、表達(dá)信息以及代謝物含量作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究，將3個生長階段檢測到的差異代謝物進(jìn)行KEGG富集，結(jié)果如圖8．中葉/老葉組內(nèi)的54種差異代謝物在黃酮和黃酮醇生物合成途徑顯著富集；嫩葉/中葉組內(nèi)的50種差異代謝物在類黃酮生物合成途徑顯著富集；嫩葉/老葉組內(nèi)的68種差異代謝物在黃酮和黃酮醇生物合成途徑顯著富集．

(a)中葉/老葉組；(b)嫩葉/中葉組；(c)嫩葉/老葉組

3 討論與結(jié)論

青錢柳葉片中含有許多化學(xué)成分，由青錢柳葉制成的茶葉，黃酮類成分含量較高，有很好的保健療效，因此存在較高的開發(fā)價值．黃酮類化合物的合成受到許多酶的調(diào)控，如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、黃酮合成酶(FLS)等[22]．除此之外，環(huán)境因子，例如光照、水分、礦物質(zhì)和溫度等，均影響著黃酮類化合物的合成[23]．植物處于不同地區(qū)或同一地區(qū)不同海拔，體內(nèi)總黃酮含量存在差異；同一植株的不同營養(yǎng)器官總黃酮含量也存在差異[24-25]．黃酮的積累還受氮源的影響，氮源影響初級代謝和次級代謝之間的碳流分配而進(jìn)一步影響黃酮類化合物的生物合成，高氮施肥會減少植物體內(nèi)類黃酮的積累[26-27]．

黃酮含量的季節(jié)性變化也是其受外界氣候影響的表現(xiàn)之一，根據(jù)不同的采摘時間和采摘葉齡可以提高葉片的利用率．本實驗中，不同月份之間總黃酮含量也表現(xiàn)出差異性．4月青錢柳總黃酮含量最高，此時福建正處于春季，為青錢柳的生長期，當(dāng)月溫度適宜且雨水充足，有利于植物體內(nèi)的各種酶作用使次生代謝物得到積累．Duncan多重比較結(jié)果表明，4月與5月之間總黃酮含量差異極顯著(P<0.01)，且與8、11月差異顯著(P<0.05)，但與6、9、10月無顯著差異．總黃酮含量變化總體呈現(xiàn)降低-增加-降低的趨勢．波動范圍較大的原因可能為當(dāng)?shù)貧鉁刈兓^大，且總黃酮含量低的月份處于雨季，高溫悶熱且潮濕的梅雨天氣不利于次生代謝物積累．若以總黃酮為采收指標(biāo)，4、7、10月可作為青錢柳葉片采收月份．

本研究結(jié)果表明，不同生長階段的葉片中，黃酮類代謝物成分差異顯著．將各組分間的差異代謝物表達(dá)情況進(jìn)行對比，結(jié)果表明各組差異代謝物下調(diào)表達(dá)居多．總體來看，大多數(shù)代謝物在老葉的表達(dá)水平高于嫩葉和中葉，在中葉的表達(dá)水平高于嫩葉．分析各組差異代謝物發(fā)現(xiàn)，老葉具有特征性的代謝物為山奈酚-3-O-(4″-O-對香豆酰)鼠李糖苷和山奈酚-3-O-(3″-O-對香豆酰)鼠李糖苷等山奈酚糖苷類物質(zhì)；中葉中，具有特征性的代謝物為矢車菊素-3-O-半乳糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等矢車菊素糖苷類物質(zhì)；嫩葉中，特征代謝物主要集中在槲皮素-3-O-木糖苷和槲皮素-3-O-新橘皮糖苷等槲皮素糖苷類物質(zhì)中．

根據(jù)KEGG富集圖(圖8)可知，老葉被注釋的差異代謝物數(shù)量居多，且多富集在黃酮和黃酮醇生物合成途徑，其中包含山奈酚在內(nèi)的物質(zhì)合成途徑是老葉特有的代謝物合成途徑．山奈酚被報道具有廣泛的生物學(xué)活性，如清除自由基、抗炎、免疫抑制、抗病毒、抗腫瘤等作用[28-29]，在治療癌癥、抗氧化等醫(yī)療方面和保健方面都有一定功效．因此，青錢柳葉黃酮類成分的開發(fā)無疑為天然藥物市場提供了廣闊的前景．本研究結(jié)果為青錢柳相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供初步的理論指導(dǎo)，后期將進(jìn)一步收集多年多點(diǎn)的數(shù)據(jù)，以進(jìn)一步明確環(huán)境因素對上述差異性產(chǎn)生的影響．